专利名称：检测脑心肌炎病毒抗体的酶联免疫试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶联免疫试剂盒，特别涉及一种能够检测脑心肌炎病毒抗体的酶 联免疫试剂盒，本发明还涉及这种酶联免疫试剂盒在检测人和动物脑心肌炎病毒抗体中的应用。
背景技术：
脑心肌炎病毒(EMCV)是一种重要的人畜共患病病原，是可以引起猪和某些哺乳 动物、啮齿动物乃至灵长类动物的一种以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征的急性传 染病。EMCV感染可引起仔猪致死性心肌炎，造成急性死亡，死亡率最高可达100%、可导致怀 孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎；该病在全世界广泛流行，给养猪业造成了较大的经济 损失；它除了感染动物外，人体内也已检测到；此外，EMCV还以亚临床感染的形式存在。所 以作好该病的诊断及预防极为重要。酶联免疫法操作简便、快速，因而成为临床免疫检验中的主导技术。现有的用酶联 免疫法检测EMCV抗体的方法只有间接酶联免疫法，其操作步骤为
(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原洗涤除去未结合的抗原及杂质。 (2)加稀释的受检血清其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤 后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在 洗涤过程中被洗去。(3)加酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地 标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。(4)加底物显色颜色深度 代表标本中受检抗体的量。在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题
(1)专属性太强，应用不广泛现有的试剂盒只能检测单一种属动物或人；
(2)灵敏度与特异性不高；
(3)假阳性多，准确性不高。
发明内容
本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种能通用检测人和动 物、灵敏度高、特异性强、准确性高的检测EMCV抗体的酶联免疫试剂盒；为此，本发明还提 供该试剂盒在检测人和动物EMCV抗体中的应用。本发明提供一种利用双抗原夹心法来检测人和动物EMCV抗体的酶联免疫试剂 盒，该试剂盒的实验原理是
(1)将特异性抗原与固相载体结合，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质；
(2)加受检标本，使之与固相抗原接触反应一段时间，让标本中的抗体与固相载体上的 抗原结合，形成固相抗体复合物，洗涤除去其他未结合的物质；(3)加酶标抗原使固相抗 体复合物上的抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标抗原，此时固相载体上带有的 酶量与标本中受检物质的量正相关；(4)加底物夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗体的定性或定量。为了实现上述目的本发明采取的技术方案是
提供一种检测EMCV抗体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括包被EMCV重组抗原的酶标 板、酶标记的EMCV抗原工作液、EMCV抗体阳性对照、EMCV抗体阴性对照、洗液、显色剂A、显 色剂B和终止液。其中所述EMCV重组抗原的蛋白浓度为300ng/ml 60 μ g/ml，是由相同蛋白浓度 的EMCV-VPl重组蛋白、EMCV-VP2重组蛋白和EMCV-2C重组蛋白组成。优选地，EMCV重组抗原的蛋白浓度为30 μ g/ml。所述包被EMCV重组抗原的酶标板的制备包括封闭包被的EMCV重组抗原步骤，所 述封闭包被的EMCV重组抗原步骤中所用封闭材料为含5g/L的鱼蛋白胨、100g/L蔗糖，pH 值为7. 2 7. 8的磷酸盐缓冲液或含100g/L马血清、100g/L蔗糖，pH值为7. 2 7. 8的 磷酸盐缓冲液。酶标记的EMCV抗原工作液是按照以下步骤制备的
1).酶的活化将5mg酶溶于Iml纯化水中，加入0.06mol/L过碘酸钠溶液0. 5ml，冰 浴避光搅拌30分钟，加入0. 16mol/L乙二醇0. 5ml，冰浴避光搅拌30分钟，2_8°C保存；
2).酶标记EMCV抗原的制备用0.2mol/L碳酸盐缓冲液将活化后的酶的pH调至 9. 0-9. 5，加入5mgEMCV抗原，冰浴避光搅拌30分钟，置0. 05mol/L，pH9. 5碳酸盐缓冲液溶 液中透析，2-8°C透析10_14h，加入5mg/ml硼氢化钠溶液0. aiil，冰浴避光搅拌60分钟，加 入等体积饱和度为50%的硫酸铵溶液，2-8°C静置30分钟后，以3000转/分钟的速度离心 20分钟，所得沉淀用磷酸盐缓冲液溶解后，Sepharose-4FF柱层析，收集第一峰，加入体积 百分数50%中性甘油，-20°C _30°C保存；
3).将酶标记EMCV抗原与酶稀释液按体积比1:200 1:800混合。其中，酶标记的EMCV抗原工作液中的酶为辣根过氧化物酶。所述酶标记EMCV抗原的制备步骤中EMCV抗原是先灭活再用酶标记的。优选地，酶标记EMCV抗原与酶稀释液的体积比为1:400。本发明还提供上述试剂盒在检测人和动物EMCV抗体中的应用。试剂盒在检测人和动物EMCV抗体中应用的具体步骤为
a.取出包被EMCV重组抗原的酶标板，在孔中分别加待测样品、阴性对照、阳性对照各 100 μ L，充分混勻，封板，封板后将酶标板置37°C水浴中反应40分钟；
b.弃去各孔内液体，用稀释20倍后的洗液冲洗，拍干；
c.加入酶标记EMCV抗原工作液100μ L，封板，置37°C反应30分钟；
d.弃去各孔内液体，用稀释20倍后的洗液冲洗，拍干；
e.每孔按顺序分别加入显色剂A、显色剂B各50μ L，置37°C显色15分钟；
f.每孔加终止液50μ L，测定各孔OD值。本发明提出的检测脑心肌炎病毒抗体的酶联免疫试剂盒不受种属差异的限制， 能够通用检测人和动物的脑心肌炎病毒抗体；试剂盒对内部参考品阴阳性进行检测，合格 率为100%，因此试剂盒的灵敏度高、特异性强；试剂盒加热后，对内部参考品阴阳性进行测 定，其合格率为100%，因此试剂盒具有很好的热稳定性；通过对人血清和猪血清进行检测， 99.6%以上能直接判断出阴阳性，具有很好的实用效果。而且本试剂盒操作简单，检测成本低，检测时间短，1. 5个小时即可完成检测操作，适用于大批量检测脑心肌炎病毒抗体。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的主要试剂
1.叙利亚地鼠肾传代细胞(BHK-21细胞)购自甘肃省动物细胞工程技术研究中心；
2.脑心肌炎病毒抗原(未灭活)、兔抗脑心肌炎病毒血清、脑心肌炎病毒VPl重组蛋白 (EMCV-VPl)、脑心肌炎病毒VP2重组蛋白(EMCV-VP2)由西北民族大学生物工程与技术国家 民委重点实验室提供；
3.脑心肌炎病毒2C重组蛋白(EMCV-2C)由深圳菲鹏生物股份有限公司提供；
4.马血清、新生小牛血清由中美合资兰州民海生物工程有限公司提供；
5.辣根过氧化物酶(HRP)、四甲基联苯胺(TMB)购自Sigma公司；
6.Sepharose-4FF, NaIO4, NaBH4等试剂均购自兰州鹏程生物技术有限公司；
7.酶标板(96孔)购自厦门云鹏公司；
8.DMEM培养液购自美国GIBCO公司；
9.未免疫兔细胞由兰州大学医学部提供；
10.未免疫猪细胞购自黄泥湾猪场；
11.酶稀释液含质量浓度21的聚乙二醇、0.05%的硫柳汞钠、pH值为6. 8 8. 0的磷 酸盐缓冲液。下述实施例中的主要仪器设备
(1)酶标定量测定仪购自美国热电型号MK3;
(2)酶标洗板机购自北京天石型号ZMX-988B ；
(3)隔水式电热恒温培养箱购自上海跃进医疗器械；
(4)微型混和器购自江苏南通无线电仪器厂；
(5)二氧化碳气体培养箱 购自美国Thermo Fisher型号3111型；
(6)研究级荧光倒置显微镜购自Olympus 型号1X71型。实施例1
一、配制检测EMCV抗体的酶联免疫试剂盒
(1)包被EMCV重组抗原的酶标板；
(2)酶标记EMCV抗原工作液；
(3)EMCV抗体阳性对照；
(4)EMCV抗体阴性对照；
(5)洗液；
(6)显色剂A;
(7)显色剂B;
(8)终止液。(一)包被EMCV重组抗原的酶标板的制备
(1) EMCV重组抗原的制备将EMCV-VPl重组蛋白、EMCV-VP2重组蛋白、EMCV-2C重组 蛋白相同蛋白浓度混合；(2)包被EMCV重组抗原用pH值9.6,0. 05M的碳酸钠缓冲液将EMCV重组抗原蛋白浓 度稀释至30μ g/ml，按100μ L /孔加入酶标板的微孔中，放置吸附、甩干；
(3)封闭包被的EMCV重组抗原用含5g/L鱼蛋白胨、100g/L蔗糖，pH值为7.5的磷酸 钠缓冲液，按150 μ L /孔封闭、甩干；
(4)干燥置37°C干燥后，装入含干燥剂的包装袋中密封5°C保存。(二)酶标记EMCV抗原工作液的制备
a.辣根过氧化物酶的活化将5mg辣根过氧化物酶溶于Iml纯化水中，加入0. 06mol/ L过碘酸钠溶液0. 5ml，冰浴避光轻轻搅拌30分钟，加入0. 16mol/L乙二醇0. 5ml，冰浴避光 轻轻搅拌30min，2°C保存；
b.酶标记EMCV抗原的制备
将EMCV抗原于56°C灭活半小时，用0. 2mol/L碳酸钾缓冲液将步骤a中得到活化后的 辣根过氧化物酶的PH值调至9. 0，加入5mg灭活后的EMCV抗原，冰浴避光轻轻搅拌30min， 置于0. 05mol/L、pH值9. 5碳酸钾缓冲液溶液中透析，2°C透析10小时，加入5mg/ml硼氢 化钠溶液0. anl，冰浴避光轻轻搅拌60分钟，加入等体积饱和度为50%的硫酸铵溶液，2°C 静置30分钟后，以3000转/分钟的速度离心20分钟，所得沉淀用磷酸钾缓冲液溶解后， Sepharose-4FF柱层析，收集第一峰，加入体积百分数为50%中性甘油，_25°C保存；
c.将酶标记EMCV抗原与酶稀释液按体积比1 400混合，完成酶标记EMCV抗原工作液 的制备。(三)制备EMCV抗体阳性对照
EMCV抗体阳性对照选自内部参考品(具体制备方法见本实施例三-1)中OD值> 2. 0的 阳性参考品。(四)制备EMCV抗体阴性对照
EMCV抗体阴性对照选自内部参考品(具体制备方法见本实施例三-1)中OD值< 0. 1的 阴性参考品。(五)制备洗液
洗液配制PH值为7. 4，终浓度为0. 2mol/L的磷酸钠缓冲液，其中含10g/L的吐温20， 2°C存放。(六)制备显色剂A
配制PH值为5. 0，终浓度为0. lmol/L的磷酸-柠檬酸钠缓冲液，其中含12mmol/L的 H2O2，溶解后加甘油避光存放。(七)制备显色剂B
配制PH值为2. 0，终浓度为0. 25g/L的柠檬酸-乙酸钠缓冲液，其中含0. 25g/L的TMB 盐酸钠，溶解后加甘油避光存放。(A)制备终止液
配制2M的&S04，完成终止液的制备。二、本试剂盒可用于检测人和动物的EMCV抗体，具体检测步骤如下
a.取出包被EMCV重组抗原的酶标板，在孔中分别加待测样品、阴性对照、阳性对照各 100 μ L，其中待测样品1孔，阴性对照3孔，阳性对照2孔；充分混勻，用不干胶片封板，封板 后将酶标板置37°C水浴中反应40分钟；b.弃去各孔内液体，用稀释20倍后的洗液注满各孔，静置30秒，甩干，重复6次，用吸 水纸拍干；
c.加入酶标记的EMCV抗原工作液100μ L，用不干胶片封板，置37°C反应30分钟；
d.弃去各孔内液体，用稀释20倍后的洗液注满各孔，静置30秒，甩干，重复6次，用吸 水纸拍干；
e.每孔按顺序分别加入显色剂A、显色剂B各50μ L，置37°C显色15分钟；
f.每孔加终止液50微升，振荡混勻。选择酶标仪波长450nm，参考波长630nm，测定各 孔OD值。结果判断待测样品OD值彡2. 1 X阴性对照平均OD值，则待测样品为EMCV抗体 阳性，待测样品OD值<2. 1 X阴性对照平均OD值，则待测样品为EMCV抗体阴性，其中阴性 对照平均OD值小于0. 05按0. 05计。三、本发明试剂盒性能的评估
本发明建立了内部参考品用以评估本试剂盒的性能。一、内部参考品的制备
a、阳性参考品的制备将3份兔抗EMCV血清等体积混合，将混合后血清与磷酸盐缓冲 液按体积比1 50、1 100、1 200、1 400稀释，按上述稀释顺序将其编号为Pl、P2、P3、P4 ；用 本发明所制备的试剂盒检测猪血清，选取EMCV抗体阳性的猪血清2份，其中OD值> 2. 0的 猪血清编号为P5，2. 0 > OD值彡1. 0的猪血清编号P6 ；将P1-P6构成阳性参考品。b、阴性参考品的制备用本发明所制备的试剂盒测得OD值< 0. 10的未免疫兔血 清1份(编号m)、标准马血清1份(编号N2)、未免疫猪血清4份(编号N3、N4、N5、N6)；将 m-N6作为阴性参考品。C、灭活将以上各份血清用0. 22 μ M滤膜过滤除菌，用钴_60灭活，剂量为10 20kgy，灭活4 6小时，以杀灭其中的致病因子。d、将灭活后的血清加入体积百分含量0. 02%的妝队，无菌过滤，_20°C保存，完成内 部参考品的制备。二、内部参考品阴阳性的确定
如表1所示用酶稀释剂将EMCV抗原分别稀释至原质量浓度的10-3、10-4、10_5、10_6、 10_7，将不同内部参考品加入到不同浓度溶液中，形成待中和溶液。用DMEM培养液按 相同稀释度稀释EMCV抗原作为阳性对照，用DMEM培养液作为阴性对照，以各内部参考品 自身作空白对照，于2 8°C中和10小时，将上述各份溶液按100μ L /孔接种至长满单 层ΒΗΚ-21细胞的96孔细胞培养板上，2小时后吸尽各孔液体，每孔加入180 μ L含体积百 分含量5%新生小牛血清的DMEM培养液，于37°C、体积浓度为5% CO2的环境下培养4天， 观察细胞病变情况，判断中和结果以阴性对照呈阴性、阳性对照呈阳性且空白对照呈阴性 者，实验成立。以阳性对照成立的最大稀释度作为细胞病变阳性的判断标准，血清中和后细 胞病变阳性者，则内部参考品为EMCV-Ab阴性；反之，细胞病变为阴性者，则内部参考品为 EMCV-Ab阳性。实验结果如表1所示6份阴性内部参考品均未能中和EMCV抗原，中和实验 结果均为阳性，故其EMCV-Ab为阴性；阳性内部参考品均能中病毒，为EMCV-Ab阳性，但P3 未能中和10_3病毒，P4也只能中和10_6和10_5病毒，未能中和 1(Γ4、1(Γ3的病毒，因此，Ρ3和Ρ4为EMCV-Ab弱阳性。
表1内部参考品血清中和实验结果
权利要求
1.一种检测EMCV抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括包被EMCV重组抗原的酶标板、酶标记的EMCV抗原工作液、EMCV抗体阳性对照、EMCV抗 体阴性对照、洗液、显色剂A、显色剂B和终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述EMCV重组抗原的蛋白浓度为 300ng/ml 60 μ g/ml，是由相同蛋白浓度的EMCV-VPl重组蛋白、EMCV-VP2重组蛋白和 EMCV-2C重组蛋白组成。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述EMCV重组抗原的蛋白浓度为 30 μ g/mlο
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述包被EMCV重组抗原的酶标板的制 备包括封闭包被的EMCV重组抗原步骤，所述封闭包被的EMCV重组抗原步骤中所用封闭材 料为含5g/L的鱼蛋白胨、100g/L蔗糖，pH值为7. 2 7. 8的磷酸盐缓冲液或含100g/L马 血清、100g/L蔗糖，pH值为7. 2 7. 8的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记的EMCV抗原工作液是按照 以下步骤制备的1).酶的活化将5mg酶溶于Iml纯化水中，加入0.06mol/L过碘酸钠溶液0. 5ml，冰 浴避光搅拌30分钟，加入0. 16mol/L乙二醇0. 5ml，冰浴避光搅拌30分钟，2_8°C保存；2).酶标记EMCV抗原的制备用0.2mol/L碳酸盐缓冲液将活化后的酶的pH调至 9. 0-9. 5，加入5mgEMCV抗原，冰浴避光搅拌30分钟，置0. 05mol/L，pH9. 5碳酸盐缓冲液溶 液中透析，2-8°C透析10_14h，加入5mg/ml硼氢化钠溶液0. aiil，冰浴避光搅拌60分钟，加 入等体积饱和度为50%的硫酸铵溶液，2-8°C静置30分钟后，以3000转/分钟的速度离心 20分钟，所得沉淀用磷酸盐缓冲液溶解后，Sepharose-4FF柱层析，收集第一峰，加入体积 百分数50%中性甘油，-20°C _30°C保存；3).将酶标记EMCV抗原与酶稀释液按体积比1:200 1:800混合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记的EMCV抗原工作液中的酶 为辣根过氧化物酶。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记EMCV抗原的制备步骤中 EMCV抗原是先灭活再用酶标记的。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记EMCV抗原与酶稀释液的体 积比为1:400。
9.权利要求1-8中任何一项所述的试剂盒在检测人和动物EMCV抗体中的应用。
10.根据权利要求9所述的试剂盒在检测人和动物EMCV抗体中的应用，其特征在于 所述应用的具体步骤为a.取出包被EMCV重组抗原的酶标板，在孔中分别加待测样品、阴性对照、阳性对照各 100 μ L，充分混勻，封板，封板后将酶标板置37°C水浴中反应40分钟；b.弃去各孔内液体，用稀释20倍后的洗液冲洗，拍干；c.加入酶标记EMCV抗原工作液100 μ L，封板，置37°C反应30分钟；d.弃去各孔内液体，用稀释20倍后的洗液冲洗，拍干；e.每孔按顺序分别加入显色剂A、显色剂B各50μ L，置37°C显色15分钟；f.每孔加终止液50 μ L，测定各孔OD值。
全文摘要
检测脑心肌炎病毒抗体的酶联免疫试剂盒及其应用，本发明公开了一种检测EMCV抗体的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括包被EMCV重组抗原的酶标板、酶标记的EMCV抗原工作液、EMCV抗体阳性对照、EMCV抗体阴性对照、洗液、显色剂A、显色剂B和终止液；本发明还涉及该试剂盒在检测人和动物EMCV抗体中的应用。该试剂盒能对人和动物进行检测，灵敏度高，特异性强，热稳定性好，检测成本低，检测时间短，适用于大批量的EMCV抗体的检测；经试验，99.6%的血清能直接判断出阴阳性，具有很好的实用效果。
文档编号G01N33/569GK102087282SQ20111003978
公开日2011年6月8日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者乔自林, 冯若飞, 李向茸, 李明生, 樊得英, 马忠仁 申请人:冯若飞, 马忠仁