专利名称：糖类的分析装置及分析方法
技术领域：
本发明涉及使用柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的还原糖的分离分析装置及使用该装置的分离分析方法，特别涉及在将经柱色谱分离的试样溶液与碱性氨基酸一起加热使它们反应的加热器和荧光检测器之间的流路上配置背压发生器的利用柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的还原糖的分离分析装置。
背景技术：
还原糖的分析法已知如下的方法将包含还原糖的试样置于使用含硼酸的水性溶液作为流动相的液相色谱仪中进行洗脱，在流路中，向洗脱液加入含精氨酸等碱性氨基酸的硼酸水溶液，进行加热反应后冷却，向该反应液照射激发光，测定荧光强度或吸光度(专利文献I)。其中使用的装置是将液相色谱仪的流出路延长，将含碱性氨基酸的硼酸水溶液的供给通路与该流路连接，还装有加热装置、冷却装置、激发光的照射装置、及荧光强 度等测定装置的装置。在该方法中，必须预先设置用于在来自液相色谱仪的洗脱液加入含碱性氨基酸的硼酸水溶液使其反应的供给通路。还有，作为上述方法的改良型已知如下的方法将包含还原糖的试样置于使用含有硼酸及作为反应试剂的精氨酸等碱性氨基酸的流动相的液相色谱仪中进行洗脱，在流路中，加热洗脱液使反应试剂和还原糖反应(加热反应)后冷却，向该反应液照射激发光，测定荧光强度或吸光度(专利文献2)。在该方法中，由于液相色谱仪的流动相使用含有碱性氨基酸的硼酸水溶液，无需设置用于其后在洗脱液中加入含碱性氨基酸的硼酸水溶液的供给通路。这些还原糖分析法被称为柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法。上述还原糖分析法都是将还原糖在硼酸存在下与精氨酸等碱性氨基酸经加热反应生成发出强荧光的衍生物的机理利用于从柱洗脱出的还原糖的检测(非专利文献I)。该发荧光衍生物是呈由还原糖与作为氨基化合物的碱性氨基酸的加热反应(美拉德反应)产生的褐色的褐色物质(黑精，melanoidin)，它如果受到作为激发光的波长320nm的光的照射，则放射波长430nm的光。此外，这些还原糖分析法还利用还原糖具有易与硼酸结合生成阴离子性络离子的性质，及该阴离子性络离子被保持于阴离子交换柱色谱。柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中，流动相使用含有O. 01 5%浓度的碱性氨基酸和O. 05 O. 5M浓度的硼酸的水溶液(pH7 10)。这时使用的碱性氨基酸是精氨酸，赖氨酸，组氨酸等。还已知，最近，作为液相色谱的流动相，使用由O. IM硼酸缓冲液及O. 4M硼酸缓冲液构成的梯度进行糖的分离(专利文献3、4)。柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中，液相色谱仪中的试样的洗脱在室温 70°C的温度下进行，此外加热反应(美拉德反应)在140 180°C下进行(专利文献2)。由于洗脱和反应在这样的高温下以高硼酸浓度进行，产生由热引起的流动相的膨胀，在流动相内的对流等。这些现象在柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中会成为由荧光检测器检测的荧光的噪声的原因，进而成为使检测灵敏度降低的原因。因此，利用相同的方法，在进行还原糖的分析，特别是其定量分析时，必须使用专用的软件修正检测结果。
可用柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法分析的还原糖是与碱性氨基酸发生美拉德反应的还原糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖，岩藻糖等单糖类，麦芽糖、麦芽三糖等低聚糖类，氨基葡萄糖、半乳糖胺等氨基糖类，葡萄糖醛酸等糖醛酸类等。作为该方法的分析对象，可例举来自于糖蛋白质的糖链的还原糖。构成糖蛋白质的糖链的还原糖有甘露糖、半乳糖、岩藻糖等单糖类，半乳糖胺等氨基糖类等。糖链有时还包含甘露糖-6-磷酸(M6P)。现有技术文献专利文献专利文献I日本专利特开昭58-216953号公报 专利文献2日本专利特开昭61-25059号公报专利文献3日本专利特开2006-184131号公报专利文献4日本专利特开2008-245550号公报非专利文献非专利文献I Mikami H.等，Bunseki Kagaku (分析化学)(1983) 32, E20
发明内容
在上述背景下，本发明的目的是，除去在柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中，因加热、冷却流路所产生的由荧光检测器检测的荧光的噪声，提高检测灵敏度。在面向上述目的的研究中，本发明者尝试在柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中，在将经柱色谱分离的试样溶液与碱性氨基酸一起加热以使它们反应的加热器与荧光检测器之间的流路上配置背压发生器。结果发现，通过配置背压发生器，可以除去由荧光检测器检测的荧光的噪声，可以提高检测灵敏度。本发明是基于这些发现完成的。S卩，本发明提供以下技术方案I.还原糖的分离分析装置，它是试样溶液中所含的还原糖的使用柱色谱的分离分析装置，包含阴离子交换树脂柱用于分离该试样溶液中所含的还原糖；加热器用于使来自该柱的洗脱液中所含的还原糖与碱性氨基酸反应；荧光检测器向通过该加热器反应后的该洗脱液连续地照射激发光并测定从该洗脱液放射的荧光的强度；设置于该加热器与该荧光检测器之间的背压发生器。2.上述I的还原糖的分离分析装置，其中，在该加热器与该背压发生器之间还设有冷却装置。3.使用上述I或2的装置的还原糖的分离分析方法，该方法包含将含还原糖的试样溶液负载于阴离子交换树脂柱并将足量的含有规定浓度的硼酸的水溶液即第I流动相通过该柱，藉此清洗柱，以规定的流速连续地向该柱供给相较第I流动相硼酸或水溶性无机盐的浓度高的硼酸水溶液即第2流动相，藉此将还原糖洗脱，将来自该柱的洗脱液连续地导入流路中，以规定速度向该洗脱液中连续地添加至少I种碱性氨基酸，将该添加后的洗脱液用规定的时间通过该流路的规定温度的加热器内，藉此将该混合溶液加热，将该加热后的混合溶液通过背压发生器后，记录该混合溶液的经荧光检测器测得的荧光强度。4.使用上述I或2的装置的还原糖的分离分析方法，该方法包含将含还原糖的试样溶液负载于阴离子交换树脂柱并将足量的含有规定浓度的至少I种碱性氨基酸和规定浓度的硼酸的水溶液即第I流动相通过该柱，藉此清洗柱，以规定的流速连续地向该柱供给相较第I流动相硼酸或水溶性无机盐的浓度高的硼酸水溶液即第2流动相，藉此将还原糖洗脱，将来自该柱的洗脱液连续地导入流路中，
将该洗脱液用规定的时间通过该流路的规定温度的加热器内，藉此将该洗脱液加
执，将该加热后的洗脱液通过背压发生器后，记录该洗脱液的经荧光检测器测得的荧光强度。5.上述3或4的方法，其中，还原糖包含甘露糖-6-磷酸。本发明通过在基于柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的还原糖的分析中除去噪声，可以提高检测灵敏度。因此，通过本发明的分离分析装置或分离分析方法，无需用专用软件对检测结果进行修正，可以直接使用，不仅简便，而且能够准确检测。
图I实施例的装置的配置及流路的示意图。图2表示未设置背压发生器时的还原糖标准溶液的分析结果的色谱图。纵轴表示荧光强度，横轴表示还原糖标准溶液负载完成后的经过时间(分钟)。a d的峰分别对应a:甘露糖，b:岩藻糖，c:半乳糖，d:M6P。图3表示设有背压发生器时的还原糖标准溶液的分析结果的色谱图(I)。纵轴、横轴及a d的峰同上。溶液B的制备所用的水溶性无机盐为氯化钠。图4表示设有背压发生器时的还原糖标准溶液的分析结果的色谱图(2)。纵轴，横轴及a d的峰同上。溶液B的制备所用的水溶性无机盐为，氯化钠(Na:虚线)及氯化钾(K:实线)。
具体实施例方式在本发明中，“硼酸水溶液”一词也包含为了适当调整pH而添加了少量的氢氧化钠(或硼酸钠)等这样的作为PH调节剂的碱或碱性盐的水溶液。在本发明中，硼酸水溶液的硼酸浓度是指该水溶液中的硼换算成硼酸(H3BO3)时的浓度。因此，也包含以(硼酸钠等)盐的形式添加的硼酸。在本发明中，柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的条件也包括上述现有技术文献中记载的条件，只要可以分离分析还原糖，可以没有特别限定地设定，例如能够以表I及表2所示的条件(I法及II法)进行。I法中无机盐(氯化钠)的浓度，II法中硼酸的浓度经时提高。在待分析的还原糖中含有M6P时，采用表I所示的I法或参照其的方法可以特别良好地分尚分析M6P。
表I柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的诸条件(I法及II法)
权利要求
1.还原糖的分离分析装置，它是试样溶液中所含的还原糖的使用柱色谱的分离分析装置，其特征在于，包含阴离子交换树脂柱用于分离该试样溶液中所含的还原糖；加热器用于使来自该柱的洗脱液中所含的还原糖与碱性氨基酸反应；荧光检测器向通过该加热器反应后的该洗脱液连续地照射激发光并测定从该洗脱液放射的荧光的强度；设置于该加热器与该荧光检测器之间的背压发生器。
2.如权利要求I所述的还原糖的分离分 析装置，其特征在于，在该加热器与该背压发生器之间还设有冷却装置。
3.使用权利要求I或2的装置的还原糖的分离分析方法，其特征在于，该方法包含将含还原糖的试样溶液负载于阴离子交换树脂柱并将足量的含有规定浓度的硼酸的水溶液即第I流动相通过该柱，藉此清洗柱， 以规定的流速连续地向该柱供给相较第I流动相硼酸或水溶性无机盐的浓度高的硼酸水溶液即第2流动相，藉此将还原糖洗脱， 将来自该柱的洗脱液连续地导入流路中， 以规定速度向该洗脱液中连续地添加至少I种碱性氨基酸， 将该添加后的洗脱液用规定的时间通过该流路的规定温度的加热器内，藉此将该混合溶液加热， 将该加热后的混合溶液通过背压发生器，然后， 记录该混合溶液的经荧光检测器测得的荧光强度。
4.使用权利要求I或2的装置的还原糖的分离分析方法，其特征在于，该方法包含将含还原糖的试样溶液负载于阴离子交换树脂柱，将足量的含有规定浓度的至少I种碱性氨基酸和规定浓度的硼酸的水溶液即第I流动相通过该柱，藉此清洗柱， 以规定的流速连续地向该柱供给相较第I流动相硼酸或水溶性无机盐的浓度高的硼酸水溶液即第2流动相，藉此将还原糖洗脱， 将来自该柱的洗脱液连续地导入流路中， 将该洗脱液用规定的时间通过该流路的规定温度的加热器内，藉此将该洗脱液加热， 将该加热后的洗脱液通过背压发生器后， 记录该洗脱液的经荧光检测器测得的荧光强度。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，还原糖包含甘露糖-6-磷酸。
全文摘要
揭示了使基于柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的还原糖的分析中提高分析灵敏度的分离方法及分析装置。该方法是还原糖的使用柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的分离分析方法，分离分析装置中，在将经柱色谱分离的试样溶液与碱性氨基酸一起加热使它们反应的加热器与荧光检测器之间的流路上配置背压发生器。
文档编号G01N30/88GK102859352SQ20118002111
公开日2013年1月2日 申请日期2011年4月25日 优先权日2010年4月28日
发明者横山哲雄 申请人:日本化学研究株式会社