专利名称：一种以ZrP-CA为载体的固定酶电极的制备方法
技术领域：
本发明涉及用于生物燃料电池和电化学生物传感器的以无机材料为载体固定酶电极的制备方法，属于材料科学技术领域。
背景技术：
随着生物技术高速的发展和电化学材料不断的改进，生物大分子酶备受关注，而酶的固定和酶的直接电子转移成为研究的热点。这些研究不仅是探索生命体内的生理作用机理等理论研究的基础，也是对研究第三代生物传感器、开发生物燃料电池和生物芯片等方面具有重大的意义，因而酶的直接电化学行为具有重要的理论价值和良好的应用前景。 改善载体材料的应用和改进酶的固定方法，使酶能够稳定的固定在电极上并且能够进行快速的电子转移是直接电化学解决的关键问题。纳米材料是构建第三代电化学生物传感器中重要的载体材料。纳米材料具有巨大的表面积，在生物燃料电池中用于固定酶或微生物都具有很大的开发潜力。研究证明磷酸锆具有很好的生物相容性，有利于酶的固定。Kumar等人(J. Am. Chem. Soc. 2000，122， 830-837)对层状磷酸锆固定蛋白质的结构和活性进行了研究和分析。研究表明载体的亲水性及表明电荷的分布有利于蛋白质的固定，在生物传感器和生物催化方面有重要的应 M。 Bh￡imbh￡ini,A (Microporous and Mesoporous Materials, 2008,110,517-527)石if 究了变性剂对插入磷酸锆中的蛋白质稳定性的影响，报道表明磷酸锆有利于酶的固定，且在变性剂存在的条件下有助于提高酶的稳定性。Yang等人(BioelectrochemistrydOOS， 74,90-95)用磷酸锆纳米层膜固定辣根过氧化物酶，并进行了直接电化学测试和电催化实验。实验表明，磷酸锆纳米层膜具有很好的生物相容性，大的比表面积能使诱捕的酶显示出很好的电活性，生物活性及电催化活性。但是磷酸锆的导电性比较差，而碳的导电性好， 并且关于碳材料固定酶的报道也很多。其中较为新颖的是You等人(Talanta，2009，78， 705-710)采用Si为模板，蔗糖为碳源制备有序的二维、三维介孔碳固定葡萄糖氧化酶。有序的三维介孔碳材料对葡萄糖氧化酶的吸附容量较高、且固定酶后能够保持较高的生物活性。三维介孔碳材料由于具有高的比表面积、均一的孔结构及突出电催化性能，有利于酶的固定和电子转移速率的提高。在实验中，我们发现以炭气凝胶为模板合成介孔磷酸锆得到 &P-CA，不仅导电性好，生物相容性也很好，有利于酶的固定，同时也有助于电子转移速率的提高。该方法为载体制备和酶的固定提供了新的思路。
发明内容
发明的目的是提供一种可用于生物燃料电池和电化学生物传感器的以无机材料为载体固定酶电极的制备方法，本发明的固定酶电极具有良好的电化学性能。本发明提供的一种以&P-CA为载体的固定酶电极的制备方法，包括以下各步骤(1)制备炭气凝胶炭气凝胶的制备是现有技术，可参考pekala(journal of materialsscience,
31989，24，3221-3227)报道的传统的制备方法制备炭气凝胶。如将间苯二酚(R)、甲醛(F) 和催化剂碳酸钠(C)以摩尔比1 2 500的比例混合，加入去离子水，使反应物浓度为 (即间苯二酚(R)和甲醛(F)占反应体系的质量分数)50%，在搅拌条件下溶解后，转移到密闭玻璃容器中，放入水浴锅中，在30°C下放置ld，50°C放置ld，85°C放置3d ；然后用丙酮置换出水溶剂，每天置换一次，置换3d ；在常温常压下自然干燥；将干燥的RF凝胶研磨成粉末，放入管式炉中，在N2气氛下以2. 5°C /min的速率升温至900°C，保温4h，自然降温后，得到的粉末为炭气凝胶。(2)用步骤⑴所得到的CA样品作模板，将CA样品、正丙醇锆、去离子水以质量比为1 1 25的比例混合，按& P的摩尔比为1 2，滴加入85%磷酸，搅拌2-4小时后转移到密闭的玻璃容器中，在85°C水浴锅中加热3d，过滤得到^^义々粉末。(3)取步骤(2)得到的&P-CA粉末和GOD以质量比为1 4的比例放入样品管中， 用纯度为95%的乙醇溶解，使酶的浓度为％ig/ml，机械摇勻后，得到GOD/ZrP-CA悬浊液，放入4°C冰箱中过夜待用。(4)将GC (玻碳)电极用0.3 μ m和0.05 μ m的氧化铝打磨至光亮，然后用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥。用微量进样器取步骤(3)的悬浮液滴加到处理好的GC 电极表面，再滴加0. 1 % Nafion溶液，室温自然干燥，得到以&P-CA为载体的固定酶电极， 其中悬浮液的用量为每0. 1256cm2的GC8yL，0. 1 % Nafion溶液的用量为每0. 1256cm2的 GC2y L0本发明制得的以玻碳电极为基底无机^^^々为载体的酶电极，炭气凝胶的导电率高有利于电子传递，磷酸锆的生物相容性好有利于酶的固定。由炭气凝胶为模板负载磷酸锆得到的&P-CA，提高了酶的固定效果。其性能评价采用三电极体系，进行循环伏安扫描测试，数据由美国普林斯顿公司的恒电流电位仪Potentiostat/Galvanostat model 273A 记录。工作电极直接采用无机^^义々为载体的酶电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为钼电极。通过不同浓度葡萄糖的PBS溶液中电极的循环伏安曲线的变化来评价固定酶的性能。测试结果(见图3、图6)表明以&P-CA为载体的酶电极保持了 GOD活性，并且对葡萄糖有较好催化性能。
图1是实施例1中样品的X射线衍射图；图2是实施例1中样品的透射电镜图；图3是实施例1与各对比例的循环伏安测试图；图4是实施例2的不同扫速下的循环伏安曲线测试图；图5是实施例3的不同PH下的循环伏安曲线测试图；图6是实施例4中不同浓度葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安测试图；图7是实施例5中饱和氧气、空气和氮气的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安测试图。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明。实施例1
(1)参考 pekala(journal of materials science，1989，24，3221-3227)报道的传统的制备方法制备炭气凝胶。炭气凝胶的制备将间苯二酚(R)、甲醛(F)和催化剂碳酸钠(C)以摩尔比1 2 500的比例混合，加入去离子水，使反应物浓度为(即间苯二酚 (R)和甲醛(F)占反应体系的质量分数)50%，在搅拌条件下溶解后，转移到密闭玻璃容器中，放入水浴锅中，在30°C下放置1 d，50°C放置1 d，85°C放置3d ；然后用丙酮置换出水溶剂， 每天置换一次，置换3d ；在常温常压下自然干燥；将干燥的RF凝胶研磨成粉末，放入管式炉中，在N2气氛下以2.5°C /min的速率升温至900°C，保温4h，自然降温后，得到的粉末为炭气凝胶。(2)用步骤(1)所得到的CA样品作模板，将CA样品、正丙醇锆、去离子水以质量比为1 1 25的比例混合，按& P的摩尔比为1 2，滴加入85%磷酸，搅拌2-4小时后转移到密闭的玻璃容器中，在85°C水浴锅中加热3d，过滤得到&P-CA粉末。(3)取步骤(2)得到的&P-CA粉末和GOD以质量比为1 4的比例放入样品管中， 用纯度为95%的乙醇溶解，使酶的浓度为％ig/ml，机械摇勻后，得到GOD/ZrP-CA悬浊液，放入4°C冰箱中过夜待用。(4)将GC (玻碳)电极用0.3 μ m和0.05 μ m的氧化铝打磨至光亮，然后用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥。用微量进样器取步骤(3)的悬浮液滴加到处理好的GC 电极表面，再滴加0. 1 % Nafion溶液，室温自然干燥，得到以&P-CA为载体的固定酶电极， 其中悬浮液的用量为每0. 1256cm2的GC8yL，0. 1 % Nafion溶液的用量为每0. 1256cm2的 GC2y L0(5)将上述所制备的电极在PH为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以lOOmv/s的扫速进行循环伏安测试。图1是实施例1所获得的载体&P-CA的X射线衍射图谱。从图中可以看出，样品衍射峰的峰强和峰宽基本一致，证明合成的样品中有磷酸锆。图2是实施例1中样品的透射电镜图。从图中可以看出样品实施例1中样品 &P-CA具有孔道结构，它们是由许多颗粒物堆积而成的，有利于酶的固定。图3是实施例1与各对比例的循环伏安测试图。表明实施例1和对比例1、2中三个样品制备得到的电极在0. IMPBS溶液中的循环伏安测试曲线，GOD/ZrP-CA电极的循环伏安曲线中出现一对氧化还原峰，由图比较可见只有G0D/ZrP-CA电极在-0. 4836V附近(相对于饱和甘汞电极)电位处出现一对GOD的活性中心的特征氧化还原峰，而其他的两种电极都没有任何峰出现。可见只有同时存在条件下，才可以使GOD的活性保持。实施例2(1)、O)、(3)、(4)同实施例 1(5)将上述所制备的电极在pH为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以扫描速度分别为 50、100、150、200、250、300mv/s 进行循环伏安测试。图4是实施例2的循环伏安曲线测试图.从图中可以看出制备电极的氧化还原峰电位不随扫描速度的改变而改变，峰电流随扫描速度的增大而增大，且呈线性关系，说明GOD的电化学反应不是扩散控制而是受表面控制，这进一步证明了 GOD很牢固地固定在 ZrP-CA/GC电极表面。另外，随着扫描速率的增加，阳极、阴极峰峰电位分别向正、负方向产生较小的偏移，ΔΕρ(峰位差)增加，但E°(式量电位)几乎不变。根据扫描速率与峰位差的关系，参考Laviron模型计算电子转移速率常数。其计算公式为Ks = mnFv/RT(其中m 为与峰峰之间分离相关的参数，η为转移电子数，F为法拉第常数，ν为扫描速率，R为气体常数，T为热力学温度)。根据公式计算出GOD/ZrP-CA/GC电极的Ks约为1. 8s—1，该结果大于文献报道的GOD固定在多壁碳纳米管(1.53^)和单壁碳纳米管(0.3^)修饰电极的电子转移速率。较高的电子转移速率显示了 GOD/ZrP-CA/GC电极上固定的GOD具有较快的电子传递过程，说明&P-CA/GC电极表面的微环境更有利于GOD的直接电子转移。实施例3(1)、O)、(3)、(4)同实施例 1(5)将上述所制备的电极在pH分别为6、6. 5、7、7. 5、8的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以lOOmv/s的扫描速度进行循环伏安测试。图5的结果分析可见GOD/ZrP-CA/GC电极的循环伏安行为在很大程度上受溶液的 PH值的影响。溶液pH值的增加通常会导致其氧化还原峰电位的负移。在pH = 6 8范围内，电位随着PH值的变化而线性变化，线性相关系数R = 0. 99769，求得斜率为49. 12mV/ pH，该数值与伴随有两电子两质子电极反应的理论值59mV/pH基本一致。实施例4(1)、O)、(3)、(4)同实施例 1(5)将上述所制备的电极分别在含有葡萄糖2、5、8、10、15、20mM，pH = 7. 0缓冲溶液中以lOOmv/s的扫描速度进行循环伏安测试。图6 为 G0D/ZrP-CA/GC 电极在分别含有葡萄糖 2、5、8、10、15、20mM，0. IM pH = 7 的PBS的溶液中进行的电化学性能测试结果，可以看出GOD/ZrP-CA电极的氧化峰电流随着葡萄糖浓度的增大而增大，还原峰电流随葡萄糖浓度的增大而减小，表明该方法固定的GOD 保持了较好的对葡萄糖的催化性能。实施例5(1)、O)、(3)、(4)同实施例 1(5)将上述所制备的电极分别在含有饱和氧气、空气和氮气的pH = 7. 0缓冲溶液中以lOOmv/s的扫描速度进行循环伏安测试。图7为G0D/ZrP-CA/GC电极在饱和氧气、空气和氮气的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安测试图。从图中可以看出，G0D/&P-CA电极的氧化峰电流随着氧气浓度的减少而增大。对比例1(1)同实施例1(2)取步骤(1)得到的CA粉末放入样品管中，加入95%的酒精为溶剂机械摇勻， 得到lmg/mlCA悬浊液，放入4°C冰箱中过夜待用。(3)将GC (玻碳)电极用0.3 μ m和0.05 μ m的氧化铝打磨至光亮，然后用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥。用微量进样器取步骤( 的悬浮液滴加到处理好的GC电极表面，再滴加0. 1 % Nafion溶液，室温自然干燥，得到以CA/GC电极，其中悬浮液的用量为每 0. 1256cm2 的 GC8 μ L,0. 1% Nafion 溶液的用量为每 0. 1256cm2 的 GC2 μ L。(4)将上述所制备的电极在pH分别为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以lOOmv/s的扫描速度进行循环伏安测试。图3(b)可以看出，电极的循环伏安曲线中没有出现氧化还原峰。
对比例2(1)、0)同实施例 1(3)取步骤⑵得到的&P-CA粉末用纯度为95%的乙醇溶解，机械摇勻后，得到 lmg/mlZrP-CA悬浊液，放入4°C冰箱中过夜待用。(4)将GC (玻碳)电极用0.3 μ m和0.05 μ m的氧化铝打磨至光亮，然后用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥。用微量进样器取步骤C3)的悬浮液滴加到处理好的GC电极表面，再滴加0. 1 % Nafion溶液，室温自然干燥，得到以&P-CA/GC电极，其中悬浮液的用量为每 0. 1256cm2 的 GC8 μ L,0. 1% Nafion 溶液的用量为每 0. 1256cm2 的 GC2 μ L。(5)将上述所制备的电极在ρΗ分别为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以lOOmv/s的扫描速度进行循环伏安测试。图3(c)可以看出，电极的循环伏安曲线中没有出现氧化还原峰。
权利要求
1.一种以&P-CA为载体的固定酶电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)制备炭气凝胶；(2)用步骤(1)所得到的CA样品作模板，将CA样品、正丙醇锆、去离子水以质量比为 1:1: 25的比例混合，按& P的摩尔比为1 2，滴加入85%磷酸，搅拌2-4小时后转移到密闭的玻璃容器中，在85°C水浴锅中加热3d，过滤得到&P-CA粉末；(3)取步骤(2)得到的&P-CA粉末和GOD以质量比为1 4的比例放入样品管中，用纯度为95%的乙醇溶解，使酶的浓度为％ig/ml，机械摇勻后，得到GOD/ZrP-CA悬浊液，放入 4°C冰箱中过夜待用；(4)将GC电极用0.3 μ m和0. 05 μ m的氧化铝打磨至光亮，然后用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥，用微量进样器取步骤C3)的悬浮液滴加到处理好的GC电极表面，再滴加 0. 1 % Nafion溶液，室温自然干燥，得到以&P-CA为载体的固定酶电极，其中悬浮液的用量为每 0. 1256cm2 的 GC8 μ L,0. 1% Nafion 溶液的用量为每 0. 1256cm2 的 GC2 μ L。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，制备炭气凝胶包括以下步骤将间苯二酚(R)、 甲醛(F)和催化剂碳酸钠(C)以摩尔比1 2 500的比例混合，加入去离子水，使间苯二酚(R)和甲醛(F)占反应体系的质量分数为50%，在搅拌条件下溶解后，转移到密闭玻璃容器中，放入水浴锅中，在30°C下放置ld，50°C放置ld，85°C放置3d ；然后用丙酮置换出水溶剂，每天置换一次，置换3d ；在常温常压下自然干燥；将干燥的RF凝胶研磨成粉末，放入管式炉中，在N2气氛下以2. 50C /min的速率升温至900°C，保温4h，自然降温后，得到的粉末为炭气凝胶。
全文摘要
本发明公开了一种以ZrP-CA为载体的固定酶电极的制备方法，属于材料科学技术领域。包括以下步骤制备炭气凝胶；将CA、正丙醇锆、去离子水以质量比为1∶1∶25的比例混合，按Zr∶P的摩尔比为1∶2，滴加入85％磷酸，搅拌后转移到密闭的玻璃容器中，在85℃水浴中加热3d；将质量比为1∶4的ZrP-CA粉末和GOD用纯度为95％的乙醇溶解，放入4℃冰箱中；将GC电极用氧化铝打磨，蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥，将悬浮液滴加到处理好的GC电极表面，再滴加0.1％Nafion溶液，室温自然干燥。本发明炭气凝胶的导电率高有利于电子传递，磷酸锆的生物相容性好有利于酶的固定，提高了酶的固定效果。
文档编号G01N27/327GK102323317SQ20111013870
公开日2012年1月18日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者于志辉, 任翠华, 夏定国 申请人:北京工业大学