专利名称：液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法
技术领域：
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法。
背景技术：
近20年来，农药在农作物种植和生产中应用日益广泛，其在降低病虫害发生、促进生长、提高产量和改善产品品质方面的作用是十分显著的，已成为现代农业不可或缺的物质基础。但是，农药的使用无疑会导致作物体内药物的滞留或蓄积，并以残留的方式进入人体及生态系统。滥用或非法使用农药的现象仍然存在，其对人类及环境的危害主要是慢性、远期和累积性的，农产品中的农药残留已成为公认的农业和环境问题，对残留的监测与控制已经是目前国内外农药研究、开发、使用和管理的重要内容。现在，蔬菜中农药残留量的检测主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱_质谱法和液相色谱_串联质谱法。气相色谱法和液相色谱法主要是依赖色谱分离，针对复杂基质如韭菜、大蒜等样品时，在农药的定性上存在一定难度；气相色谱-质谱法和液相色谱_串联质谱法主要是利用低分辨质谱检测器，通过化合物结构断裂或重排产生的碎片进行样品检测，但是，在同时分析多个化合物时，由于受到扫描速度等的影响，灵敏度会受到较大影响，对色谱分离要求较高。然而，根据高分辨质谱检测器分析农药单同位素和重同位素的精确质量数及丰度，进而较易推测可靠的元素组成，提高了农药在定性与定量上的准确性和可靠性，避免了色谱法和四极杆低分辨质谱对色谱分离要求高的难题。由于农药残留在蔬菜中含量极低，上述几种方法在检测时提高信噪比的方法一般有两种途径，一是从样品制备环节着手，利用各种方法尽可能的去除杂质和非目标化合物， 最大倍数的浓缩样品，减少干扰，以达到研究的目的，这种方法在实际操作中难度非常大； 另一种途径是根据目标化合物的特性，选用特异性检测器，尽可能减少背景干扰。而实际样品由于地域条件、蔬菜本身基质的差异，在测定时，受到非目标化合物干扰，给定性和定量带来很大的影响。目前国内对通过提取农药的精确质量数来避开干扰影响的研究较少，已经制定的农产品中农药多残留量检测标准大多集中在气相色谱和液相色谱_串联质谱上，对使用高分辨质谱提取农药的精确质量数来检测农药残留、在降低对定性和定量干扰难题方面还没有在检测行业引起关注，仅在石化行业有专利采用气相色谱_高分辨飞行时间质谱检测原油中咔唑类化合物。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速、简便、灵敏度高，且有效减少或消除来自蔬菜的复杂基质干扰农药多残留量的液相色谱高分辨质谱检测方法的技术方案。所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于包括以下步骤
1)样品中农药残留的乙腈提取
称取25 50g蔬菜样品，加入25 50ml乙腈，进行高速分散处理，得到由蔬菜基质、 水和乙腈组成的混合勻浆溶液，在上述勻浆溶液中加入15 25g复合盐盐析试剂，再进行高速分散处理，然后进行离心操作，静置分层；
2)样品提取溶液的分散固相萃取净化
取2 6ml上层乙腈，分别加入0. 6 1. 8g无水硫酸镁、0. 05 0. 2g N-丙基-乙二胺(PSA)和0. 05 0. 2gC18，再进行振荡离心取上清液，上清液过0. 22 μ m有机滤膜，即得到样品溶液；
3)使用液相色谱_高分辨质谱仪检测
a)标准溶液的制备分别准确称取标准品农药，用体积比为3:7的丙酮-甲苯溶液溶解，分别配成1. Omg/mL的标准储备溶液，使用时根据各农药的响应，用乙腈稀释成标准工作液；
b)使用液相色谱_高分辨质谱仪器检测标准工作液和经净化后的样品溶液由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入液相色谱_高分辨质谱仪器中，样品溶液中农药残留经液相色谱柱分离，高分辨质谱全扫描检测；
4)结果分析
数据库的构建用ToxID软件建立步骤3)中标准品农药的化合物分子式数据库信息
表；
定性和定量以化合物的准分子离子峰的精确质量数为定性离子和定量离子；以标准工作液的质量浓度X为横坐标，定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行外标法定量；用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和定性离子(精确质量数)进行定性。所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤1)中复合盐盐析试剂为无水硫酸镁和氯化钠混合试剂，无水硫酸镁和氯化钠混合试剂中无水硫酸镁和氯化钠质量比10:1。所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤1)中蔬菜样品中加入乙腈后在分散机中转速8000 12000 r/min下勻浆1 3min，加入复合盐盐析试剂后在转速8000 12000 r/min下勻浆0. 5 2min，最后在离心机中3000 5000 rpm下离心4 6min。所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤2)中上层乙腈加入无水硫酸镁、N-丙基-乙二胺(PSA)和C18，在涡旋振荡器上振荡0. 5 2min，然后在离心机8 000 12 000 r/min下离心2 4min。所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤3)中标准品农药为甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、涕灭威亚砜、久效磷、多菌灵、涕灭威砜、噻菌灵、3-羟基克百威、吡虫啉、乐果、三环唑、抗蚜威、克百威、甲萘威、多效唑、嘧霉胺、三唑酮、三唑磷、丙环唑、甲草胺、乙草胺、苯醚甲环唑、精喹禾灵、丁草胺、哒螨灵和阿维菌素。所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于 所述的步骤3)中液相色谱条件色谱柱XDB-C18，1.8μ m,4. 6X50mm ；流动相A为5mM乙酸铵+0. 1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱0 10min，20% 90% B ；10 18min，90%B ； 18 18. Imin, 90% 20% B ； 18. 1 25min，20% B ；进样量5μ L ；流速0. 3mL/min ；柱温 30 0C ；
质谱条件质量分析器能提供精确质量数的质量分析器；扫描模式正离子_全扫描模式；质量范围100 1000 ；分辨率60000 ；离子源电喷雾离子源(ESI)；喷雾电压 4. 5kV ；鞘气压力45arb ；辅助气压力5arb。所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤4)中定性定量离子为农药的H+和NH4+加合物，且为精确质量数。本发明用乙腈试剂提取蔬菜样品中农药多残留后，用分散固相萃取技术净化；在样品提取后，加入硫酸镁和氯化钠的复合盐盐析，确保如甲胺磷等极性农药向有机相分配； 用硫酸镁、PSA、C18混合材料分散固相萃取净化，在进一步去除有机相中残留的水的同时， PSA和C18吸附样品中如糖、脂等干扰物；用全自动筛选应用软件ToxID，构建数据库非常方便，只需在Excel录入农药名称和分子式，自动计算H+、NH4+或Na+加合物的精确质量数， 可以用于复杂基体，简化样品净化，可以进行快速分析，提高了数据处理速度和分析效率， 同时也极大的降低了对农药误判、漏判的概率；用液相色谱_高分辨质谱进行样品检测并提取农药的精确质量数进行定性和定量，可以消除未知化合物干扰、具有定性准确、定量可靠，具有数据积分处理和应用方便等特点。本发明中27种农药的质量准确度小于lppm，检测限为0. 01 0. 05mg/kg，添加回收率为80% 100%，相对标准偏差小于15%。
图1为检测的27种农药多残留的质量准确度；
图2-5为27种农药标准溶液(0. 5mg/L)所对应精确质量数的提取离子图； 图6为实施例1 (西红柿基质)的检出农药所对应精确质量数的提取离子图； 图7为实施例2 (青菜基质)的检出农药所对应精确质量数的提取离子图； 图8为实施例3 (大白菜基质)的检出农药所对应精确质量数的提取离子图。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步说明本发明。实施例1 1、仪器与试剂
仪器Thermo Scientifc LTQ-Orbitrap XL组合式高分辨质谱仪(美国热电公司)和 SURVEY0R-HPLC液相色谱仪(美国热电公司)，高速分散机(德国IKA公司)。试剂乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；丙酮、甲苯、甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；PSA和C18填料(粒径40 μ m,瓦里安公司)；无水硫酸镁(分析纯，Sigma- Aldrich公司)；氯化钠(分析纯，上海试四赫维化工有限公司)，乙酸铵(分析纯，美国Fluka公司)；水为Milli- Q高纯水；含0.1 %甲酸的5mmol/L乙酸铵取0. 385g乙酸铵用水溶解，再加入ImL甲酸并用水稀释至1000mL。80种农药标准品(纯度不低于95 %，Dr Ehrenstorfer 公司)，用丙酮-甲苯(3:7)分别配成Img /mL的单标，并于-40°C下封存，使用前用乙腈逐级稀释配制为所需浓度的混标。 2、样品处理
(1)样品提取称取均勻试样(西红柿基质)25g置于200mL塑料离心管中，加入25mL乙腈，置于高速分散机中10000 r/min下勻浆2min，然后，向离心管中加入15g复合盐(无水硫酸镁和氯化钠质量比10:1)，在8000 r/min下勻浆lmin，最后，将离心管放置于离心机中， 4000 r/min Τι^^ 5min。(2)样品净化取4mL上层乙腈相于20mL离心管中，分别加入1. 2g无水硫酸镁、 0. IgPSAjno. lgC18，在涡旋振荡器上振荡Imin后，将离心管放置于离心机中，10000 r/ min下离心2min。取上清液过0. 22 μ m有机滤膜，待测。3、标准工作溶液的准备
分别准确称取标准品甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、涕灭威亚砜、久效磷、多菌灵、涕灭威砜、噻菌灵、3-羟基克百威、吡虫啉、乐果、三环唑、抗蚜威、克百威、甲萘威、多效唑、嘧霉胺、三唑酮、三唑磷、丙环唑、甲草胺、乙草胺、苯醚甲环唑、精喹禾灵、丁草胺、哒螨灵、阿维菌素，用丙酮_甲苯(3 7)溶解，分别配成1. Omg/mL的单一农药标准储备溶液。使用时根据各农药的响应，用乙腈稀释成混合农药标准工作液。4、样品测定方法
标准工作液和样品待测液在液相色谱_高分辨质谱仪上分别进样。液相色谱条件色谱柱流动相A为5mM乙酸铵+0. 1%甲酸水溶液，B为乙腈； 梯度洗脱0_10min，10%-90% B ;10-18min，90%B ;18-18. lmin，90%-10% B ；
18. l-25min, 10% B ；进样量:5 μ L ；流速0. 3mL/min ；柱温30°C。质谱条件质量分析器FT Orbitrap ；扫描模式正离子-全扫描模式；质量范围100-1000 ；分辨率60000 ；离子源电喷雾离子源(ESI)；喷雾电压4. 5kV ；鞘气压力 45arb5、结果分析
数据库的构建用ToxID软件建立各农药的化合物分子式数据库信息表，包括农药英文名称、分子式、加合物类型(见表1)。定性和定量以化合物的准分子离子峰(以H+或NH4+加合物形式)的精确质量数为定性离子和定量离子。以标准工作液的质量浓度X为横坐标，定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，用标准工作曲线对样品进行定量；并以保留时间和定性离子(精确质量数)定性。对提取后的样品待测液进行测定，以测得农药的峰面积为定量离子的峰面积， 代入标准曲线，求得样品中的多菌灵和嘧霉胺分别为0. 081mg/kg和0. 0032mg/kg。为判断方法的准确性，在此样品中加入0. 10mg/kg的多菌灵和0. 005mg/kg嘧霉胺添标水平，重复以上的样品前处理和仪器测定过程，测得此时样品中的多菌灵和嘧霉胺含量分别为0. 176mg/kg和0. 0075mg/kg,即多菌灵和嘧霉胺的添标回收率分别为95. 0%和 86. 0%，说明此方法是准确的。
表1农药数据库的信息表
权利要求
1.液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于包括以下步骤1)样品中农药残留的乙腈提取称取25 50g蔬菜样品，加入25 50ml乙腈，进行高速分散处理，得到由蔬菜基质、 水和乙腈组成的混合勻浆溶液，在上述勻浆溶液中加入15 25g复合盐盐析试剂，再进行高速分散处理，然后进行离心操作，静置分层；2)样品提取溶液的分散固相萃取净化取2 6ml上层乙腈，分别加入0. 6 1. 8g无水硫酸镁、0. 05 0. 2g N-丙基-乙二胺(PSA)和0. 05 0. 2gC18，再进行振荡离心取上清液，上清液过0. 22 μ m有机滤膜，即得到样品溶液；3)使用液相色谱_高分辨质谱仪检测a)标准溶液的制备分别准确称取标准品农药，用体积比为3:7的丙酮-甲苯溶液溶解，分别配成1. Omg/mL的标准储备溶液，使用时根据各农药的响应，用乙腈稀释成标准工作液；b)使用液相色谱_高分辨质谱仪器检测标准工作液和经净化后的样品溶液由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入液相色谱_高分辨质谱仪器中，样品溶液中农药组分经液相色谱柱分离，高分辨质谱全扫描检测；4)结果分析数据库的构建用ToxID软件建立步骤3)中标准品农药的化合物分子式数据库信息表；定量和定性以化合物的准分子离子峰的精确质量数为定性离子和定量离子；以标准工作液的质量浓度X为横坐标，定性定量离子的峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行单离子外标法定量；用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和定性离子的精确质量数进行定性。
2.如权利要求1所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤1)中复合盐盐析试剂为无水硫酸镁和氯化钠混合试剂，无水硫酸镁和氯化钠混合试剂中无水硫酸镁和氯化钠质量比10:1。
3.3.如权利要求1所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤1)中蔬菜样品中加入乙腈后在分散机中转速8000 12000 r/ min下勻浆1 3min，加入复合盐盐析试剂后在转速8000 12000 r/min下勻浆0. 5 2min，最后在离心机中3 000 5 000 rpm下离心4 6min。
4.如权利要求1所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤2)中上层乙腈加入无水硫酸镁、N-丙基-乙二胺和C18，在涡旋振荡器上振荡0. 5 2min，然后在离心机8 000 12 000 r/min下离心2 4min。
5.如权利要求1所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤3)中标准品农药为甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、涕灭威亚砜、久效磷、 多菌灵、涕灭威砜、噻菌灵、3-羟基克百威、吡虫啉、乐果、三环唑、抗蚜威、克百威、甲萘威、 多效唑、嘧霉胺、三唑酮、三唑磷、丙环唑、甲草胺、乙草胺、苯醚甲环唑、精喹禾灵、丁草胺、 哒螨灵和阿维菌素。
6.如权利要求1所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤3)中液相色谱条件色谱柱XDB-C18，1. 8 μ m, 4. 6X 50mm ；流动相A 为5mM乙酸铵+0. 1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱0 10min，20% 90% B ；10 18min， 90%B ；18 18. lmin，90% 20% B ； 18. 1 25min，20% B ；进样量5μ L ；流速0. 3mL/min ； 柱温:30°C ；质谱条件质量分析器能提供精确质量数的质量分析器；扫描模式正离子_全扫描模式；质量范围100 1000 ；分辨率60000 ；离子源电喷雾离子源；喷雾电压4. 5kV ；鞘气压力45arb ；辅助气压力5arb。
7.如权利要求1所述的液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，其特征在于所述的步骤4)中定性离子和定量离子均为农药的H+和NH4+加合物，且为精确质量数。
全文摘要
液相色谱高分辨质谱检测蔬菜样品中农药多残留量的方法，属于食品安全检测技术领域。其包括以下步骤1)样品中农药残留的乙腈提取；2)样品提取溶液的分散固相萃取净化；3)使用液相色谱-高分辨质谱仪检测；4)结果分析。本发明中27种农药的质量准确度小于1ppm,检测限为0.01～0.05mg/kg，添加回收率为80%～100%，相对标准偏差小于15%。
文档编号G01N30/72GK102221589SQ20111007539
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者曹赵云, 朱智伟, 牟仁祥, 陈铭学 申请人:中国水稻研究所