专利名称：检测呋喃它酮代谢物的酶联免疫试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种检测动物组织(肌肉、肝脏)、水产品、蜂蜜中呋喃它酮代谢物的酶联免疫试剂盒及检测方法。
背景技术：
硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和 饲料中使用。由于硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，无法检测，但其代谢产物因和蛋白质结合而相当稳定，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃它酮作为硝基呋喃类药物的一种，代谢产物为AMOZ。目前用来检测硝基呋喃类代谢物的最常用方法是LC-UV、LC-MS和LC-MS/MS，与之相比，酶联免疫方法具有高精确度和灵敏度、较低的操作技术要求、短暂的检测时间、较大的检测样本量等特点，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种呋喃它酮代谢物的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适用于进行大批量样品筛查的定性、定量检测方法。本发明提供的呋喃它酮代谢物酶联免疫检测试剂盒，包括有包被有包被原的酶标板、呋喃它酮代谢物特异性抗体、酶标记物、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛，所述包被原为呋喃它酮代谢物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。本发明所提供的呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒，所述呋喃它酮代谢物抗原为呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。所述呋喃它酮代谢物特异性抗体为呋喃它酮代谢物单克隆抗体，是用呋喃它酮代谢物免疫原免疫动物得到的。所述呋喃它酮代谢物单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述呋喃它酮代谢物单克隆抗体优选为呋喃它酮代谢物鼠单克隆抗体。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。为了更方便的进行大量样本筛查和现场监控，所述试剂盒还包括标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛。所述标准品溶液为系列呋喃它酮代谢物标准品溶液，浓度分别为Oyg/L、O. 05μ g/L,0. 15yg/L、0.45yg/L、1.35yg/L、4.05yg/L，lmL/瓶。所述的终止液为 I 2mol/L的硫酸溶液，所述底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液，所述的浓缩洗涤液为含1% 2%吐温-20和O. 01% O. 05%的叠氮化钠防腐剂的O. 2 O. 4mol/LpH7. 6磷酸盐缓冲液，所述的浓缩复溶液为pH值为7. 3 7. 9，含有7% 9%酪蛋白、O. lmol/L的磷酸盐缓冲液。其中所述酶标板在制备过程中所用到的包被缓冲液为pH9. 4 9. 6的O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭缓冲液为PH7. 4的O. 05% O. 5%的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液。本发明酶标板的制备主要为用包被缓冲液将包被原稀释成O. 2 O. 3 μ g/ml，每孔加入150 μ 1，37°C避光孵育2h或4°C过夜，倾去孔中液体，洗涤液洗涤I 2次，拍干，每孔中加入150 μ I封闭液，37°C避光孵育2h，倾去孔中液体拍干，用铝膜真空密闭保存。本发明中包被原和免疫原的合成过程为1.半抗原合成(合成路线如图1) 2. OI g呋喃它酮代谢物(AMOZ)和20ml DMF的混合液，室温下缓慢滴加入
2.68-5. 36g对苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完毕后室温至60°C反应2_4小时，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色AMOZ衍生物。2.免疫原的合成(I)取呋喃它酮代谢物半抗原14mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取BSA40mg用6ml水溶解，得到溶液2。(3)将溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室温反应24h。(4)取 NaBH4Hmg 用 O. 2ml0.1MNaOH 溶解后中入溶液 3 中，4°C反应 2h。(5)用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。(6)分装，于-20°C保存备用。3.包被原的合成(I)取呋喃它酮代谢物半抗原12mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取OVA 36mg用7ml水溶解，得到溶液2。(3)将溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室温反应24h。(4)取 NaBH416mg 用 O. 2ml0.1MNaOH 溶解后中入溶液 3 中，4°C反应 2h。(5)用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。(6)分装，于_20°C保存备用。4.单克隆抗体的制备动物免疫呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Bal b/c小鼠。细胞融合与克隆化取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
本发明还提供了一种用呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒检测样品中呋喃它酮代谢物残留的方法，采用本方法对动物组织、水产品、蜂蜜样品中的呋喃它酮代谢物进行定性或定量检测，样本前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品，试剂盒具有很高的精确度和灵敏度，较低的操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点，主要步骤包括I)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；2)用酶联免疫试剂盒检测待测样品溶液；3)分析检测结果。
图1 :呋喃它酮代谢物半抗原合成2 :呋喃它酮代谢物标准曲线
具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。实施例一抗原、抗体及酶标记抗抗体的制备1.呋喃它酮代谢物半抗原的制备2. OI g呋喃它酮代谢物(AMOZ)和20ml DMF的混合液，室温下缓慢滴加入
2.68-5. 36g对苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完毕后室温至60°C反应2_4小时，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色AMOZ衍生物。2.免疫原的合成(I)取呋喃它酮代谢物半抗原14mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取BSA40mg用6ml水溶解，得到溶液2。(3)将溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室温反应24h。(4)取 NaBH4Hmg 用 O. 2ml0.1MNaOH 溶解后中入溶液 3 中，4°C反应 2h。(5)用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。(6)分装，于_20°C保存备用。3.包被原的合成(I)取呋喃它酮代谢物半抗原12mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取OVA 36mg用7ml水溶解，得到溶液2。(3)将溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室温反应24h。(4)取 NaBH416mg 用 O. 2ml0.1MNaOH 溶解后中入溶液 3 中，4°C反应 2h。(5)用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。(6)分装，于_20°C保存备用。4.酶标板的制备其中所述酶标板在制备过程中所用到的包被缓冲液为pH9. 4 9. 6的O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭缓冲液为PH7. 4的O. 05% O. 5%的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液。本发明酶标板的制备主要为用包被缓冲液将包被原稀释成O. 2 O. 3 μ g/ml，每孔加入150 μ 1，37°C避光孵育2h或4°C过夜，倾去孔中液体，洗涤液洗涤I 2次，拍干，每孔中加入150 μ I封闭液，37°C避光孵育2h，倾去孔中液体拍干，用铝膜真空密闭保存。5.羊抗鼠抗抗体的制备以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。6.酶标记羊抗鼠抗抗体(酶标记抗抗体)的制备 将辣根过氧化物酶与抗抗体采用改良后的过碘酸钠法进行偶联，省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；辣根过氧化物酶抗抗体的摩尔浓度比率为2 1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶的活性的损失减少。7.单克隆抗体的制备方法动物免疫呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Bal b/c小鼠。细胞融合与克隆化取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经筛选得到呋喃它酮代谢物的单克隆杂交瘤细胞株。呋喃它酮代谢物的单克隆杂交瘤细胞株可以无限量的产生呋喃它酮代谢物特异性抗体，该抗体特异性是针对呋喃它酮代谢物的，灵敏度达到O. 05 μ g/L。细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。实施例二 呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒各组分的组建组建呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒，包含下述各组分(I)包被有包被原的酶标板。(2)酶标记抗抗体辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗抗体。(3)呋喃它酮代谢物单克隆抗体工作液。(4)标准溶液采用梯度稀释法配制标准品溶液，得到系列标准品6瓶，浓度分别为 Ομ g/L、0. 05 μ g/L,O. 15 μ g/L,0. 45 μ g/L、1. 35 μ g/L,4. 05 μ g/L,以及高浓度标准品100 μ g/L，ImL/瓶。(5)底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液。(6)终止液为I 2mol/L的硫酸溶液。(7)浓缩洗涤液为含I % 2 %吐温-20和O. 01 % O. 05%的叠氮化钠防腐剂的O. 2 O. 4mol/LpH7. 6磷酸盐缓冲液。(8)浓缩复溶液为pH值为7. 3 7. 9，含有7% 9%酪蛋白、O. lmol/L的磷酸盐缓冲液。(9) 2-硝基苯甲醛。实施例三检测样本中呋喃它酮代谢物1.样本的前处理(I)组织(肌肉、肝脏和水产)样本前处理方法
称取1. Og均质物加入4ml去离子水、O. 5ml IM盐酸溶液(量取8. 3ml浓盐酸加入去离子水定容至100ml)和100 μ I衍生化试剂(向装有2_硝基苯甲醒的试剂瓶中加IOml甲醇溶解混匀(浓度为IOmM))，用振荡器充分振荡2min ;在37°C过夜孵育(大约16h);分别加入5ml0.1M磷酸氢二钾溶液(称取22. Sg三水合磷酸氢二钾加IL去离子水溶解混匀)、O. 4ml IM氢氧化钠溶液(称取4. Og氢氧化钠加IOOml去离子水溶解混匀)和5ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s ；3000g以上，室温(20-25°C /68-77° F)离心lOmin。取2. 5ml乙酸乙酯相至IOml干燥玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷(或正庚烷)，用涡旋仪涡动30s，再加入Iml复溶工作液(用去离子水将2X浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释)，用涡旋仪涡动Imin充分混匀；3000g以上，室温(20-25°C /68-77° F)离心IOmin ;除去上层有机相，取下层水相50 μ I用于分析。(2)蜂蜜前处理方法
称取1. Og蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml去离子水，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解，加入O. 5ml IM盐酸溶液和100 μ I衍生化试剂，用振荡器充分振荡，在37°C过夜孵育(大约16h);分别加入5ml O.1M磷酸氢二钾溶液、0.4ml IM氢氧化钠溶液和5ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s，3000g以上，室温(20-25°C /68-77° F)离心IOmin ；取2. 5ml乙酸乙酯相至IOml干燥玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；力口入Iml正己烷(或正庚烷)，用涡旋仪涡动30s，再加入Iml复溶工作液，用涡旋仪涡动Imin充分混匀，3000g以上，室温(20-25°C /68-77° F)离心IOmin ;除去上层有机相，取下层水相50 μ I用于分析。2.检测方法(I)准备使用之前将所有试剂和需用板条从冷藏环境中取出，置于室温(20-25°C )平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀，取出所需的微孔条，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8 °C。(2)编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。(3)加标准品/样本加标准品/样本50 μ I到对应的微孔中。(4)抗体工作液和酶标记抗抗体浓缩液的混合将抗体工作液和酶标记抗抗体浓缩液按10 I体积比混合并混匀。(注此混合液不能保存，混合均匀后立刻进行加样)(5)加抗体工作液和酶标记抗抗体浓缩液的混合液加抗体工作液和酶标记抗抗体浓缩液的混合液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30mino(6)洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液(用去离子水将20X浓缩洗涤液按1: 19体积比进行稀释)250μ I/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。(7)显色加入底物液A液50 μ I/孔，底物液B液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。(8)测定加入终止液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。3.检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即得到百分吸光率。以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋喃它酮代谢物标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图(如图2)。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋喃它酮代谢物实际浓度。实施例四呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒灵敏度、特异性、精密度和准确度、保存期实验1.试剂盒灵敏度测定按照常规方法测定试剂盒灵敏度试验，试剂盒标准曲线最低点为O. 05μ g/L，标准曲线的范围为O. 05 μ g/L 4. 05 μ g/L，在鸡肉、猪肉、鸡肝、虾、鱼、蜂蜜样本中呋喃它酮代谢物检测限为O.1 μ g/kgo
2.试剂盒准确度和精密度准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒的准确度常用回收率表示；精密度是反应测定方法对某一特定样品多次测定所得结果的重复程度，常用变异系数表示。分别向空白鸡肉、猪肉、鸡肝、虾、鱼、蜂蜜样本中添加呋喃它酮代谢物至终浓度为O. 2μ g/kg、O. 4 μ g/kg，重复5次，分别取三个批次的试剂盒计算变异系数，结果见下表。表I试剂盒的准确度和精密度测定
权利要求
1.一种呋喃它酮代谢物酶联免疫检测试剂盒，包括有包被有包被原的酶标板、呋喃它酮代谢物特异性抗体、酶标记物、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛，所述包被原为呋喃它酮代谢物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述呋喃它酮代谢物抗原为呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。
3.如权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于所述呋喃它酮代谢物半抗原的制备方法主要包括如下步骤2.Olg呋喃它酮代谢物(AMOZ)和20ml DMF的混合液，室温下缓慢滴加入2. 68-5. 36g对苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完毕后室温至60°C反应2-4小时，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色AMOZ衍生物。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的呋喃它酮代谢物特异性抗体为呋喃它酮代谢物单克隆抗体。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶；酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将标记酶与抗抗体偶联得到。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的终止液为I 2mol/L的硫酸溶液，所述底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的浓缩洗涤液为含I% 2%吐温-20和O. 01 % O. 05%的叠氮化钠防腐剂的O. 2 O. 4mol/LpH7. 6磷酸盐缓冲液，所述的浓缩复溶液为PH值为7. 3 7. 9，含有70Z0 9%酪蛋白、O. lmol/L的磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述标准品溶液浓度分别为Oμ g/L、O.05 μ g/L、0. 15 μ g/L、0. 45 μ g/L、1. 35 μ g/L、4. 05 μ g/L。
10.用权利要求1-9所述的呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒检测样品中呋喃它酮代谢物残留的方法，主要步骤包括1)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；2)用权利要求1-9任一项所述的酶联免疫试剂盒检测待测样品溶液；3)分析检测结果。
全文摘要
本发明提供一种检测呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒及其方法，酶联免疫试剂盒包括包被有包被原的酶标板、呋喃它酮代谢物特异性抗体、酶标记物、呋喃它酮代谢物标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，2-硝基苯甲醛。本发明还提供了一种呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒检测方法，主要包括先进行样本前处理，再用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明的检测试剂盒能够快速检测动物组织、水产品、蜂蜜中呋喃它酮代谢物药物，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高、费用低廉等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。
文档编号G01N33/577GK103018449SQ20111027908
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者何方洋, 孙震, 冯静, 冯才茂, 刘琳, 朱亮亮, 刘玉梅, 石洁 申请人:北京勤邦生物技术有限公司