专利名称：用于检测抗体的方法
用于检测抗体的方法本发明涉及检测抗药物抗体的方法。本发明还涉及对经历治疗性抗体治疗的患者进行监测的方法。本发明还涉及适用于执行上述方法的试剂盒。
背景技术：
治疗性抗体正越来越多地用于各种障碍例如免疫障碍、炎性障碍、癌症或传染病的治疗。这些治疗性抗体典型地是源自于各种物种的单克隆抗体或嵌合或人源化的抗体(参见例如Levene等,2005, J. Royal Soc. Med. 98, pp 145-152)。取决于具体疾病，已使用例如针对下列不同靶抗原的治疗性抗体TNF a，VEGF, HER2，CD20，IGF-I受体，EGFR或IL-6受体。抗TNF α治疗性抗体被广泛用于治疗患有各种炎性或自体免疫疾病的患者，所述 疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、克罗恩病或强直性脊柱炎。这样的抗TNFa药剂的实例包括依那西普(Etanercept )、戈利木单抗(Gol imumab)、赛妥珠单抗(Certolizumabpegol)、阿达木单抗(Adalimumab)或英夫利昔单抗(Infliximab)。依那西普是二聚体融合蛋白，其由与I型人类免疫球蛋白(IgGl)的Fe片段相连的人类p75 TNFa受体的两个细胞外结构域构成。戈利木单抗是人类抗TNF a单克隆抗体。赛妥珠单抗是单克隆抗体，更准确来说是人源化抗TNF a单克隆抗体的PEG化的Fab’片段。阿达木单抗是人源化抗TNF α单克隆抗体,英夫利昔单抗是嵌合的抗TNFa单克隆抗体(Perdriger Α,类风湿性关节炎治疗中的英夫利昔单抗(Infliximab in the treatment of rheumatoid arthritis),Biologies: Targets&Therapy 2009:3183-191)。这些抗体结合 TNF α 并阻断其炎性作用。治疗性抗体的其他实例包括但不限于W02004/096274中所公开的抗IL-6R单克隆抗体和在例如W02005/005635中所公开的抗IGF-IR抗体。然而，在使用治疗性抗体的治疗期间，可能产生针对治疗性抗体本身的免疫应答，患者通常在治疗过程中发展出针对药物本身的抗体(“抗药物抗体”)。结果，治疗性抗体的血浆水平降低，同时或随后，疾病症状重新出现或增加。因此，这些抗药物抗体(“ADA”)降低或完全中和了治疗性抗体的效果(参见例如Wolbink GJ等，抗英夫利昔单抗抗体的发生及其与患类风湿性关节炎患者中的临床响应的关系(Development of anti-Inflximabantibodies and relationship to clinical response in patients with rheumatoidarthritis), Arthritis&Rheumatism, 200654 (3) :711-715 ；G. M. Bartelds 等，对阿达木单抗治疗无响应的患者中高水平的针对阿达木单抗的人类抗体(High levels of humanantibodies to adalimumab in a patient not responding to adalimumab treatment),Anna Rheum Dis 2006;65:1249-1250)。因此，在来自于对象的样品中检测这些ADA可能代表了在治疗过程中监测患者的方法。用于检测ADA的方法在本技术领域中已有报道，例如在W02008/137885、W02007/101661或W02009/091240中。在这些应用中，方法是指使用捕获和标记抗体的免疫方法。关于ADA检测的其他方法和推荐已报道在Anthony R. Mire-Sluis等,Journal ofImmunological Methods, 333 (2008) 1-9 ；Eugen Koren 等，Journal of ImmunologicalMethods, 289 (2004)1-16 中。Wolbink 等(Arthritis&Rheumatism 54 (2006)711-715)还讨论了抗英夫利昔单抗抗体在类风湿性关节炎患者中的相关性。这些方法都没有提出同时评估ADA和相关抗原。这些方法都没有认识到各种参数的组合检测的相关性。Patton 等(J. Immunol. Methods 304 (2005) 189-195)涉及用于检测针对蛋白的抗体的ELISA方法。本发明涉及检测ADA和对经历治疗性抗体治疗的患者进行监测的改进方法。发明概述本发明提供了检测抗药物抗体的改进的免疫学方法。本发明还提供了对经历治疗性抗体治疗的患者进行监测的方法。本发明还涉及适用于执行上述方法的试剂盒。更具体来说，本发明的目的涉及在样品中(体外)对抗药物抗体(ADA)(的存在或量)进行免疫检测的方法，其中所述药物是针对靶抗原的治疗性抗体，所述方法包括
a)验证所述样品中所述抗原的存在；b)如果存在，中和所述样品中的所述抗原；以及c)对所述样品中所述ADA (的存在或量)进行免疫检测。本发明人发现，所述样品中所述抗原的存在显著妨碍了检测相应ADA的能力。因此，不存在这样的先期中和步骤，就不能获得样品中ADA的可靠检测。本发明的另一个目的是用于对样品中(体外)的抗药物抗体(ADA)进行免疫检测的方法，其中所述药物是针对靶抗原的治疗性抗体，所述方法包括a)处理所述样品以中和可能存在的所述抗原；以及b)对所述样品中所述ADA的存在或量进行免疫检测。本发明还涉及用于检测患者对治疗性抗体治疗的响应性的方法，其中治疗性抗体针对靶抗原，方法包括在来自于所述患者的样品中确定下列物质的存在或量-治疗性抗体，-抗原，以及-针对所述治疗性抗体的抗药物抗体；以获得患者概况，其中患者概况指示了对所述治疗的响应性。优选情况下，在上述方法中，如果样品中存在所述抗原，那么在对所述样品进行处理以中和所述抗原后执行另一个确定所述ADA的存在的步骤。因此，在优选实施方案中，本发明涉及检测患者对治疗性抗体治疗的响应性的方法，其中治疗性抗体针对靶抗原，方法包括(a)在来自于患者的样品中确定下列物质的存在或量-治疗性抗体，-抗原，以及-针对所述治疗性抗体的抗药物抗体；(b)如果在步骤(a)中在所述样品中检测到抗原，那么对对象的其他样品进行处理以中和所述抗原，并再次确定所述处理过的样品中所述ADA的存在，由此获得患者概况，其中患者概况指示了对所述治疗的响应性。所述方法优选在所述患者的治疗过程中的不同时间点执行，以便可以监测所述患者的响应性或所述治疗的效能，并且如果适合的话可以调整治疗。在另一个实施方案中，本发明还涉及用于检测患者对治疗性抗体治疗的响应性的方法，其中所述治疗性抗体针对TNF α ,所述方法包括在来自于所述患者的样品中确定无活性TNFa的存在或量,所述存在或量指示了患者对所述治疗的低或降低的响应性。在优选实施方案中，方法还包括确定治疗性抗体和针对所述治疗性抗体的抗药物抗体的存在或量，以获得患者概况，其中所述患者概况指示了对所述治疗的响应性。本发明还涉及用于治疗患者的方法,所述方法包括向所述患者给药有效量的针对靶抗原的治疗性抗体，并如上所公开的评估患者对所述治疗性抗体治疗的响应性。本发明的另一个目的涉及一种试剂盒，其包含用于检测样品中下列物质的存在或量的试剂-针对靶抗原的治疗性抗体，-所述抗原，以及-针对所述治疗性抗体的抗药物抗体。 所述方法优选通过ELISA或免疫捕获来进行,所述抗原优选为TNF α。
图I :ADA定量。HRP :辣根过氧化物酶；SA :链亲合素；B :生物素。图2 :抗原对ADA测定的影响。图3:TNFa 定量。图4 :抗TNF a抗体的定量。图5:患者监测。图6 :代表性监测分值。发明详述本发明涉及用于检测ADA和对经历治疗性抗体治疗的患者进行监测的组合物、试剂盒和方法。本发明公开了提供可靠数据和信息的改进的ADA检测方法。本发明人显示，对样品进行预处理以中和样品中存在的任何抗原，对于做出可靠的ADA评估来说是必需的。本发明人还证实，在来自于对象的样品中同时测定三种参数(ADA、抗原、药物)，提供了患者演变和对治疗的响应的预测性概况。因此，本发明提供了对经历治疗性抗体治疗的患者进行监测的有效方法，并允许正确有效地调整治疗方式。通过参考下面的定义，将能最好地理解本发明定义本发明的术语“治疗性抗体”是指可以作为活性药剂给药于对象的任何抗体。这样的治疗性抗体的具体实例是在炎性障碍例如类风湿性关节炎或骨关节炎的治疗中使用的抗体。具体来说，它们包括抗TNFa抗体。术语“治疗性抗体”还包括选择性结合祀抗原的抗体衍生物或抗原特异性配体分子，例如抗体Fab片段或抗体Fe片段、合成受体、可溶性受体等。术语“ADA”或“抗药物抗体”是指在对象中结合于治疗性抗体的抗体。ADA可以结合治疗性抗体中的各种表位，包括可变区或恒定区。当在本文中使用时，术语“对象”或“患者”是指任何哺乳动物对象或患者，优选为人类对象或患者。当在本文中使用时，术语“组合”测定是指同时或相继地在样品中评估特定标志物。同时评估不是必需的，尽管是优选并且更方便的。术语“样品”是指怀疑含有抗体的任何样品。该术语优选表示生物学流体例如血清、血浆或全血，或其衍生物(例如由生物学流体的稀释、预处理、富集、裂解等产生的)。样品优选为血浆、血液或血清样品或其稀释液。ADA测丨定本发明涉及用于测定样品中的ADA的改进方法。本发明的这一方面尤其源自于下述发现，即抗原本身影响样品中ADA的定量测定。正如在实验部分中所显示的，当被测试样品中存在抗原时，ADA的实测量被明显高估，使测试无用且不可靠。本发明显示，通过首先中和样品中的抗原，可以获得可靠的测量。因此，本发明涉及用于对样品中(体外)的抗药物抗体(ADA)进行免疫检测的方法，其中所述药物是针对靶抗原的治疗性抗体，所述方法包括 a)验证所述样品中所述抗原的存在；b)如果存在，中和所述样品中的所述抗原；以及c)对所述样品中所述ADA的存在或量进行免疫检测。本发明还涉及用于对样品中的抗药物抗体(ADA)进行免疫检测的方法，其中所述药物是针对靶抗原的治疗性抗体，所述方法包括a)处理所述样品以中和可能存在的抗原；以及b)对所述样品中所述ADA的存在或量进行免疫检测。所述中和抗原的步骤可以通过不同技术来执行。优选情况下，通过样品的酸处理(一般随后中和所述酸)、通过贫化或捕获样品中的抗原或通过免疫中和来中和所述抗原。对于酸处理来说，优选对样品进行处理以将pH降低到4以下，更优选降低到约2. 5至3. 5之间的范围内。这可以通过在反应之前，在适合于将pH降低到上述优选范围的条件(例如浓度和强度)下，向所述样品加入酸溶液来实现。适合的酸的实例包括羧酸例如乙酸、盐酸或硫酸。优选情况下，在酸处理后，在检测ADA之前，将样品的pH至少部分中和。这种中和可以通过向所述样品加入碱溶液来获得。因此，酸处理典型地包括-在反应之前向样品加入酸溶液，以将pH降低至约4以下；-将酸化样品在室温下温育；以及-在反应之前向酸化样品加入碱溶液例如TRIS缓冲液或磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，以中和所述酸并将PH恢复至4以上，典型在5至9之间，更典型在6至8之间。也可以使用任何适合的亲和试剂通过捕获或贫化来中和抗原。典型情况下，将样品与包被有或含有特异性针对抗原的结合试剂的支撑物相接触。在通过或进行接触后，抗原被支撑物固定或持留，并且收集到的或得到的样品基本上不含游离抗原。样品可以通过包被有特异性针对抗原的抗体的柱子进行处理。可选地，可以向样品加入包被有这样的抗体的珠子，并任选随后从介质中分离或移除所述珠子。免疫中和可以通过单克隆或多克隆抗体来执行。在优选实施方案中，通过酸处理来中和抗原。ADA的免疫检测可以通过不同的免疫测定法类型或平台来执行，其包括但不限于ELISA、免疫捕获、微阵列(蛋白质芯片)、流式细胞术(包括例如Fidis)或多重点(multiplexdot) ο在优选实施方案中，ADA通过ELISA或免疫捕获进行免疫检测。在这样的方法中，将捕获试剂固定在支撑物上，将被测试样品沉积在支撑物上，并且支撑物与样品的ADA之间的免疫复合物的形成，如果存在的话，使用示踪试剂来测量。典型情况下，为了测定ADA，包被或固定的捕获试剂是药物本身(即治疗性抗体)。示踪试剂可以是任何抗ADA或ADA特异性试剂，例如抗体(例如山羊或兔抗人类Ig抗体)或也是药物。示踪试剂可以本身被标记，或者可以通过揭示剂(链亲合素/生物素；过氧化物酶；酶标记物、发光标记物等)检测。在特定实施方案中，捕获试剂是药物本身，示踪试剂是生物素化的药物，其可以在与标记的链亲合素温育后检测(参见图I)。捕获试剂可以通过在本技术领域中本身已知的各种技术固定在支撑物上，所述技术例如但不限于吸附、物理联结或化学键合。化学键合可以例如通过待固定试剂(例如药物或抗体)的N-端和/或侧链氨基和/或通过所述试剂的酚官能团或糖醇基团来实现。·支撑物可以是任何适合的装置，例如板(例如多孔滴定板)、载玻片、盘、管、柱等。支撑物也可以由珠子制成。在另一个实施方案中，反应在溶液中执行。在这种实施方案中，试剂不固定在支撑物上，而是直接在溶液中混合。正如在实验部分中说明的，在按照本发明处理的样品中测量到的ADA水平是可靠和稳定的，而不进行预处理以中和抗原时，获得的值是错误和不可靠的(参见图2)。本发明特别适合于评估对象中针对抗TNF药物的ADA的存在。更具体来说，本发明特别适合于检测针对抗TNF α治疗性抗体的ADA，所述治疗性抗体包括但不限于英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、戈利木单抗和赛妥珠单抗。患者监测丨抗药物抗体(“ADA”)削弱、降低或中和治疗性抗体的效应。因此，在来自于对象的样品中检测这些ADA，代表了在治疗过程中对患者进行监测的方法以及改进疗法的方法。当ADA滴度增加时，可以预期药物的治疗性效果将降低或被中和。因此在这样的情形中，推荐改变治疗方案，例如使用不同药物。因此，在具体情况下，本发明涉及用于检测患者对治疗性抗体治疗的响应性的方法，所述方法包括使用上面描述的方法，在来自于患者的样品中确定针对所述治疗性抗体的抗药物抗体的存在或量；样品中ADA的存在或增加指示了对象响应性的丧失。在另一种情况下，本发明涉及对经历治疗性抗体治疗的患者进行监测的方法，所述方法包括使用上面描述的方法，在来自于患者的样品中确定针对所述治疗性抗体的抗药物抗体的存在或量；样品中ADA的存在或与参比值或在治疗的较早阶段测定的值相比的增加，指示了对象对治疗的响应性的丧失。根据本发明，为了监测对象或评估对象的响应性，更优选的是不仅测量ADA，而且测量样品中的药物和抗原。事实上，本申请显示，这样的组合测定提供了对象状态的预测性指示。因此，本发明还涉及用于检测患者对治疗性抗体治疗的响应性的方法，其中所述治疗性抗体针对靶抗原，所述方法包括在来自于患者的样品中确定下列物质的存在或量-治疗性抗体，
-抗原，以及-针对所述治疗性抗体的抗药物抗体；以获得患者概况，其中所述患者概况指示了对所述治疗的响应性。正如在本发明中提到的，优选情况下，ADA测定应该在对样品进行处理以中和抗原之后做出。因此，在上述方法中，如果在样品中检测到抗原，那么在处理样品以中和抗原之后执行另一个确定所述ADA的存在的步骤。当ADA水平和/或抗原水平增加至超过参比值，或者与在治疗的较早阶段时在对象中测定的值相比增加时，以及当治疗性抗体水平降低至低于参比值，或者与在治疗的较早阶段时在对象中测定的值相比降低时，可以推断出患者对治疗的响应不再良好，并且治疗应该被改变。监测评分也可以如下文所公开的使用，以从测量值直接推断出治疗是否仍适用于患者。·
方法优选在患者治疗过程中的不同时间点执行，以便可以监测患者的响应性或治疗的效能，以及如果适合的话，可以调整治疗。在特定实施方案中，可以在每次治疗性抗体给药之前执行检测。可选地，检测可以以一个月的间隔时间执行三次。对于已接受长时间(例如9个月或以上)治疗性抗体治疗的对象来说，单次本发明的检测就足以将患者定性为响应者或非响应者。图5显示了概况如何指示患者的响应性以及治疗何时应该被当作无效并进行改变。正如可以从图5确定的，可以分辨出三种主要情况TO :对象患病并且未治疗。T1-T2 :对象接受治疗并对治疗有响应。本发明人所测试的样品显示，大多数治疗的患者属于该类别。从T3起对象接受治疗但是没有响应。治疗性抗体被ADA中和。治疗无效并且应该改变。治疗性抗体、抗原和ADA可以通过不同技术测量，所述技术包括任何免疫测定方法，例如ELISA、免疫捕获、微阵列(蛋白质芯片)、流式细胞术(包括例如Fidis)或多重点，正如上面对ADA测定所公开的。典型情况下，所有三种标志物同时进行测试(例如在同一装置上)。然而，测定可以分开或相继做出。本发明特别适合于监测经历抗TNFa治疗的患者。这样的患者典型地患有自体免疫或炎性疾病，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩、牛皮癣等。监测允许定期评估治疗效能，并能使医生决定治疗是可以继续进行还是应该改变。就此而言，优选通过评估对象中TNF a、ADA和抗TNF α治疗性抗体的水平来做出评估。获得的值可以是定性或定量的。它们可以与参比值或同一患者在治疗的较早阶段所登记的水平进行比较。在特定实施方案中，使用“评分表”对值进行评估，所述评分表允许对患者进行直接监测。在第一步中，如前所公开的对来自于患者的样品进行测试，以定量3种标志物TNF α、抗TNF α抗体和ADA的水平。在第二步中，使用“评分表”将每种参数的等级与评分相关联。然后获得监测的总体评分，其由每种参数的评分之和构成监测评分=TNFa评分+抗TNF抗体评分+ADA评分。然后可以将监测评分与监测量表进行比较(或使用监测量表读数)，提供对象的状态。就此而言，本发明人建立了适用于评估上述标志物值的监测量表。与抗TNF疗法相关的这些量表提供在下面。其他评分量表在实施例中公开用于每种参数的评分表
权利要求
1.一种用于对样品中的抗药物抗体(ADA)进行免疫检测的方法，其中药物是针对靶抗原的治疗性抗体，所述方法包括 a)验证样品中抗原的存在； b)如果存在，中和样品中的抗原；以及 c)对所述样品中所述ADA的存在或量进行免疫检测。
2.一种用于检测患者对治疗性抗体治疗的响应性的方法，其中治疗性抗体针对靶抗原，所述方法包括在来自于患者的样品中确定下列物质的存在或量 -治疗性抗体， -抗原，以及 -针对所述治疗性抗体的抗药物抗体； 以获得患者概况，其中患者概况指示了对所述治疗的响应性。
3.权利要求2的方法，其中所述确定通过免疫测定法、优选通过ELISA或免疫捕获来执行。
4.权利要求I至3任一项的方法，其中所述抗原是TNFa。
5.权利要求4的方法，其中药物是选自英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、戈利木单抗和赛妥珠单抗的抗TNF a抗体。
6.权利要求2至5任一项的方法，其中患者患有自体免疫或炎性疾病。
7.权利要求2至6任一项的方法，其还包括在来自于所述患者的样品中确定C反应性蛋白(CRP)的存在或量或红细胞沉降速率(ESR)。
8.权利要求2至7任一项的方法，其用于监测或调整患者的治疗。
9.权利要求I至8任一项的方法，其中样品是体液样品，优选为血清或血浆样品。
10.权利要求8的方法，其用于监测正经历抗TNFa治疗的患者，所述方法包括在来自于患者的样品中确定下列物质的存在或量 -治疗性抗体， -抗原，以及 -针对所述治疗性抗体的抗药物抗体； 以获得患者概况，其中患者概况指示患者是否对治疗有响应，允许对治疗进行调整。
11.权利要求10的方法，其中如果TNFa的水平低于10pg/ml，治疗性抗体水平高于I μ g/ml，并且ADA水平低于50ng/ml，则患者是有响应的并且治疗应该继续乃至减少。
12.前述权利要求任一项的方法，其中检测无活性TNFa的水平。
13.权利要求12的方法，其中如果无活性TNFa的水平超过10pg/ml，则患者对所述治疗无响应。
14.一种用于检测患者对治疗性抗体治疗的响应性的方法，其中治疗性抗体针对TNF a，所述方法包括在来自于所述患者的样品中确定无活性TNF a的存在或量，所述存在或量指示了所述患者对所述治疗的低或降低的响应性。
15.一种用于对经历抗TNF a治疗的患者进行监测的方法，所述方法包括在来自于所述患者的样品中确定无活性TNF a的存在或量,所述存在或量指示了所述患者对所述治疗的响应性。
16.一种试剂盒，其包含用于检测样品中下列物质的存在或量的试剂-针对靶抗原的治疗性抗体，-所述抗原，以及 -针对所述治疗性抗体的抗药物抗体。
全文摘要
本发明涉及检测抗药物抗体的方法。本发明还涉及对正经历治疗性抗体治疗的患者进行监测的方法。本发明还涉及适用于执行上述方法的试剂盒。
文档编号G01N33/68GK102884433SQ201180021505
公开日2013年1月16日 申请日期2011年4月28日 优先权日2010年4月29日
发明者埃尔米斯·帕鲁西尼, 纪尧姆·诺吉耶 申请人:塞拉蒂亚戈公司