专利名称：胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫分析医学领域，具体涉及一种胰蛋白酶原-2检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
急性胰腺炎(AP)为腹部外科常见病，且近年来重型胰腺炎发病率逐渐增多。急性胰腺炎对生理扰乱大，而且对各重要脏器损害明显故死亡率甚高，有时可引起骤然死亡，重型胰腺炎死亡率为20 %，有并发症者可高达50 %。所以，临床上需要及早和准确的诊断，以免延误病情。对急性胰腺炎的诊断，传统为采用生化方法测定淀粉酶。但人的淀粉酶有两类同功酶，即胰腺淀粉酶和唾液淀粉酶，前者是由胰腺细胞特异分泌的，而后者可来源于唾液腺、肝细胞、乳腺、肺和女性生殖器官，并且后者的含量大于前者。传统的生化方法不能区分这两类淀粉酶，测定中造成干扰，导致误诊。急性胰腺炎一般来势凶险，诊断延误极易造成死亡。胰蛋白酶(Trypsin)是由胰腺外分泌细胞产生的蛋白水解酶，是胰液的主要成分，其前体为胰蛋白酶原。胰蛋白酶原(Trypsinogen)是一种分子量为25Kd的胰腺蛋白水解酶，由肠激酶激活。它分为两种主要同功酶，即阳离子的胰蛋白酶原-1和阴离子的胰蛋白酶原-2，两者在胰液中含量很高，正常时仅有极少量进入循环系统，但病理情况下可大量进入血液。健康人中胰蛋白酶原-1与胰蛋白酶原-2的比值为4 1，但在急性胰腺炎时， 血中胰蛋白酶原-2急剧增高，又由于它在肾小管吸收少，因此血和尿中胰蛋白酶原-2水平皆明显升高。血清胰蛋白酶原-2测定对胰腺炎的诊断具有高度的特异性，能够准确无误的做出判断，使急性胰腺炎得到及时和恰当的治疗，它同时又是病情严重程度的指标。英国利物浦皇家医学院外科最近在Lancet报导他们比较了血中C-反应蛋白、尿中胰蛋白酶原激活肽等几种临床化学指标对急性胰腺炎的诊断、预后的意义，认为尿中胰蛋白酶原的检测对急性胰腺炎较佳，可作为临床常规应用。所以，对急性胰腺炎的诊断，测定胰蛋白酶原-2的特异性远远高于传统的生化方法测定淀粉酶。2000年，Clin Cancer Res中报导日本科学家认为60%晚期胃癌患者血中胰蛋白酶原十分高，这些患者常伴有淋巴结、肝转移，而且往往是分化差的腺癌。另外应用胰蛋白酶原对胆管癌、梗阻性黄疸的鉴别诊断近期也有相关报道。胰蛋白酶原-2的检测，现有的胶体金的方法虽然操作比较简单，但需要手工操作，仅适合少量样本的检查，不适合进行大规模使用，不适合上机进行全自动的操作，容易造成误差，而且胶体金的方法对胰蛋白酶原-2的检查是定性的，无法实现定量。化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)于 1977 年问世， 上世纪九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位， 代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏性(检测限度可达10_15 10_18mOl/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、 快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。化学发光免疫分析作为一种新兴的分析技术，目前尚未应用于胰蛋白酶原-2的检测。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒。本发明的另一目的是提供所述试剂盒的临床适用范围。本发明的试剂盒可以用于急性胰腺炎的临床诊断；本发明试剂盒还可以用于监测胰腺癌、胆囊癌、胃癌、淋巴瘤、胚胎性恶性肿瘤的发展过程。本发明的再一目的是提供制备上述试剂盒的方法。本发明的胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒包括1)胰蛋白酶原-2抗原校准品；2)胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被的微孔板；3)当2)中为胰蛋白酶原-2抗体包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体，当2、中为链霉亲和素包被的微孔板时， 为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体和生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体；4)化学发光底物液； 以及幻浓缩洗涤液。本发明还提供了制备上述试剂盒的方法，其包括以下步骤1)配制胰蛋白酶原-2 抗原校准品；2)以胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被微孔板；3)当幻中采用胰蛋白酶原-2抗体包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体，当2、中采用链霉亲和素包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体并采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体；4)配制化学发光底物液；以及幻浓缩洗涤液；6)分装上述胰蛋白酶原-2抗原校准品、酶或生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体、化学发光底物液和浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。
具体实施例方式急性胰腺炎时，尿或血液中胰蛋白酶原-2水平急剧升高，测定尿或血液中胰蛋白酶原-2的含量可以作为急性胰腺炎早期诊断的依据。同时本发明的发明人发现在胃癌、淋巴瘤、胚胎性恶性肿瘤患者血液中胰蛋白酶原-2水平也明显升高，可见胰蛋白酶原-2也是一种有价值的肿瘤标志物。胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒将在急性胰腺炎诊断和癌症发展监测方面起到重大的作用。为了解决现有技术中存在的问题，本发明将化学发光技术与胰蛋白酶原-2的免疫分析学有效地结合，同时使用了发光信号强、持续时间长、更高信噪比的自制化学发光底物液，提供了一种能够更加简便、快速、灵敏、稳定地检测胰蛋白酶原-2的试剂盒。同时，本发明的试剂盒采用的方法比目前其它分析法灵敏度高，反应高度特异性，因此使本试剂盒更适于在产业上有效地进行推广和应用。
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根据本发明的胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒包括1)胰蛋白酶原-2抗原校准品；2)胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被的微孔板；3)当2)中为胰蛋白酶原-2 抗体包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体，当2、中为链霉亲和素包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体和生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体；4)化学发光底物液；以及幻浓缩洗涤液。其中，所述胰蛋白酶原-2抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选为单克隆抗体，例如芬兰Medix Biochemica公司的Anti-Trypsinogen—2单克隆抗体。其中，所述幻中的酶标记物优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素；试剂盒优选同时可以引入生物素-链霉亲和素系统，采用链霉亲和素包被微孔板，以生物素标记的一株单克隆抗体和酶标记的另一株单克隆抗体形成新的免疫分析模式。其中，所述4)中的化学发光底物优选可以是1，2_ 二氧乙烷类衍生物，例如 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷(AMPPD)；鲁米诺或其衍生物，或异鲁米诺或其衍生物；氨基苯二酰胼类，等。其中，所述4)采用的是化学发光底物液。该化学法光底物液可以按照本领域常规的方法自制，也可以购买得到，例如美国THERMO公司的PIERCE试剂。所述4)中，所述浓缩洗涤液优选为PBST (即磷酸盐吐温缓冲液)或含Tween20的 Tris-HCl缓冲液。根据本发明的试剂盒，其中，所述胰蛋白酶原-2抗体的来源可以是大鼠、小鼠、 兔、山羊、绵羊、豚鼠、牛、驴、马、鸡或猴子。本发明的用于制备所述试剂盒的方法包括以下步骤1)配制胰蛋白酶原-2抗原校准品；2)以胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被微孔板；幻当幻中采用胰蛋白酶原-2 抗体包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体，当2、中采用链霉亲和素包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体并采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体；4)配制化学发光底物液；以及幻配制浓缩洗涤液；6)分装上述胰蛋白酶原-2抗原校准品、酶或生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体、化学发光底物液和浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。所述步骤1)中，所述胰蛋白酶原-2抗原校准品为人工合成多肽，纯度优选不得低于 90%。所述步骤2、优选包括以下步骤I)胰蛋白酶原-2抗体的准备所述胰蛋白酶原-2抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，优选为单克隆抗体，例如芬兰Medix Biochemica公司的Anti-Trypsinogen-2单克隆抗体。所述胰蛋白酶原_2 抗体可以购买得到或者按照本领域常规的制备方法获得。制备方法可以是①制备多克隆抗体人工合成胰蛋白酶原-2多肽，用合成的多肽交联BSA后免疫兔子，制备兔抗人胰蛋白酶原-2抗体；或者②制备单克隆抗体用基因重组的胰蛋白酶原-2免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体细胞株。II)包被用0. 01 5mol/L(优选为 0. 01 0. lmol/L,更优选为 0. 05mol/L) pH 值为 7 11 (优选为7 10，更优选为9. 6)的碳酸盐缓冲液与1 20 μ g/mL的胰蛋白酶原_2抗体配制成包被液，或者配制基于IOOOmL包含10 90g Na2HPO4 · 12H20、1 50g柠檬酸的溶液，所述溶液的PH值为3 10，然后将链霉亲和素以1 20 μ g/mL的浓度溶解到所述溶液中，配制成包被液；将上述包被液负载于微孔板上，包被的微孔板为48或96孔的微孔板条。III)用生理盐水洗涤上述微孔板。IV)封闭配制封闭液，基于IOOOmL所述封闭液包含0. 01 5g(优选为0. 01 2. 0g，更优选为 0. 2g) NaH2PO4 ·2Η20、0· 01 IOg (优选为 0.01 ~ 5g，更优选为 0. 5 5g 最优选为 2. 9g) Na2HPO4 · 12H20、1 40g(优选为1 20g，更优选为IOg)牛血清白蛋白和0. 1 IOmL (优选为ImL)生物防腐剂(例如庆大霉素、乳酸链球菌素和那他霉素、ProClin300等)，所述封闭液的PH值为7. 0 10 (优选为7. 0 7. 6)，然后将所得封闭液加到微孔板上，每孔200 300微升，2 40°C放置4 M小时后将液体吸出，用0. 9%生理盐水冲洗一遍后晾干备用。所述步骤幻中，胰蛋白酶原-2抗体酶标记物优选为偶联碱性磷酸酶或是辣根过氧化物酶。采用辣根过氧化物酶时，优选采用过碘酸钠法进行标记，采用碱性磷酸酶时，优选采用戊二醛交联法进行标记。试剂盒优选同时可以引入生物素-链霉亲和素系统，采用链霉亲和素包被微孔板，以生物素标记的一株单克隆抗体和酶标记的另一株单克隆抗体形成新的免疫分析模式。所述步骤幻中，采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体的步骤优选为①将胰蛋白酶原-2抗体在0. 01 2. OOmol/L的pH 5 10的硼酸缓冲液中透析4 M小时，透析完毕后取出抗体装入玻璃瓶中；②称生物素IOyg IOOOyg溶于有机溶剂中，所述有机溶剂优选为非质子极性溶剂，例如DMF、DMS0等；③将步骤①中所得到的溶液与步骤②中所得到的溶液混合，室温反应1 M小时，加入100 μ 1的0. 5 5mol/L的氯化铵溶液。所述步骤4)中，所述化学发光底物液中的有效发光物质优选为鲁米诺或AMPPD。 该化学法光底物液可以按照本领域常规的方法自制，也可以购买得到，例如美国THERMO公司PIERCE试剂。所述步骤5)中，浓缩洗涤液优选为PBST或含Tween20的Tris-HCl缓冲液。步骤6)和7)可按照本领域常规的操作。例如步骤6)即将生产的所述组分等体积存放在小瓶中，步骤7)即将这些小瓶排放到试剂盒的里面。在本发明的研究过程中，首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，以保证试验的精确性，然后对包被方法进行了研究，选择出最适合的包被缓冲液和封闭液，找到最佳的浓度条件，并且配制出了能够使酶标记物长期保持活性的稀释液。本发明胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒可以检测尿或血液中胰蛋白酶原-2的水平，可以作为急性胰腺炎诊断指标之一，从而可以用于急性胰腺炎的临床诊断。 同时使用该试剂盒测定尿或血液中胰蛋白酶原-2的水平还可用于监测癌症(例如胰腺癌、 胆囊癌、胃癌、淋巴瘤和胚胎性恶性肿瘤)的发展过程。本发明的试剂盒具有无创、简便、快速、灵敏、稳定等优点。同时该胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒的各项指标均已达到技术要求。
根据本发明的试剂盒，酶标记的胰蛋白酶原-2抗体与固相载体上包被的胰蛋白酶原-2抗体同被测样品中的胰蛋白酶原-2抗原形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构，因此本发明采用的“双抗体夹心法”反应模式，既有效地利用抗原-抗体反应的高特异性，又结合了化学发光免疫分析技术的高灵敏度，可为临床诊断提供更为特异、 快速、可靠的依据。实施例下面通过实施例对本发明进行进一步地说明，但不应理解为对本发明的限制。实施例1应用辣根过氧化物酶系统制备本发明的胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒一、辣根过氧化物酶标记的胰蛋白酶原-2抗体的制备溶解5mg辣根过氧化物酶于0. 5mL蒸馏水中，加入0. 5mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌30min，经IOmM pH值为4. 4醋酸钠缓冲液，透析后加入5mg胰蛋白酶原-2抗体(芬兰 Medix Biochemica 公司的 Anti-Trypsinogen-28603)，搅拌 2h，最后用 200mM NaBH4 进行还原，经0. 02M PBS缓冲液透析后，加等体积甘油，-200C以下保存。二、酶标抗体稀释液
权利要求
1.一种胰蛋白酶原-2化学发光免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 1)胰蛋白酶原-2校准品；2)胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被的微孔板；3)当2)中为胰蛋白酶原-2抗体包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体，当2、中为链霉亲和素包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体和生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体； 4)化学发光底物液；以及幻浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于标记胰蛋白酶原-2抗体的标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1，2_二氧乙烷类衍生物、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物或氨基苯二酰胼类衍生物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为AMPPD、鲁米诺或异鲁米诺或氨基苯二酰胼。
5.根据权利要求1 4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为 PBST 或含 Tween20 的 Tris-HCl 缓冲液。
6.根据权利要求1 5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于所述胰蛋白酶原-2抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
7.根据权利要求1 6中任意一项所述的试剂盒，所述胰蛋白酶原-2抗体来源于大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠、牛、驴、马、鸡或猴子。
8.一种制备权利要求1 7中任意一项所述试剂盒的方法，其包括以下步骤1)配制胰蛋白酶原-2抗原校准品；幻以胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被微孔板；幻当2)中采用胰蛋白酶原-2抗体包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体，当2、中采用链霉亲和素包被微孔板时，采用酶标记胰蛋白酶原-2抗体并采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体；4)配制化学发光底物液力)配制浓缩洗涤液；6)分装所述胰蛋白酶原-2抗原校准品、 酶和/或生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体、化学发光底物液、浓缩洗涤液；以及7)组装为成品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤2、包括以下步骤I)胰蛋白酶原-2抗体的准备；II)包被用0. 01 5mol/L pH值为7. 0 11. 0的碳酸盐缓冲液与1 20 μ g/mL的胰蛋白酶原-2抗体配制成包被液，或者配制基于IOOOmL包含10 90g Na2HPO4 · 12H20、1 50g柠檬酸的溶液，所述溶液的 PH值为3 10，然后将链霉亲和素以1 20 μ g/mL的浓度溶解到所述溶液中，配制成包被液；将上述包被液负载于微孔板上，包被的微孔板为48或96孔的微孔板条；III)用生理盐水洗涤上述微孔板；IV)封闭配制封闭液，基于IOOOmL所述封闭液包含0. 01 5. Og NaH2PO4 · 2H20、0. 01 IOg Na2HPO4 · 12H20、1 40g牛血清白蛋白和0. 1 IOmL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为 7. 0 10，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的微孔板上。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，胰蛋白酶原-2抗体酶标记物为偶联碱性磷酸酶或是辣根过氧化物酶，采用辣根过氧化物酶时，采用过碘酸钠法进行标记，采用碱性磷酸酶时，采用戊二醛交联法进行标记。
11.根据权利要求8 10中任意一项所述的方法，其特征在于所述步骤幻中，采用生物素标记胰蛋白酶原-2抗体的步骤为①将胰蛋白酶原-2抗体在0. 01 2. 00mol/L pH 5 10的硼酸缓冲液中透析4 M小时，透析完毕后取出抗体装入玻璃瓶中；②称生物素 10μ g ΙΟΟΟμ g溶于有机溶剂中；③将步骤①中得到的溶液与步骤②中得到的溶液混合， 室温反应1 24小时，加入100 μ 10. 5 5mol/L的氯化铵溶液。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述有机溶剂为DMF、DMS0或其组合。
全文摘要
本发明提供了一种胰蛋白酶原-2化学发光免疫检测试剂盒，其包括1)胰蛋白酶原-2校准品；2)胰蛋白酶原-2抗体或链霉亲和素包被的微孔板；3)当2)中为胰蛋白酶原-2抗体包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体，当2)中为链霉亲和素包被的微孔板时，为酶标记的胰蛋白酶原-2抗体和生物素标记的胰蛋白酶原-2抗体；4)化学发光底物液；以及5)浓缩洗涤液。本发明还提供制备上述试剂盒的方法。本发明的试剂盒具有操作简便、灵敏度高、反应快速等优点。
文档编号G01N33/573GK102226808SQ20111007551
公开日2011年10月26日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者张昊岩, 范振符, 范飞舟, 陈智周 申请人:北京永瀚星港生物技术有限公司