使用发光探针检测溶液中稀疏颗粒的方法

专利名称：使用发光探针检测溶液中稀疏颗粒的方法
技术领域：
本发明涉及光学分析方法，其通过使用可检测源自溶液中的微小区域的光的光学系统如共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在诸如分散或溶解于溶液中的原子、分子或其聚集体(下文中，这些称为“颗粒”)例如生物分子如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或这些的聚集体、病毒和细胞等粒状对象，或者非生物颗粒的状态(相互作用、结合或解离状态等)的分析中获得有用信息，更具体地，涉及借助发光探针进行溶液中粒状对象的检测、其浓度或其数密度的测定等的方法。具体而言，在本说明书中，“发光探针”为通过荧光、磷光、化学发光、生物发光、光散射等发光，并结合至要成为观测对象物的颗粒以能够观测所述颗粒的物质。
背景技术：
根据近年来光学测量技术的发展，通过使用共焦显微镜光学系统和能够计数光子 (单一光子检测)的超高灵敏光检测技术已变得能够在单一光子或单一荧光分子水平下检测和/或测量微光。因此，存在借助此类微光测量技术进行生物分子等的分子间相互作用、结合或解离反应的检测的各种提议的装置或方法。例如，在借助激光共焦显微镜光学系统和光子计数技术的突光相关光谱学(fluorescence correlation spectroscopy, FCS,参见例如专利文献I和2和非专利文献1-3)中，对进出试样溶液的微小区域(显微镜的激光集中的聚焦区域，称为“共焦体积(confocal volume)”)的荧光分子或荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度进行测量，并基于由所测量的荧光强度的自相关函数值来确定的荧光分子等的平均滞留时间(dwell time)(平移扩散时间)和微小区域中滞留分子数的平均值，实现了信息如荧光分子的移动速度、大小或浓度等的获得，和/或各种现象如分子结构或大小的变化、分子的结合或解离反应或者分散和凝集的检测。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis, FIDA,例如专利文献3)或光子计数直方图(Photon Counting Histogram, PCH,例如专利文献4)中，生成有与FCS类似测量的进出共焦体积的荧光分子等的荧光强度的直方图，通过将统计学模型公式拟合(fitting)为直方图的分布来计算荧光分子等的固有亮度的平均值和滞留在共焦体积中的分子的平均数，从而基于这些信息，可估计分子的结构或大小的变化、结合或解离状态或分散和凝集状态。此外，在专利文献5和6中，提出了基于使用共焦显微镜光学系统测量试样溶液的荧光信号的时间经过(time progress)来检测突光物质的方法。专利文献7已提出了通过光子计数技术测量从流经流式细胞仪的荧光细颗粒或固定在基板上的荧光细颗粒的微光以检测流路中或基板上荧光细颗粒的存在的信号计算处理技术。特别地，根据采用使用共焦显微镜光学系统和光子计数技术如FCS和FIDA对微小区域的荧光测量技术的方法，测量所需的试样量可极小(用于一次测量的量至多几十μ L)，与现有技术相比其浓度极低，测量时间也大幅缩短(在一个实施方案中，重复几次时间为秒级的测量过程)。因此，期望这些技术，特别是在进行通常用于医学或生物学研究和开发领域中的稀有或昂贵的试样的分析时，或在进行如病的临床诊断或生物活性物质筛选等的大量试样的试验时，与常规生物化学方法相比，能够以低成本和/或快速地实验或检查的强有力的工具。现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特开2005-098876
专利文献2 日本专利特开2008-292371
专利文献3 日本专利4023523
专利文献4 W02008-080417
专利文献5 日本专利特开2007-20565
专利文献6 日本专利特开2008-116440
专利文献7 日本专利特开平4-337446
非专利文献
非专利文献 I Masataka Kaneshiro; “Protein, Nucleic acid, Enzymelo1. 44，Nο.9，1431-1438 页，1999
非专利文献 2 F.J.Meyer-Alms; “Fluorescence CorrelationSpectroscopy” edt. R. Rigler, Springer, Berlin, 204-224 页,2000
非专利文献 3 :Noriko Kato, et al. “Gene medicine”，Vol. 6，No. 2，271-277 页
非专利文献 4 S . Sando and E. T. Kool, J. Amer. Chem.
Soc,2002，Vol. 124，2096-2097 页

发明内容
发明要解决的问题简言之，在上述光学分析技术如FCS、FIDA和PCH中，通过统计程序来计算所测荧光强度的时间波动的量级，然后基于波动量级确定进出试样溶液中的微小区域的荧光分子等的各种特性。因此，为了获得上述光学分析技术的显著性结果，可优选将要成为试样溶液中的观测对象物的荧光分子等的浓度或数密度制备为在平衡状态下时长为秒级的一次测量中，使能够进行统计学处理的数量的荧光分子等进出微小区域，优选使约一个荧光分子等总是存在于微小区域中(典型地，由于共焦体积的体积约为lfL，可优选荧光分子等的浓度约为InM以上。)。换言之，当试样溶液中观测颗粒的浓度或数密度远远低于能够进行统计学处理的水平(例如，远低于InM)时，将发生在测量中观测对象物很少进入微小区域的状态，因此，荧光强度的测量结果将包括长期在微小区域中根本没有观测对象物存在的状态，以及显著荧光强度的观测量将减少，因而在基于如上所述荧光强度的统计学波动的光学分析技术中不能期望显著或精确的分析结果。在记载于专利文献5和6中的使用共焦显微镜的光学系统检测荧光物质的方法中，在不进行如上所述的荧光强度波动的统计学处理的情况下，试样中观测的荧光分子等的存在与否可由几秒的测量中具有显著强度的荧光信号产生与否来确定，并公开获得具有显著强度的荧光信号的频率与试样中荧光分子等的数量之间的关系。特别地，在专利文献6中，教导搅动试样溶液内部的不规则流动的产生改善了检测灵敏度。然而，即使在那些方法中，也只是检测通过扩散或不规则流动而随机进入微小区域的荧光分子等的存在，而不能掌握微小区域中的荧光分子等颗粒的行为，因此，例如还未实现颗粒计数或颗粒的浓度或数密度的定量计算。此外，专利文献7中所记载的技术为单独检测在流式细胞仪的流路(flow)中的荧光细颗粒或固定在基板上的荧光细颗粒的存在，而不是检测颗粒如通常状态下溶解或分散在试样溶液中的分子和胶体，即在试样溶液中随机运动的颗粒的技术，因此，还未实现定量计算出溶解或分散在试样溶液中的颗粒的浓度或数密度。另外，由于专利文献7的技术包括例如在流式细胞仪中测量或将荧光颗粒固定在基板上的处理的方法，试验所必需的试样量与光学分析技术如FCS、FIDA和PCH相比大幅增加，并且对进行试验的人员可要求复杂高级的操作技术。然后，为了在进行光学分析技术如FCS、FIDA和PCH时不使用统计学处理，由此实现在要观测颗粒的浓度或数密度低于前述光学分析技术中所使用的水平的试样溶液中观测的颗粒的状态或特性的检测。本申请的申请人在日本专利申请2010-04714和PCR/JP2011/53481中的新原理的基础上提出对观测颗粒进行观测的光学分析技术。简言之，在该新的光学分析技术中，使用能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，如类似于FCS、FIDA等的共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，另外，微小区域的位置即光检测区 域在试样溶液中移动，即用微小区域扫描试样溶液内部，并且当发光的颗粒(下文称作“发光颗粒”)在试样溶液中分散并随机运动，横穿微小区域的内部时，检测微小区域中从发光颗粒发出的光，从而单独检测出试样溶液中的各发光颗粒，以便变得能够进行发光颗粒的计数并获取关于试样溶液中发光颗粒的浓度和数密度的信息。根据该新型光学分析技术(此后称为“扫描分子计数法”)，类似于光学分析技术如FCS、FIDA和PCH，测量所必需的试样量少(例如，约几十μ L)，测量时间短，此外，与光学分析技术如FCS、FIDA和PCH的情况相比，变得能够在较低浓度或数密度下定量检测性质如发光颗粒的浓度或数密度。为了进一步开发上述专利申请2010-044714中提出的扫描分子计数法，本发明的主要目的为提出借助发光探针有利地采用特别用于观察试样溶液中分散并随机运动的颗粒的扫描分子计数法的方法。用于解决问题的方案根据本发明，提供一种光学分析方法，其通过使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自结合至在试样溶液中分散并随机运动的颗粒的发光探针的光从而检测颗粒，所述光学分析方法的特征在于包括以下步骤制备包含所述颗粒和所述发光探针的试样溶液；通过改变光学系统的光学通路而在所述试样溶液中移动所述光学系统的光检测区域的位置；在所述试样溶液中移动所述光检测区域的位置的过程中，检测来自所述光检测区域的光；和在所述检测光中单独检测来自结合至各所述颗粒的所述发光探针的光信号从而单独检测所述颗粒。在该结构中，“在试样溶液中分散并随机运动的颗粒”为诸如在试样溶液中分散或溶解的原子、分子或其聚集体等的颗粒(所述颗粒可为发光颗粒或不发光颗粒任一种)，其也可为在溶液中自由地进行布朗运动而不固定在基板等上的任意粒状物质。另外，“发光探针”为具有结合至要成为观测对象的颗粒或与之缔合，并发光的特性的物质(通常为分子或其聚集体)，典型地，其为荧光颗粒，但可为通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等发光的颗粒。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”为在这些显微镜中检测光的微小区域，所述区域对应于当照明光从物镜给出时照明光聚集的区域。在这一点上，特别是在共焦显微镜中，根据物镜与针孔(pinhole)的空间关系来确定该区域。对于没有照明光而发光的发光探针，例如根据化学发光或生物发光而发光的分子或其聚集体，在显微镜中不需要照明光。就这一点而言，在本说明书中，除另有说明以外，“光信号”是指“表示来自已结合至颗粒的发光探针的光的信号”。如上述所理解的，在本发明的基本结构中，首先，在通过任意方法制备其中混合了要检测的颗粒和结合至颗粒的发光探针的试样溶液后，在试样溶液中移动光检测区域的位置的同时，即用光检测区域扫描试样溶液的内部的同时，顺次进行光的检测。然后，当移动光检测区域包括随机运动的已结合至颗粒或与颗粒缔合的发光探针时，通过光检测部检测来自发光探针的光，从而检测一个颗粒的存在。(依赖于实验方式，发光探针可能在检测光时从发光探针曾结合的颗粒中解离)。另外，在顺次检测的光中，单独检测来自发光探针的光信号，从而逐个顺次检测(已结合至发光探针)颗粒的单独存在，因而将获取溶液中颗粒状态的各种信息。具体地，例如在上述结构中，可通过计数单独检测颗粒的数量来计数在光检测区域的位置移动过程中所检测的颗粒的数量(颗粒的计数)。根据该结构，通过将颗粒·的数量与光检测区域的位置的移动量相关联，将获取试样溶液中颗粒的数密度或浓度的信息。特别地，通过借助任意方法，例如借助在预定速度下移动光检测区域的位置来确定光检测区域的位置的移动轨迹的整个体积，可具体计算颗粒的数密度或浓度。当然，代替直接确定绝对数密度值或浓度值，可计算与多个试样溶液或作为浓度或数密度的参考的标准试样溶液对应的数密度或浓度的相对比。此外，在上述本发明中，由于通过改变光学系统的光路来移动光检测区域的位置，所以光检测区域的移动快速，而实质上不发生在试样溶液中的机械振动和流体动力效应，因而可在稳定状态下进行光测量，而不影响要检测颗粒的动力学作用(试样溶液中的振动和流动作用可改变颗粒的性质)。另外，由于不需要使试样溶液流动的结构，因此与FCS和FIDA等相类似可用少量试样溶液(在一至几十μ L的水平下)来进行测量和分析。在上述本发明的方法中单独检测颗粒的步骤中，已结合至一个颗粒的发光探针(依赖于实验方式，包括一个发光探针已结合至一个颗粒的情况，两个或更多个发光探针已结合至一个颗粒的情况以及已结合至一个颗粒的发光探针从颗粒中解离的情况；以下均相同)是否已进入了光检测区域的判定可由顺次检测的光信号基于时间序列中所检测的光信号的形状来进行。在实施方案中，典型地，可设计为当检测具有比预设阈值大的强度的光信号时，检测到一个已结合至颗粒的发光探针已进入了光检测区域。此外，在移动光检测区域的位置的上述步骤中，基于已结合至试样溶液中的颗粒的发光探针的特性或数密度或浓度而适当地改变试样溶液中光检测区域的位置的移动速度。如本领域普通技术人员所理解的，可根据已结合至颗粒的发光探针在试样溶液中的特性、数密度或浓度而改变来自该发光探针的光的检测条件。特别地，当光检测区域的移动速度变快时，从已结合至颗粒的一个发光探针所获得的光的量将减少，因此优选可适当地改变光检测区域的移动速度，以便可精确或在足够灵敏度下测量来自一个已结合至颗粒的发光探针的光。此外，在移动光检测区域的位置的上述步骤中，优选将试样溶液中光检测区域的位置的移动速度设定为比已结合至作为检测对象的颗粒的发光探针(即，依赖于实验方式，颗粒和发光探针的结合体(combination),或在已结合至颗粒后从颗粒解离的发光探针)的扩散移动速度(由于布朗运动引起的颗粒的平均移动速度)高。如上所解释的，在本发明的方法中，当光检测区域穿过已结合至颗粒的发光探针存在的位置时，检测来自发光探针的光，以便将单独检测发光探针。然而，当已结合至颗粒的发光探针由于布朗运动而随机移动，以致多次进出光检测区域时，将多次检测来自一个已结合至颗粒的发光探针的光信号(显示要检测颗粒的存在)，因此，将变得难以使一个要检测的颗粒的存在与所检测光信号相关联。那么，如上所述，将光检测区域的移动速度设定为高于已结合至颗粒的发光探针的扩散移动速度，从而变得能够将一个已结合至颗粒的发光探针与一个发光信号(表示颗粒的存在)相对应。就这一点而言，由于扩散移动速度依赖于已结合至颗粒的发光探针而不同，因此如上所述，优选可根据已结合至颗粒的发光探针的特性(特别是扩散常数)适当地改变光检测区域的移动速度。可以以任意方式进行光学系统光路的改变以移动光检测区域的位置。例如，可通过使用激光扫描式光学显微镜中所采用的电流镜(galvanomirror)改变光路来改变光检测区域的位置。光检测区域的位置的移动轨迹可任意设定，例如可从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线轨迹中选择。顺便提及，如上述解释所理解的，在本发明的方法中，通过检测来自已结合至颗粒或与其缔合的发光探针的光来求出要检测的颗粒的存在。因此，当未结合至颗粒的发光探针存在于试样溶液中时，颗粒的检测结果的精确度将劣化。所以，在本发明方法的实施方案中，可优选包括用于防止检测来自未结合至试样溶液中颗粒的发光探针的光的结构。作为此类用于防止检测来自未结合至颗粒的发光探针的光的结构之一，在本发明方法中的制备试样溶液的步骤中，可进行从试样溶液中分离未结合至颗粒的发光探针的步骤。对于分离未结合至颗粒的发光探针的具体技术，可选择如下任意方法通过利用单一发光探针或未结合至颗粒的发光探针，与颗粒和发光探针的结合体或已结合至颗粒的发光探针之间的特性的差异例如大小或分子量、对任意物质的亲和性、带电状态等的差异来物理分离两种或更多种物质。在单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针的分离技术的实施方案中，单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针可通过使用任意操作方法从颗粒和发光探针的结合体或已结合至颗粒的发光探针中分离单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针而从试样溶液中除去，所述任意操作方法包括通过层析(亲水/疏水性层析、亲和层析、离子交换层析等)、超滤、电泳、相分离、离心分离、溶剂提取、过滤吸附等吸附和提取或洗漆。此外，对于用于防止检测来自未结合至颗粒的发光探针的光的可选结构，可将方法设计为通过选择发光探针或试样溶液中的其他组分从而提供试样溶液中的单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针与颗粒和发光探针的结合体或已结合至颗粒的发光探针之间发光特性的差异，或者从而避免单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针的光(从试样溶液中)发出，变得能够来区别单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针与颗粒和发光探针的结合体或已结合至颗粒的发光探针。该结构的优点在于不需要从颗粒和发光探针的结合体或已结合至颗粒的发光探针物理分离单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针的操作。在上述本发明的方法中，作为此类结构的实例，可选择当结合至要检测的颗粒时其发光特性改变的物质作为发光探针，以便在检测光的步骤中可选择性地检测来自已结合至要检测颗粒的发光探针的光。例如，当要检测颗粒为核酸或核酸类似物时，将选择当结合至核酸或核酸类似物时显示荧光强度增加和/或荧光波长改变的嵌入剂荧光染料作为发光探针，而当要检测颗粒为蛋白质时，将选择当结合至蛋白质时由于其周围环境改变而使其荧光强度和/或荧光波长改变的染料(荧光染料如疏水性探针ANS、MANS、TNS)作为发光探针。或者，作为发光探针，可采用由至少两种组分组成的物质，其中当该物质结合至要检测颗粒时由于上述至少两种组分的相对位置变化而发出荧光。对于此类物质的实例，认为存在由于当结合至特定颗粒时的结构改变而会发出强荧光的荧光蛋白和当结合至特定颗粒时会组装以形成荧光金属配合物的分子(配合物的配体)。根据这些结构，在任何情况下，单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针很难发光，或者即使发光，其波长也不同于颗粒和发光探针的结合体的波长，因此能够选择性地检测来自颗粒和发光探针的结合体的光。此外，在试样溶液中对于用于提供单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针与颗粒和发光探针的结合体或已结合至颗粒的发光探针之间发光特性的差异的可选结构，可有利地使用荧光能量转移现象。作为此类实例，例如在制备试样溶液的步骤中，可进行将未结合至颗粒的发光探针与吸收发光探针所发出的光的受体结合的步骤。这里，受体为仅结合至单独的发光探针或未结合至颗粒的发光探针或者与之缔合，并且通过荧光能量转移(立刻)吸收发光探针所发出的光的任意物质(猝灭剂或能量受体)。根据该结构，即使当未结合至要检测颗粒的发光探针进入光检测区，该发光探针也已结合至受体，也因此不发光或仅发出与来自颗粒和发光探针的结合体或已结合至颗粒的发光探针的光的波长不同的光，从而变得能够仅检测颗粒和发光探针的结合体或已结合至颗粒的发光探针的光。作为实例，在要检测颗粒为核酸或核酸类似物和发光探针为荧光标记的核酸或核酸类似物的情况下，当通过使要检测颗粒与发光探针在试样溶液中反应来形成颗粒和发光探针的结合体时，并随后当将已与发光探针的荧光标签的光受体附着的核酸或核酸类似物添加到试样溶液中时，已与受体附着的核酸或核酸类似物结合至未与要检测颗粒结合的发光探针，从而变得能够选择性地检测仅来自颗粒和发光探针的结合体的光。另外，在使用荧光能量转移现象的另一实例中，可采用作为发光探针的物质，该物质具有当相互接近时产生荧光能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位，其中当该物质结合至要检测颗粒时能量供体部位和能量受体部位之间的距离改变(分子信标法、蝎子法(Scorpion method)等)。在该情况下，由于突光能量转移现象的发生程度取决于发光探针是否结合至要检测颗粒而变化，所以单独的发光探针不发光或者单独的发光探针的发光波长与颗粒和发光探针的结合体的发光波长彼此不同，从而变得能够选择性地检测来自颗粒和发光探针的结合体的光。另外，在使用荧光能量转移现象的其他实例中，对于发光探针，制备用于荧光能量转移现象中的能量供体的第一探针和用于荧光能量转移现象中的能量受体的第二探针，将它们与要检测的颗粒混合。然后，第二探针的光通过荧光能量转移现象从第一和第二探针均结合至颗粒所形成的结合体中发出，因而在区分于来自第一探针的光的情况下，可选择性地检测仅来自结合体的光(在该情况下，未结合至颗粒的第二探针很难发光)。或者，在要检测颗粒具有变为由发光探针发出的光的能量受体的部位的情况下，通过选择可用作供体的发光探针，并通过当发光探针结合至颗粒时所发生的荧光能量转移现象检测从颗粒的能量受体部位发出的光，可实现选择性地仅检测来自颗粒和发光探针的结合体的光，另外，反之，在要检测颗粒具有发光部位的情况下，通过选择具有为由颗粒的发光部位发出的光的能量受体的部位的物质作为发光探针，并通过当发光探针结合至颗粒时所发生的荧光能量转移现象检测从发光探针发出的光，可实现选择性地仅检测来自颗粒和发光探针的结合体的光。典型地，通过本发明的方法检测的颗粒可为生物学粒状对象物如生物分子,诸如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等、病毒或细胞，或者非生物颗粒(例如，原子、分子、胶束、金属胶体等)，发光探针可为特异性或非特异性结合至或粘合至上述颗粒的任意物质。例如，当要检测颗粒为核酸时，探针可为与核酸结合的染料分子、核酸结
口虫H寸ο上述发明方法可用于使用各种发光探针检测任意颗粒的实验。例如，本发明方法可应用于如下实验其中采用如下物质作为发光探针该物质具有其间发生荧光能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位，并且当该物质结合至特定颗粒时能够通过预设的分解反应而分解；在要试验的试样溶液中添加该发光探针；检测来自试样溶液的光；根据荧光能量转移现象存在与否来检查发光探针是否已结合至上述颗粒，即上述颗粒是否存在于试样溶液中。即，根据上述发明的一个方式，提供具有如下特征的方法发光探针具有产生荧光能量转移的能量供体部位和能量受体部位；制备试样溶液的步骤包括进行使结合至要检测颗粒的发光探针分解的反应的步骤，和要检测的光为从通过上述反应而分解的发光探针所发出的光。发明的效果关于通过上述发明方法所实现的光学分析技术的光检测机构本身，与光学分析技术如FCS、FIDA和PCH的情况类似，采用了在共焦显微镜或多光子显微镜中检测来自光检测区域的光的结构，因此试样溶液的量可类似地小。然而，由于本发明中未进行计算荧光强度波动的统计学步骤，所以本发明的光学分析技术可应用于其中颗粒的数密度或浓度基本上低于光学分析技术如FCS、FIDA和PCH所需的水平的试样溶液。然而，由于在本发明中单独检测分散或溶解在溶液中的各颗粒，所以通过使用其信息变得能够定量进行颗粒的计数、试样溶液中颗粒的浓度或数密度的计算或关于浓度或数密度的信息的获取。例如，尽管专利文献5和6能够获取在预设时间内具有超过预设阈值的强度的荧光信号频率总计值与试样溶液中荧光分子等的颗粒数量之间的相关性，但不能掌握颗粒穿过测量区域的动态行为(颗粒是直接穿过测量区域还是存在于测量区域内)，因此并不清楚具有高于预设阈值的强度的荧光信号与穿过测量区域的颗粒之间的对应性，因此理论上不能计数发光颗粒并难以精确确定颗粒在试样溶液中的浓度。然而，根据本发明，由于使穿过光检测区域的颗粒以I对I的方式与所检测的光信号相关联，从而将一次检测一个颗粒，变得能够计数在溶液中分散并随机运动的颗粒，并且与常规技术相比，变得能够精确地确定颗粒在试样溶液中的浓度或数密度。实际上，如本实施方案的栏中所记载的，已发现，根据本发明，在使用发光探针的试样溶液中单独检测颗粒；计数其数量并确定颗粒浓度的方法，能够确定比基于荧光光谱仪或读板仪(Plate reader)测量的荧光强度所能够确定的浓度低得多的浓度。另外，相对于其中两个或更多个发光探针结合至一个颗粒的系统，已发现相对于现有技术，不仅在较低浓度侧，而且还在较高浓度侧能够更精确地确定溶液中的颗粒浓度。此外，根据通过改变光学系统的光路来用光检测区域扫描试样溶液内部的方式，由于在没有对样品溶液的机械振动和流体动力作用的情况下机械地稳定化试样溶液的均一条件下观察试样溶液的内部，所以与例如其中使试样中产生流动的情况(当假定流动时，难以给出总是均一的流动速度，并且装置结构变得复杂，另外，所需的试样量大幅增加，由于流动所引起的流体动力作用可使溶液中的颗粒、发光探针、它们的结合体或其他物质变质或变性。)相比，改进了定量检测结果的可靠性，并且变得能够在不存在由动力学作用所引起的对试样溶液中的检测对象物的颗粒的影响或人为现象(artifact)的条件下进行测量。通过解释以下本发明的优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。


[图1]图1 (A)为根据本发明的光学分析装置的内部结构的示意图。图1⑶为共焦体积(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1(C)为改变镜7的方向以在试样溶液中移动光检测区域的位置的机构的示意图。[图2]图2(A)和(B)分别为解释通过根据本发明的光学分析技术的光检测原理的示意图和所测量光强度随时间的变化的示意图。[图3]图3为示出防止检测到未结合至颗粒的发光探针的光的结构的示意性实例的图。[图4]图4㈧和⑶分别为在要观察颗粒由于布朗运动而穿过光检测区的情况下的模型图和示出在该情况下光子计数(光强度)随时间变化的实例的图。[图5]图5 (A)和⑶分别为在要观察颗粒通过以比要观察颗粒的扩散移动速度快的速度下在试样溶液中移动光检测区域的位置而穿过光检测区的情况下的模型的图，和在该情况下示出光子计数(光强度)随时间变化的实例的图。[图6]图6为以流程图的形式示出从通过本发明的方法测量的光子计数(光强度)的时间变化来计数颗粒的步骤的图。[图7]图7为解释在从通过本发明的方法测量的光子计数(光强度)的时间变化来进行颗粒计数的步骤中检测信号的信号处理步骤的一个实例的图。[图8]图8示出通过本发明的方法测量的光子计数数据的实例(条形图)；通过进行使数据平滑化所获得的曲线(虚线)；和在脉冲存在区域拟合的高斯函数(实线)。在该图中，将由于噪音或污染物而标有“噪音”的信号不视为信号。[图9]
图9各自示出(A)根据本发明方法的核酸浓度检测实验结果、(B)使用读板仪的核酸浓度检测实验结果和(C)核酸浓度检测实验中的分子状态的示意图。[图10]图10各自示出(A)根据本发 明方法使用分子信标检测具有特定碱基序列的核酸的实验结果，和(B)使用具有读板仪的分子信标检测具有特定碱基序列的核酸的实验结
果O[图11]图11示出根据本发明方法从通过物理纯化而除去未反应的荧光标记探针的试样溶液中检测要观察颗粒的实验结果。在图中，条形图为平均值，误差条为标准差。[图12]图12(A)为示意性示出根据本发明方法使用荧光能量转移(FRET)检测核酸的实验中分子状态的图，和图12(B)示出实验中检测脉冲数的结果。在图中，条形图为平均值，误差条为标准差。[图13]图13(A)为示意性示出根据本发明方法使用荧光猝灭方法检测核酸(要观察颗粒)的实验中分子状态的图，和图13(B)示出实验中检测脉冲数的结果。在图中，条形图为平均值，误差条为标准差。[图14]图14(A)为示意性示出根据本发明方法使用QUAL反应检测核酸的实验中分子状态的图，和图14(B)示出实验中检测脉冲数的结果。在图中，条形图为平均值，误差条为标准差。[图15]图15示出计算荧光强度波动的常规光学分析技术中所获得的光子计数(光强度)的时间变化的实例，其中㈧示出颗粒浓度在提供足够测量精度的水平的情况，⑶示出试样中的颗粒浓度比(A)情况显著低的情况。附图标记说明
I—光学分析装置(共焦
2光源
3---单模光纤
4准直透镜
5，14a二向色镜
6，7，11反射镜
8物镜
9---微型板
10—孔(试样溶液容器)
12 聚光透镜
13针孔
14-一屏障滤光片
15---多模光纤
16光检测器17镜偏转器17a载物台位置改变设备18计算机
具体实施例方式下文中，详细描述本发明的优选实施方案。光学分析装置的结构
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如图1 (A)示意性所示，在基本结构中，本发明的方法可用通过结合能够进行FCS、FIDA等的共焦显微镜和光检测仪形成的光学分析装置来实现。参照附图，光学分析装置I由光学系统2-17和用于与控制光学系统中各部分的操作一起来获取和分析数据的计算机18构成。光学分析装置I的光学系统可与常规共焦显微镜的光学系统相同，其中从光源2发出并通过单模光纤3的内部传输的激光(Ex)形成发散为在由光纤发射端的固有NA决定的角度下放射的光；在用准直透镜4形成平行光束后，光在二向色镜5和反射镜6和7上反射，进入物镜8。在物镜8上方，典型地放置有向其中分散有I至数十UL试样溶液的试样容器或具有排列于其上的孔10的微型板9，从物镜8发出的激光聚焦在试样容器或孔10中的试样溶液中，形成光强度强的区域(激发区域)。在试样溶液中，分散或溶解了作为要观察对象物的颗粒和结合至该颗粒的发光探针，其中所述探针为发光标签如荧光染料附着于其上的分子，当已结合至发光探针或与之缔合的颗粒(依赖于实验方式，发光探针一旦结合至颗粒后便从该颗粒解离)进入激发区域时，发光探针在位于激发区域期间被激发并发光。发出的光(Em)在穿过物镜8和二向色镜5后在镜11上反射，并由聚光透镜12聚集，然后光穿过针孔13 ;通过屏障滤光片14传输(其中仅选择在特定波长带域中的光成分)；并且被导入多模光纤15中，到达光检测器16，在转换成时间序列电信号后，将信号输入计算机18，以稍后解释的方法进行光学分析处理。就这一点而言，如本领域技术人员所公知的，在上述结构中，针孔13位于物镜8的焦点位置的接合(conjugate)位置，如图1(B)所示意性示出的，在从激光共焦区域，即激发区域以外的区域发出的光被阻断的情况下，仅从激光的焦点区域，即激发区域发出的光穿过针孔13。图1(B)所示的激光的焦点区域为该光学分析装置的光检测区域，其有效体积通常为约1-10 μ L(典型地，光强度根据在区域中心具有峰的高斯型或洛伦兹型分布而传播。有效体积为与光强度减少至峰强度的Ι/e2的表面毗连的近似椭圆体的体积)，其称为“共焦体积”。此外，由于本发明检测来自一个颗粒和发光探针的结合体或一个探针的光，例如来自一个或多个荧光染料分子的微光，优选地，将可用于光子计数的超高灵敏度的光检测器用于光检测器16。另外，在显微镜的载物台(未示出)上，可提供有用于移动微型板9的水平位置的载物台位置改变设备17a，以便改变要观察的孔10。载物台位置改变设备17a的操作可通过计算机18来控制。根据该结构，甚至在两种或更多种样本存在下也能够实现快速测量。此外，在上述光学分析装置的光学系统中，提供用于改变光学系统的光路从而用光检测区域扫描试样溶液的内部，即在试样溶液的内部移动焦点区域即光检测区域的位置的机构。对于移动光检测区域的位置的该机构，例如，如图1(C)所示意性示出地，可采用改变反射镜7的方向的镜偏转器17。该镜偏转器17可以与装备在常规激光扫描型显微镜上的电流镜装置相同。此外，为了获得期望的光检测区域的位置的移动模式，在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测相协调地驱动镜偏转器17。光检测区域的位置的移动轨迹可从圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线轨迹，或者这些的组合中任意选择(可设计计算机18中的程序以便可选择各种移动模式)。就这一点而言，尽管未说明，但光检测区域的位置可以通过上下移动物镜8而沿垂直方向移动。正如所提及的，根据改变光学系统的光路以移动光检测区域的位置从而代替移动试样溶液的结构，在试样溶液中基本上既不会发生机械振动也不会发生流体动力作用，因此变得能够消除动力作用对要观察的对象物的影响，实现稳定测量。在颗粒和发光探针的结合体或发光探针通过多个光子吸收而发光的情况下，将上述光学系统用作多光子显微镜。在该情况下，由于仅从激发光的焦点区域(光检测区域)发光，所以可将针孔13移除。另外，在颗粒和发光探针的结合体或发光探针由于化学发光或生物发光现象在非激发光下发光的情况下，可省略用于产生激发光的光学系统2-5。当颗粒和发光探针的结合体或发光探针由于磷光或散射光而发光时，原样使用上述共焦显微镜的光学系统。此外，如图所示，在光学分析装置I中，可提供两个或更多个激发光源2，以便可根据颗粒和发光探针的结合体或发光探针的激发波长适当地选择激发光的波长。类似地，还可提供两个或更多个光检测器16，以便当试样包含两种或更多种其波长彼此不同的颗粒和发光探针的结合体或发光探针时，可根据波长单独检测来自它们的相应光。本发明光学分析技术的原理光谱分析技术如FCS和FIDA的优点在于与常规生物化学分析技术相比所需试样量极小并且可迅速进行试验。然而，在这些光谱分析技术如FCS和FIDA中，要观察颗粒的浓度和特性主要基于荧光强度波动来计算，因此，为了获得精确的测量结果，如图15(A)示意性描绘的，试样溶液中要观察颗粒的浓度或数密度应处于在荧光强度测量期间在光检测区域CV中总是存在一个要观察颗粒的水平，以便如图右手边所示在测量期限内总能检测到显著的光强度(光子计数)。如图15(B)所描绘的，当要观察颗粒的浓度或数密度低于例如要观察颗粒很少进入光检测区域CV的水平下的浓度或数密度时，如图右手边所示在部分测量期限内将不出现显著的光强度(光子计数)，因此，精确计算光强度波动将变得困难。此外，当要观察颗粒的浓度显著低于在测量期间在光检测区域内部总是存在约一个要观察颗粒的水平时，光强度波动的计算将会受到背景的影响，测量期限将变长从而获得对于计算足够的大的光强度数据量(光子计数)。然后，在本发明中，基于如下新原理而提出光学分析技术即使当要观察颗粒的浓度低于上述光谱分析技术如FCS和FIDA所要求的水平时，该光学分析技术也能够检测要观察颗粒的特性如数密度或浓度。在本发明的光学分析技术中，简言之，作为要进行的步骤，光检测与在试样溶液中移动光检测区域CV的位置一起进行，即，如图2示意性描绘的，通过驱动用于移动光检测区域的位置而改变光路的机构(镜偏转器17)来用光检测区域CV扫描试样溶液的内部。然后，例如如图2(A)所示，在移动光检测区域CV期间(图中，时间t0_t2)，当光检测区域CV穿过其中存在一个颗粒(图中，附着荧光染料作为发光探针)的区域时(tl)，将如图2(B)所示检测显著的脉冲光强度(Em)。因此，在进行光检测区域CV的位置移动和如上所述的光检测期间，通过一个接一个地检测如图2(B)所示出现的各显著的光强度，来单独检测结合至发光探针的颗粒，并通过计算其数量而可获取关于存在于测量区域的颗粒的数量、浓度或数密度的信息。应理解的是，在本发明的光学分析技术的原理中，未进行统计学计算处理如荧光强度波动的计算，并且颗粒是一个接一个测量的，因此，即使在具有处于FCS和FIDA无法获得足够精确分析的水平下的低颗粒浓度的试样溶液中也可获得关于颗粒的浓度或数密度的信息。此外，如下述实施方案所示，根据本发明通过单独检测试样溶液中的颗粒并将其计数，变得能够测量比由荧光分光光度计和读板仪所测量的荧光强度可测量的浓度低的荧光标记颗粒。通常，在用分光光度计和读板仪测量特定荧光标记颗粒的浓度中，假设荧光强度与荧光标记颗粒的浓度成比例。然而，在该情况下，当荧光标记颗粒的浓度显著低时，噪音信号量相对于从荧光标记颗粒中发出的光的信号量变大(S/N比的恶化)，从而，荧光标记颗粒的浓度和光信号量之间的比例关系瓦解，所测浓度的精确度劣化。另一方面，在本发明方法中，在从所检测的光信号中检测对应于各颗粒的信号的步骤中，从检测结果中消除噪音信号，并通过仅计数对应于各颗粒的信号来计算浓度，因此，变得能够检测比在假设荧光强度与荧光标记颗粒的浓度成比例下检测颗粒浓度的情况低的浓度。此外，在多个发光探针结合至一个要观察颗粒的情况中，通过根据本发明的单独检测试样溶液中的颗粒并对它们计数的方法，与其中在假设荧光强度与荧光标记颗粒的浓度成比例下测定浓度的常规方法相比，还改善了在较高颗粒浓度侧的颗粒浓度的测量精确度。在多个发光探针结合至一个要观察颗粒的情况下，当在试样溶液中添加特定量的发光探针时，随着要观察颗粒的浓度变高，结合至颗粒的发光探针的数量相对降低。在该情况下，由于每个要观察颗粒的荧光强度可降低，所以荧光标记颗粒的浓度与光量之间的比例关系瓦解，从而使所测浓度值的精确度恶化。另一方面，在本发明的方法中，在从所检测光的信号来检测对应于相应颗粒的信号的步骤中由每个颗粒的荧光强度的减少造成的影响小，由颗粒数计算浓度，从而变得能够检测比在假设荧光强度与荧光标记颗粒的浓度成比例下检测浓度的情况中的水平高的浓度。本发明中的操作过稈具体地，在用如图1(A)所示的本发明的光学分析装置I的本发明的方法中，进行(I)包含发光探针和结合探针的要观察颗粒的试样溶液的制备，(2)测量试样溶液的光强度的过程，和(3)分析所测光强度的过程。(I)试样溶液的制备本发明方法中要观察颗粒只要在试样溶液中分散并随机运动则可为任意颗粒，如溶解的分子，该颗粒可为例如生物分子即蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸等，或者它们的聚集体，病毒、细胞、金属胶体或其他非生物分子。在试样溶液(典型地，其为水溶液，但不限于此，并可为有机溶剂或其他任意液体)中要观察颗粒典型地以任意方式与提供有发光标签(荧光分子、磷光分子、化学发光或生物发光分子)的发光探针混合，其中发光探针结合至要观察颗粒或与之缔合，从而形成结合体，以使通过发光探针发出的光充当要观察颗粒存在的标志，从而能够检测要观察颗粒(如稍后所阐述的，在某些实验方式中，通过检测曾结合至要观察颗粒然后通过预定处理而从要观察颗粒解离的发光探针来检测要观察颗粒)。作为要观察颗粒和发光探针的结合体的实例，当要观察颗粒为核酸时，对于发光探针采用具有与作为要观察颗粒的核酸互补的碱基序列的核酸或核酸类似物、核酸结合蛋白、核酸结合抗体等。作为具体实例，可例举当要观察颗粒为DNA-RNA的缔合体(association)时将识别DNA-RNA杂交体的突光标记抗体用作发光探针的情况(杂交捕捉法)。如上所示，对于为形成颗粒和发光探针的结合体而将要观察颗粒与发光探针的混合，应注意要求试样溶液中基本上所有要观察颗粒都结合至发光探针或与之缔合。即，如果存在未结合至发光探针或未与之缔合的要观察颗粒，试样溶液中的要观察颗粒的数量和/或浓度在其数字上将被低估。因此，为了确保使基本上所有要观察颗粒均结合至发光探针或与之缔合，要求在颗粒和发光探针的结合体的形成中向试样溶液中添加发光探针，以使试样溶液中发光探针的数量超过要观察颗粒的数量。然而，在该情况中，结果是，既不结合至要观察颗粒也不与之缔合的发光探针变得存在于试样溶液中，如果在无法与来自颗粒和发光探针的结合体的光相区分下，检测到来自未结合至要观察颗粒的发光探针或单独发光探针的光，则要观察颗粒的检测中的精确度也将恶化。因此，在通过使用发光探针单独检测要观察颗粒的光学分析技术的本发明方法中，优选可采用防止检测到未结合至要观察颗粒的发光探针或单独的发光探针的光的结构，即，从检测结果中消除来自未结合至要观察颗粒的发光探针或单独的发光探针的光的结构。作为此类结构，例如可采用以下结构。(i)未结合至要观察颗粒的发光探针从试样溶液中的分离如图3(a)示意性所示，在用于从检测结果中消除来自未结合至要观察颗粒的发光探针的光的结构之一中，在形成颗粒和发光探针的结合体之后，可通过利用性质差异(例如，未结合至要观察颗粒的发光探针或单独的发光探针与颗粒和发光探针的结合体或已结合至要观察颗粒的发光探针之间的大小或分子量、对任意物质的亲和性、带电状态等的差异)而物理分离两种或更多种物质的任意方法来将未结合至要观察颗粒的发光探针或单独的发光探针从试样溶液中分离和除去。具体地，可采用本领域通常进行的物质的物理分离，如包括通过层析(亲水/疏水性层析、亲和层析、离子交换层析等)的吸附、提取或洗涤，超滤，电泳，相分离，离心分离，溶剂提取，过滤吸附等的操作。此外，可使用从试样溶液中消除单独的发光探针的方法，如ELISA法，其中向要观察颗粒和发光探针已混入的试样溶液中进一步混合结合至要观察颗粒的不同探针(分离用探针)，从而使其结合至要观察颗粒；然后使试样溶液暴露至载体(该载体结合至分离用探针)，以便仅保持由要观察颗粒、发光探针和分离用探针组成的结合体，同时(例如，通过洗涤)从试样溶液中分离并除去单独的发光探针。(ii)波长特性改变的荧光染料的使用在该领域中，已知波长特性依赖于是否结合至特定物质而改变的各种荧光染料。然后，为了从检测结果中消除未结合至要观察颗粒的发光探针或单独的发光探针的光，如图3(c)示意性描绘的，对于发光探针可采用当结合至要观察颗粒时其波长特性改变的荧光染料。当采用此类发光探针时，通过选择性地检测从当结合至要观察颗粒时发光探针发出的光而不需要物理消除单独的发光探针或未结合至要观察颗粒的发光探针的操作，可以选择性地检测来自要观察颗粒和发光探针的结合体或已结合至要观察颗粒的发光探针的光。此类荧光染料可为当结合至要观察颗粒时其激发和/或发光波长变化的染料，或者当结合至要观察颗粒时其荧光强度显著增加的染料。典型地，当要观察颗粒为核酸或核酸类似物时，可采用核酸的嵌入剂荧光染料(溴化乙锭、吖啶橙、SYTOX Orange,SYTOX RecUSYBRGreen1、SYBR Green I1、SYBR Gold、Picogreen、OllGreen、Gel Red、Gel Green、RiboGreeruEvaGreen和具有花青骨架的染料等)。另外，当要观察颗粒为蛋白质时,可采用当与蛋白质结合时其荧光强度和荧光波长由于周围环境改变而改变的染料作为发光探针。对于此类染料，可使用以下荧光染料例如作为疏水性探针的萘磺酸类，如1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、N-甲基-2-苯胺基萘-6-磺酸(MANS)、2-对-甲苯胺基萘-6-磺酸(TNS)、二甲氨基萘(丹酰类)、容易受到局部PH或介电常数影响的染料，如TAMRA、荧光素、6-joe、B0DIPY、TMR, BODIPY TR, Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL、BODIPY FL/C3、BODIPY FL/C6、FITC、EDANS、若丹明6G、TMR、TMRITC、χ-若丹明、Texas RecUBODIPY 5_FAM、B0DIPY R6G、B0DIPY581。此外，除了如上所述的荧光染料以外，可采用由至少两种组分组成、如果结合至要观察颗粒则其波长特性改变的物质作为发光探针，其中当该物质结合至要观察颗粒时，在所述至少两种组分的相对位置改变时该物质发出荧光。作为此类物质的实例，可例举当结合至特定颗粒时结构上改变而发出强荧光的荧光蛋白，或当与特定颗粒(配合物的配体)结合时聚集而形成荧光金属配合物的分子。(iii)荧光能量转移现象的利用作为用于从检测结果中消除已结合至要观察颗粒的发光探针的光的可选结构，可采用如下方法利用使用至少两种荧光染料的荧光能量转移现象的效果，用装置I仅检测来自要观察颗粒和发光探针结合体或已结合至要观察颗粒的发光探针的光，从而防止来自未结合至要观察颗粒的发光探针的光发出，或者从而使来自要观察颗粒和发光探针的结合体或已结合至要观察颗粒的发光探针的光的波长与单独的发光探针或未结合至要观察颗粒的发光探针的光的波长彼此不同。例如，使用荧光能量转移现象的方式可为如下(实施例1)对于使用荧光能量转移现象的结构，可使用荧光猝灭。具体地，如图3(b)示意性示出的，在要观察颗粒和发光探针的结合体形成后，将结合至单独的发光探针或未与要观察颗粒结合的发光探针，而不结合至颗粒和发光探针的结合体，而且还通过荧光能量转移现象吸收由发光探针发出的光的物质(光受体)添加到试样溶液中，并使该物质仅结合至试样溶液中的未结合至要观察颗粒的发光探针或单独的发光探针。然后，当用光学分析装置I观察其中如此混合光受体的试样溶液时，从颗粒和发光探针的结合体中的发光探针发出光(用光检测器检测光)和从单独的发光探针或未结合至要观察颗粒的发光探针(已结合光受体)发出的光被光受体所吸收，因此，来自单独的发光探针或未结合至要观察颗粒的发光探针的光被猝灭，从而使所述光不反映在检测结果中。作为此类实例，例如在荧光标记的核酸或核酸类似物用作为核酸或核酸类似物的要观察颗粒的发光探针的情况下，在发光探针与要观察颗粒结合后，通过添加具有光受体部位的核酸或核酸类似物作为光受体来使光受体结合至发光探针，变得可以猝灭未结合至要观察颗粒的发光探针的荧光，该核酸或核酸类似物吸收发光探针的荧光标记的光并具有与发光探针互补的碱基序列。(实施例2)作为发光探针，可采用具有能量供体部位和能量受体部位的物质，将该物质设计为当发光探针结合要观察颗粒时能量供体部位和能量受体部位之间的距离改变。作为此类发光探针的实例，例如可例举分子信标，即如图3(d)所示意性描绘的核酸分子，各自为荧光能量转移现象中的能量供体和能量受体的两种染料附着于该核酸分子。在此类分子信标中，当其为单个分子时(图3(d)左)，所添加的染料彼此接近从而在能量供体的激发光照射时将发生荧光能量转移现象，因此，能量供体所发出的光转移至能量受体并猝灭，或者发射能量受体的染料的发光波长的光(波长2的光);但是，当分子信标结合至要观察颗粒(核酸或核酸类似物)时(图3(d)右)，两种染料之间的距离变长，因而，在能量供体的激发光照射时无荧光能量转移现象发生，导致能量供体的发光波长的光(波长I的光)发射。因此，在观察时，通过仅选择性地检测分子信标能量供体的发光波长的光，即使在试样溶液中存在单独的分子信标下也变得能够检测要观察颗粒。然而，作为类似的原理，可使用蝎子探针。就这一点而言，与所示实例相反，可使用设计为如下的发光探针在单独的发光探针(或者未结合至要观察颗粒的发光探针)中不发生荧光能量转移现象，而在颗粒和发光探针的结合体中发生荧光能量转移现象(在该情况下，选择性检测能量受体的发光波长的光)。另外，发光探针不仅可为核酸或核酸类似物，还可为具有至少两个发光部位的物质，其中当物质结合至要观察颗粒或与之缔合时，所述至少两个发光部位之间的距离改变，导致发射光的波长的改变。(实施例3)如图3(e)示意性示出，分别制备为能量供体的第一探针(发光探针
1)和为能量受体的第二探针(发光探针2)来作为发光探针，并添加到试样溶液中。然后，发光探针I和发光探针2均结合至要观察颗粒，从而形成结合体，当在该状态下照射激发发光探针I的光时，在结合体内发生荧光能量转移现象，从而使发光探针2的发光波长(波长
2)的光从结合体中发出。另一方面，从未结合至要观察颗粒的发光探针I中发出其发光波长(波长I)的光，并且未结合至要观察颗粒的发光探针2基本上不激发，不发光。因此，在图3(e)的系统中，通过使发光探针I发光，使发光探针2的发光波长的光仅从结合体中发出，因此，通过选择性地检测发光探针2的发光波长的光，变得可以高度精确地检测要观察颗粒，而不从试样溶液中物理除去发光探针。(实施例4)在要观察颗粒具有发光部位时，可选择具有作为要观察颗粒的发光部位的能量供体的功能的物质作为发光探针。在该情况下，如图3(f)示意性所示，当从单独的发光探针发出发光波长(波长I)的光时，在发光探针结合的要观察颗粒中，从发光探针发出的光被要观察颗粒的发光部位所吸收，然后发出要观察颗粒的发光部位的发光波长(波长2)的光。因此，通过使发光探针发光并选择性地检测要观察颗粒的发光部位的发光波长的光，变得能够高度精确地检测要观察颗粒，而不从试样溶液中物理除去发光探针。作为此类实例，例如在要观察颗粒为核酸的情况下，可选择当结合至核酸时为核酸中的鸟嘌呤提供能量(鸟嘌呤变为能量受体)的任意荧光标记物质作为发光探针。此外，在要观察颗粒为蛋白质的情况下，可选择当结合至蛋白质时为蛋白质中的色氨酸提供能量(即，色氨酸变为能量受体)的任意标记物质作为发光探针。(实施例5)在要观察颗粒具有发光部位的情况下，可选择具有作为要观察颗粒的发光部位的能量受体功能的物质作为发光探针。在该情况下，如图3(g)示意性所述，在发光探针已结合的要观察颗粒中，发光探针吸收从要观察颗粒的发光部位发出的光，从而发出发光探针的发光波长(波长2)的光，而单独的发光探针不发光。因此，通过使要观察颗粒的发光部位发光并选择性地检测发光探针的发光波长的光，变得可以高度精确地检测要观察颗粒，而不从试样溶液中物理除去发光探针。(iv)伴随要观察颗粒或发光探针的解离反应的测量的应用
顺便提及，在核酸的碱基序列、结构或特性的研究领域，已知使用具有发生荧光能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位并设计为在已结合至具有互补碱基序列的核酸的条件下被预设的分解反应分解的核酸分子作为搜索核酸碱基序列的探针的实验方法。在此类试验方法中，简言之，首先，上述探针添加到要检测的试样中，如果包括与探针的碱基序列互补的碱基序列的核酸存在于试样中，则探针将结合至核酸(参见图3(h)的左图)。在该条件下，如果进行预设的分解反应，则仅结合至核酸的探针，或探针与核酸二者分解，以使探针上的能量供体部位和能量受体部位分开(参见3(h)的右图)，因此，不会发生荧光能量转移现象，导致来自能量供体部位的光(波长I)变得可观察。另一方面，如果包括与探针的碱基序列互补的碱基序列的核酸不存在于试样中，则探针不结合至核酸，即使进行预设的分解反应，探针也不分解，因此，在探针上，来自能量供体部位的光被能量受体部位吸收而不发射到外部。即，在上述实验中，根据是否检测到来自能量供体部位的光，可检测要观察核酸是否存在于试样中。本发明的方法可用于使用其中如上所述发生荧光能量转移现象、并且当发光探针结合至要观察颗粒(例如，核酸)时将通过预设的分解反应来分解的发光探针的实验中。在该情况下，在装置中检测的光为从在结合至要观察颗粒后分解的发光探针发出的光。作为此类实验方法的实例,例举如下,例如(a)其中将具有在其间发生荧光能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位的DNA的发光探针添加至包含要试验的核酸或核酸类似物(要观察颗粒)的试样溶液，检测是否发光探针被具有5' -3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶分解的方法(Taqman法)；(b)其中将具有在其间发生荧光能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位并部分地包含RNA的DNA的发光探针添加至包含要试验的核酸或核酸类似物(要观察颗粒)的试样溶液，检测是否发光探针被RNaseH分解的方法(Cycleave法)；(C)其中将具有在其间发生荧光能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位并部分地包含限制性酶识别区域的DNA的发光探针添加至包含要试验的核酸或核酸类似物(要观察颗粒)的试样溶液，检测是否发光探针被限制性酶分解的方法；(d)其中将具有在其间发生荧光能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位的DNA的发光探针添加至包含要试验的核酸或核酸类似物(要观察颗粒)的试样溶液，检测是否发光探针被特异性分解双链核酸的核酸外切酶分解的方法。当使用本发明的方法进行这些实验时，可以以常规方式制备各实验中的试样溶液。如稍后所详述的，在光强度测量中应当检测到的光的波长为在发光探针分解后发出的光的波长。此外，检测的颗粒数主要为分解的发光探针的数量，该数将等于已结合发光探针的核酸或核酸类似物的分子数。(2)试样溶液的光强度的测量除了在测量期间驱动镜偏转器17从而移动在试样溶液中的光检测区域的位置(从而在试样溶液中扫描)以外，本发明光学分析的光强度的测量可以以与FCS或FIDA中的光强度测量过程相同的方式进行。在操作过程中，典型地，在将试样溶液分散在微型板9的孔10中并将其置于显微镜的载物台上后，当使用者输入计算机18测量开始的指令时，计算机18运行存储于存储装置(未示出)中的程序(为了移动在试样溶液中的光检测区域的位置而改变光路的步骤，在移动光检测区域的位置期间检测来自光检测区域的光的步骤)，然后将开始用激发光照射试样溶液中的光检测区域，并测量光强度。在该测量中，根据所述程序在计算机18的操作处理的控制下，镜偏转器17驱动镜7(电流镜)以移动孔10中光检测区域的位置，与此同时，光检测器16顺次将检测的光转换为电信号并将其输送至计算机18,该计算机18以任意方式产生来自输送的光信号的时序光强度数据并将其存储。就这一点而言，光检测器16典型地为可检测单个光子到达的超高灵敏度的光检测器，因此光检测可以在预设时间内顺次测量每预设的单位时间(BIN ΜΕ)，例如每IOys内到达光检测器的光子的数量的方式进行的光子计数，其中时序光强度数据将为时序光子计数数据。在光强度测量期间光检测区域的位置的移动速度可为例如实验上或为了满足分析目的而任意设定的预设速度。在基于检测的要观察颗粒的数量来获取数密度或浓度信息的情况下，需要光检测区域已通过的区域大小或体积，因此，以能够控制移动距离的方式进行光检测区域的位置移动。就这一点而言，如果经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例，则测量结果的解释将变得容易，因此基本上优选移动速度是恒定的，尽管不限于此。顺便提及，关于光检测区域的位置的移动速度，为了从所测量的时间序列光强度数据或要观察颗粒的数量的计数来进行定量地精确地单独检测要观察颗粒，优选将移动速度设为比要观察颗粒(更严格地，颗粒和发光探针的结合体或在结合至颗粒后已分解并释放的发光探针)的随机运动，即，布朗运动的移动速度更快的值。由于本发明光学分析技术中的要观察颗粒为分散或溶解在溶液中并自由随机移动的颗粒，所以其位置由于布朗运动而随时间移动。因此，当光检测区域的位置的移动速度慢于由布朗运动引起的颗粒运动(如图4(A)示意性描绘，颗粒在区域中的随机运动)时，由此，如图4(B)所示使光强度随机变化(如前面所述，光检测区域中的激发光强度从在区域的中心的顶点向其外部方向减少)，以致变得难以确定对应于各要观察颗粒的显著的光强度变化。然后，如图5(A)所示，优选将光检测区域的位置的移动速度设为比由布朗运动引起的颗粒的平均移动速度(扩散移动速度)快，以使颗粒沿近似直线穿过光检测区域，从而在如图5(B)所示的时间序列光强度数据中，对应于各颗粒的光强度的变化谱变得几乎均一(当发光颗粒沿近似直线穿过光检测区域时，光强度变化谱与激发光强度分布相似)，并可易于确定各要观察颗粒与光强度之间的对应性。
具体地，由均方位移(mean-square displacement)关系的表达式给出具有扩散系数D的要观察颗粒(更严格地，颗粒和发光探针的结合体或在结合至颗粒后已分解并释放的发光探针)通过布朗运动而穿过半径为Wo的光检测区域所需的时间At :(2ffo)2=6D · Δ t ——(I)由此Δ t= (2ffo) 2/6D —(2)因此，通过布朗运动而移动的要观察颗粒的速度(扩散移动速度)VdifjSSVdif=2ffo/At=3D/ffo —(3)那么，据此，光检测区域的位置的移动速度可设为比Vdif足够快的值。例如，当期望要观察颗粒的扩散系数为约D=2. OX lO-V/s时，则Vdif将为1. OX 10_3m/s，假设Wo约为O. 62m,因此，光检测区域的位置的移动速度可设为其10倍以上，如15mm/s等。就这一点而言，当要观察颗粒的扩散系数未知时，可通过重复进行设定光检测区域的位置的各种移动速度以求得光强度变化谱变为期望谱(典型地，类似于激发光强度分布)的条件的预实验，来确定光检测区域的位置的大致移动速度。(3)光强度分析当通过上述处理获得试样溶液的时间序列光强度数据时，可在计算机18中通过根据存储于存储装置中的程序的处理来进行如下所述的光强度分析。(i) 一个要观察颗粒的检测当一个要观察颗粒在其穿过光检测区域中的轨迹如图5(A)所示大致呈直线时，如图7(A)示意性描绘的(由光学系统确定)，时间序列光强度数据中对应于要观察颗粒的光强度变化具有反映光检测区域中光强度分布的谱(通常呈大致钟形)。然后，在用于检测要观察颗粒的方法之一中，设定光强度的阈值Ιο，并当超过阈值的光强度持续的时间宽度Δ τ在预设范围内时，光强度谱可判定为对应于已穿过光检测区域的一个颗粒，从而检测 一个要观察颗粒。基于在从相对于光检测区域以预设速度移动的要观察颗粒和发光探针的结合体(或者在结合至颗粒后已分解和分离的发光探针)发出的光的强度中所预期的谱来确定光强度的阈值Io和时间宽度Λ τ的预设范围，它们的具体值可任意或实验设定，还可依赖于要观察颗粒和发光探针的结合体(或者在结合至颗粒后已分解和分离的发光探针)的特性而选择性地确定。此外，在要观察颗粒的另一检测方法中，当光检测区域中的光强度分布可假定为高斯分布时I=A · exp (_2t2/a2) ---(4)，和当通过将表达式(4)拟合到显著光强度谱(可清楚判定为非背景的谱)而计算的强度A和宽度a在相应预设范围内时，可判定光强度谱对应于观察到已穿过光检测区域的一个要观察颗粒，从而完成一个要观察颗粒的检测。然而，强度A和宽度a在预设范围外的谱可作为分析中的噪音或污染物而忽略。(ii)要观察颗粒的计数要观察颗粒的计数可通过以任意方式计数通过上述要观察颗粒的检测方法所检测的颗粒的数量来完成。然而，例如，对于大量颗粒，可通过图6和图7(B)中所说明的处理来完成。参照图6和图7(B)，在由时间序列光强度(光子计数)数据计数颗粒的方式的一个实例中，在如上所述测量光强度之后，即，在进行用光检测区域扫描试样溶液并光子计数以获取时间序列光信号数据(光子计数数据)(步骤100)后，对这些时间序列光信号数据(图7(B)，最上行“检测结果(未处理)”)进行平滑化处理(步骤110，图7(B)的中上行“平滑化”)。尽管由颗粒和发光探针的结合体或发光探针发出的光是随机的，以致在微小时间内的数据值将产生间断，数据值中的这类间断可通过平滑化处理而忽略。平滑化处理可通过例如移动平均法(moving average method)来完成。就这一点而言,进行平滑化处理的参数，例如在移动平均法中一次平均化中数据的点数、移动平均值的次数等，可根据在光信号数据获取时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)和/或BIN TIME而适当地设定。接下来，在平滑化处理后的时间序列光信号数据中，为了检测其中存在显著信号的时间域(脉冲存在区域)，计算平滑化处理后时间序列光信号数据随时间的第一微分值(步骤120)。如图7(B)所示的，在时间序列光信号数据的时间微分值中，中下行的“时间微分”，在信号值改变时值的变化增加，从而可通过参考时间微分值而有利地确定显著信号(脉冲信号)的起始点和终止点。其后，在时间序列光信号数据上顺次检测显著信号(脉冲信号)，并判断所检测的脉冲信号是否为对应于要观察颗粒的信号。具体地，首先在时间序列光信号数据的时间序列时间微分值数据上，通过顺次参照时间微分值来搜索并确定一个脉冲信号的起始点和终止点，从而确定脉冲存在的区域(步骤130)。当已确定一个脉冲存在的区域时，将钟形函数的拟合应用到在脉冲存在的区域中的平滑化的时间序列光信号数据(图7(B)，较下行的“钟形函数拟合”)，然后，计算钟形函数中的参数，例如峰值强度Imax;脉冲宽度(半高全宽(最小二乘法的)拟合时的相关系数等(步骤140)。就这一点而言，尽管要用于拟合的钟形函数典型地为高斯函数，但其也可为洛伦兹型函数。并判断所计算的钟形函数的参数是否在通过一个颗粒和发光探针的结合体或一个发光探针穿过光检测区域时所检测的光信号所描绘的钟形谱的假定参数的相应范围内，即，是否各峰值强度、脉冲宽度和相关系数在对应的预设范围内(步骤150)。因此，如图8左图所示，将所计算的钟形函数的参数 判定为在对应于一个颗粒和发光探针的结合体或发光探针的光信号中的假设范围内的信号判定为对应于一个要观察颗粒的信号，从而，检测一个要观察颗粒，并计数一个颗粒(将颗粒数相加。步骤160)。另一方面，如图8右图所示，所计算的钟形函数的参数不在假设范围内的脉冲信号忽略为噪音。时间序列光信号数据的整个区域内重复进行在上述步骤130-160的处理中的脉冲信号的搜索和判断，无论何时检测到一个要观察颗粒，都将其计数为一个颗粒。并且，当完成时间序列光信号数据的整个区域内的脉冲信号的搜索时(步骤170)，直到那时所得颗粒的计数值被认为是在时间序列光信号数据中检测到的要观察颗粒的数量。(iii)要观察颗粒的数密度或浓度的确定当已完成要观察颗粒的计数时，要观察颗粒的数密度或浓度可使用在时间序列光信号数据的获取期间光检测区域穿过的整个区域的体积来确定。然而，光检测区域的有效体积依赖于激发光或检测的光的波长、透镜的数值孔径和光学系统的调整条件而变化，因此，通常难以从设计参数值计算光检测区域的有效体积，并且也不容易计算光检测区域已穿过的整个体积。那么，典型地，用具有已知的颗粒浓度的溶液(参考溶液)在与要试验试样溶液的测量相同条件下如上所述进行光强度测量、发光颗粒的检测及其计数，然后，可由参考溶液中所检测的颗粒数和颗粒浓度来确定光检测区域已穿过的整个区域的体积，即要观察颗粒的检测数和浓度之间的关系。优选地，参考溶液的颗粒可为具有与要观察颗粒形成的颗粒和发光探针的结合体(或者在结合至要观察颗粒后已从所述颗粒分离的发光探针)相同的波长特性的发光标签(荧光染料等)。具体地，例如，假设在颗粒浓度为C的参考溶液中颗粒的检测数为N，则由下式给出光检测区域已穿过的整个区域的体积Vt Vt=N/C —(5)任选地，将多种不同浓度的溶液制备为参考溶液，对各溶液进行测量，然后，将所计算的Vt的平均值确定为光检测区域已穿过的整个区域的体积Vt。因此，当给出Vt时，给出其颗粒的计数结果为η的试样溶液的颗粒的数密度C c=n/Vt ---(6)
就这一点而言，可通过任意方法例如使用FCS和FIDA代替上述方法来给出光检测区域的体积和已穿过光检测区域的整个区域的体积。另外，在该实施方案的光学分析中，对于光检测区域的假设的移动模式，可预先在计算机18的存储设备中存储关于各种标准颗粒的浓度C和颗粒数N之间的关系(表达式(5))的信息，从而在进行光学分析时装置使用者可适当地使用关于该关系的存储信息。为了证实上述本发明的有效性，进行如下所述的实验。就这一点而言，应理解的是，以下实施方案仅说明本发明的有效性，而不意于限制本发明的范围。实施方案I使用荧光染料的核酸浓度的测暈使用作为DNA嵌入剂荧光染料的SYTOX Orange (当结合至DNA时其荧光强度显著增加的染料)作为发光探针，证实通过本发明的方法的试样溶液中DNA浓度的可测量范围 (参见图3 (c))。在这一点上，还测量来自用读板仪测量的荧光强度的DNA浓度的可测量范围作为对照实验。关于试样，通过将作为要观察颗粒的DNA(pbr322, Takara Bio, Inc. , Cat.No. 3035)溶解在包含 IOnM SYTOX Orange (Invitrogen Corp. , Cat. No. S-11368)的憐酸盐缓冲液(包括O. 05%吐温20)中以使DNA分子浓度为OM (参考溶液)、IOOfM, lpM、IOpM或IOOpM来制备多种试样溶液。就这一点而言，SYTOX Orange为当结合至DNA时其荧光强度增加约500倍的荧光染料(图3(c)中其波长特性改变的荧光染料的实例)。在根据本发明方法的测量中，装备有共焦荧光显微镜和光子计数系统的光学系统的单分子突光测量设备MF-20 (Olympus Corporation)用作光学分析装置，并根据上述“(2)试样溶液的光强度的测量”中所述的方式来获取上述各试样溶液的时间序列光子计数数据。在此时，将633nm激光用于激发光，并使用带通滤波器将检测光的波长设为660-710nm。将在试样溶液中的光检测区域的位置的移动速度设为15mm/秒；BIN ΜΕ设为lOysec.;和测量持续时间设为2秒。在光强度测量后，根据上述“(3) (ii)要观察颗粒的计数”中所述的步骤，计数在来自各试样溶液所获取的时间序列光子计数数据的时间序列数据中检测的光信号。在通过步骤110中数据的移动平均法平滑化时，一次平均的数据点为9个，移动平均处理重复5次。此外，在步骤140的拟合中，通过最小二乘法进行高斯函数对时间序列数据的拟合，(在高斯函数中)确定峰值强度、脉冲宽度(半高全宽)和相关系数。此外，在步骤150的判定过程中，仅将满足以下条件的脉冲信号判定为对应于要观察颗粒的光信号20 μ sec. < 脉冲宽度〈400 μ sec.峰值强度>1(光子/10 μ sec.)—⑷相关系数>0.95而不满足上述条件的脉冲信号忽略为噪音，然后，将判定为对应于要观察颗粒的光信号的数量计数为“脉冲数”。在对照实验中，使用读板仪SH_80001ab (Corona)测量上述各试样溶液的荧光强度。将激发光波长设为543nm ;检测光的波长设定为570nm ;激发侧和检出测的频带宽度均设定为12nm。在测量荧光强度时，进行3次施加50回激发光闪烁的测量，并将它们的平均值用作最终的荧光强度值。
图9(A)和(B)各自示出在各浓度的试样溶液中所检测的通过上述本发明方法的测量结果(脉冲数)和对照实验的测量结果(荧光强度)。首先，关于图9(A)，通过本发明方法测量的脉冲数(计数的光信号数)几乎与核酸浓度成比例地增加。根据该结果，已发现本发明方法能够一个接一个地检测单个核酸(要观察颗粒)，并发现通过根据本发明的方法计数单个要观察颗粒，可定量确定其浓度。另外，在图9(B)的对照实验中，可认识到在核酸浓度为OM情况下的荧光强度和在核酸浓度为IOOpM情况下的荧光强度之间无显著差异，而在图9(A)的本发明方法中，在核酸浓度为OM情况下的脉冲数和在核酸浓度为IOOfM情况下的脉冲数之间发现了显著差异。这些结果的原因被认为如下对于用读板仪测量的荧光强度，由于噪音或污染物产生的光信号重叠，因此在噪音或污染物对荧光强度的影响相当大的低浓度范围中S/N比变得更差。另一方面，在本发明的情况下，判断时间序列光信号数据中各脉冲信号是否对应于要观察颗粒，并且忽略判定为噪音或污染物的信号(参见图8)，因此，即使在噪音或污染物对荧光强度的影响相当大的低浓度区域，S/N比也保持相当良好。因此，已显示，根据本发明的方法，颗粒的数密度或浓度可确定为比通过使用荧光强度的常规方法可测量的数密度或浓度的限度还要低的浓度范围。另外，在包括例如荧光强度波动的计算等的统计学处理的光学分析技术如FCS、FIDA和PCH中可测量的颗粒浓度的下限约为InM，在本实施方案中可测量的颗粒浓度的下限为 IOOfM,因此，还显示，根据本发明能够测量浓度范围显著低于光学分析技术如FCS、FIDA和PCH的情况中的颗粒。顺便提及，参照图9结果的较高浓度侧，在本发明的情况下，在浓度从IOpM增加至IOOpM时脉冲数期望地增加约10倍，而在对照实验中，浓度从IOpM增加至IOOpM时荧光强度的增加宽度比期望的10倍小。该现象可被认为如下在本实施方案的系统中，如图9 (C)左图所示，两种或更多种荧光染料一起结合至为要观察颗粒的核酸。在该情况下，当核酸浓度低于荧光染料浓度时，存在大量染料，因此已结合至一个核酸的染料数量是稳定的，但如图9 (C)右图所示，当核酸浓度较高时，染料的数量变得相对不足，而已结合至一个核酸的染料数量减少，因此可认为荧光强度不容易跟随核酸浓度而增加。另一方面，由于将本发明设计为可计数对应于要观察颗粒的光信号的数量，因此由于已结合至一个核酸的染料数量的减少所引起的影响小，因此可认为脉冲数期望地增加至较高浓度范围。这表示，根据本发明的方法，在两种或更多种发光探针结合至要观察颗粒的系统中，可确定颗粒的数密度或浓度达到高于可在现有技术中假设荧光强度与发光探针的数密度或浓度成比例的情况下可测量的数密度或浓度的上限的浓度范围。实施方案2使用分子信标的核酸检测证实可根据本发明的方法使用分子信标来检测具有特定碱基序列的核酸分子。如前面所述，分子信标为其中供体染料和受体染料已分别添加至其两端的核酸分子，并将该分子设计为在单个分子中，供体染料和受体染料之间的距离如此近以至于可发生从供体染料向受体染料的荧光能量转移现象，但是当其结合至具有与其自身碱基序列互补的碱基序列的核酸或核酸类似物时，供体染料和受体染料之间的距离增加，从而不会发生荧光能量转移现象(参见图3(d))。在实验中，作为分子信标，使用具有以下碱基序列的核酸，其中TAMRA(供体染料)连接至5’端，BHQ_2(受体染料，在该情况下，荧光很难发出。)添加至3’端TAMRA-cctacgccaacagctccaactacgtagg-BHQ2另外，对于要观察颗粒，使用具有如下碱基序列的核酸gtagttggagctgttggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcag上述核酸通过请求Sigma genosis, Inc.来合成。然后，为了制备试样溶液,上述分子信标和要观察颗粒(核酸)分别以500pM和IOOnM溶解在磷酸盐缓冲液(包括O. 05%吐温20)中。对于对照溶液，制备仅包含500pM分子信标而无要观察颗粒(核酸)的溶液。在与实施方案I的情况相同的条件下进行通过本发明的方法的试样溶液和对照溶液的测量。另外，作为对照实验，类似于实施方案I的情况，使用将激发光的波长设为550nm，检测光的波长设为576nm的读板仪测量试样溶液和对照溶液的荧光强度。图10 (A)和⑶各自示出对于试样溶液(MB+靶标)和参考溶液(仅MB)通过上述本发明方法的测量结果(脉冲数)和通过对照实验的测量结果(荧光强度)。首先，参照图10(A)清楚地示出，与对照溶液的情况相比，包含要观察颗粒核酸的试样溶液的脉冲数显著增加(6倍差)，方差也小。另一方面，在图10(B)的对照实验的情况中，看到试样溶液和对照溶液之间荧光强度平均值的差异，但方差大。正如前面所提及，本实施方案中的分子信标的浓度为500pM，如从实施方案I的结果所理解的，认为该浓度接近于可由使用读板仪的荧光强度所测量的浓度下限，图10的结果示出，与基于荧光强度的常规检测方法的情况相比，根据本发明的方法，使用分子信标检测具有某一特定碱基序列的核酸还可在低发光探针浓度的溶液中以较好的精确度实现。实施方案3在未反应的荧光标记探针已通过物理纯化除去的试样溶液中的核酸检测证实，在荧光标记的短核酸(荧光标记探针)作为发光探针与为要观察颗粒的核酸(靶核酸)结合后，可根据本发明的方法在通过借助物理纯化除去未反应的荧光标记探针而获得的试样溶液中检测到靶核酸。(参见图3(a))具体地，通过将退火处理(退火温度95°c、90°c、8(rc、7(rc、6(rc、5(rc、4(rc、30°C、20°C各IOmin,-O. 1°C /sec.)应用到通过以IOOpMilOnM的比例将靶核酸和荧光标记探针混入STE缓冲溶液(200mM NaCl，IOnM Tris, InM EDTA, pH=7. O)中所获得的溶液中来制备样本(探针-靶标)，通过类似地将退火处理应用到通过将荧光标记探针溶解在IOnM的STE缓冲溶液而获得的溶液来制备样本(探针)。所使用的靶核酸和荧光标记探针的碱基序列如下靶核酸5，-gaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttac-3>突光标记探针ATT0647N_ggggatcctctagagtcgacc(ATTOM7N 为荧光染料。)其后，使用硅胶膜将这些样本的部分纯化(QIAGEN的纯化试剂盒(MinElute PCRPurification kit))，并用50L STE缓冲溶液洗脱。然后，在与实施方案I的情况相同的条件下，根据本发明的方法进行光的测量和脉冲信号的检测，将用硅胶膜纯化的各样本(纯化)和未精制的样本(未纯化)作为试样溶液。就这一点而言，将IOOyW激光用于激发光，进行3次光测量时间为20秒的测量。图11示出在各样本中检测的脉冲数的平均值(条形图)和标准差(误差条)。如从图中所理解的，虽然在未纯化的样品(未纯化)中，在包含靶核酸的情况(探针-靶标)和不包含靶核酸的情况(探针)之间几乎未发现脉冲数的差异，但在纯化样本(纯化)中，与包含靶核酸的情况(探针-靶标)相比，不包含靶核酸的情况(探针)中的脉冲数基本上减少。即，这显示出，通过借助物理纯化(用硅胶膜纯化)除去未反应的发光探针，变得能够选择性地检测要观察颗粒。实施方案4利用荧光能暈转移(FRET)的核酸检测证实，在将当彼此相互接近时引起荧光能量转移的两种荧光标记的短核酸(供体肽核酸，受体肽核酸)作为发光探针与作为要观察颗粒的核酸(靶核酸)结合，然后使得特 异性结合至未反应的发光探针的光受体(猝灭探针)结合至未反应的发光探针从而猝灭来自未反应的发光探针的荧光标签的光的条件下，当使得荧光能量转移现象在供体肽核酸和受体肽核酸之间发生时(参见图12(a))，通过检测来自受体肽核酸(用作能量受体的发光探针)的光可选择性地检测靶核酸，并可确定靶核酸的浓度(参见图3(b)和(e))。具体地，制备包含O. l%Pluronic F-127 的试样溶液(IOmM Tris-HCl (ρΗ8· O))，其中添加荧光能量供体肽核酸(PANAGENE)和受体肽核酸(PANAGENE)以使二者分别为200ρΜ，靶核酸(SIGMA GEN0SYS)添加为lpM、IOpM或ΙΟΟρΜ。还制备不包含靶核酸的试样。然后，在各试样溶液通过在95°C下加热5分钟而变性后，通过将液体温度逐渐减少至20°C而形成靶核酸和肽核酸的缔合体(温度降低速度设为O.10C /sec.，在90°C 5分钟；80°C 10分钟；70°C 10分钟；60°C 10分钟；50°C 10分钟；40°C 10分钟；和30°C 10分钟下进行降温处理。)。其后，供体肽核酸用猝灭探针(SIGMA GEN0SYS)和受体肽核酸用猝灭探针(SIGMAGEN0SYS)分别以InM添加，20°C下进行温育30分钟。供体肽核酸、受体肽核酸、猝灭供体肽核酸用核酸、猝灭受体肽核酸用核酸和靶核酸的碱基序列分别如下供体妝核酸Alexa488-00_cctacgccaccagctccaac受体妝核酸agctgtatcgtcaaggcact-0-Lys_Alexa594猝灭供体肽核酸用核酸ggagctggtggcg-BHQl-dT-agg-BHQl猝灭受体肽核酸用核酸BHQ2-ag-BHQ2-dT-gccttgacgataca靶核酸atRactRaatataaacttRtRRtaRttRRaRctRRtRRCRtaRRcaaRaRtRccttRacRatacaRctaattcagaat在靶核酸中，左侧下划线为结合至供体肽核酸的序列，右侧下划线为结合至受体肽核酸的序列。Alexa488和Alexa594为荧光染料，BHQl和BHQ2分别为Alexa488和Alexa594的粹灭分子。接下来，使用上述试样溶液，根据本发明的方法进行光的测量、脉冲信号的检测和计数。在测量中，将装备有共焦荧光显微镜和光子计数系统的光学系统的单分子荧光测量设备MF20 (Olympus，Inc.)用作光学分析装置，以获取各上述试样溶液的时间序列光子计数数据。在该情况下，对于激发光，使用1-mW 488nm的激光(对应于供体肽核酸的荧光染料Alexa488的激发波长)，并用长通滤波器将检测光的波长设为615nm_ (对应于受体肽核酸的荧光染料Alexa594的发光波长)。将在试样溶液中的光检测区域的位置的移动速度设为67. 5mm/sec.，将ΒΙΝ ΜΕ设为10 μ sec.，测量时间设为2秒。另外，各试样进行五次测量。在测量光强度后，类似于实施方案1，在所获取的各试样溶液的时间序列光子计数数据上进行脉冲信号的检测和计数。并且，计算那些检测的脉冲数的平均值和标准差。图12 (B)示出在具有上述各浓度靶核酸的试样溶液中检测的脉冲数的平均值(条形图)和标准差(误差条)。参照附图，IpM以上浓度中，脉冲数随着靶核酸浓度的增加而增加。这表明，通过使引起荧光能量转移的两种发光探针结合至要观察颗粒并检测为能量受体的发光探针的光，使要观察颗粒的选择性检测和其浓度的测定变得可能。实施方案5利用荧光猝灭法的核酸(要观察颗粒)检测 证实，在使荧光标记的短核酸(荧光标记探针)作为发光探针结合至为要观察颗粒的核酸(靶核酸)后，将标记有荧光猝灭分子的核酸(猝灭探针)应用于未反应的荧光标记探针，根据本发明的方法，可在试样溶液中检测靶核酸(参见图3 (b))。具体地，将其5'端被荧光染料Alexa488修饰的单链核酸(荧光探针)和其3'端被猝灭分子BHQl修饰的单链核酸(猝灭探针)分别以5nM和2M溶解在IOOmMTris-HCl (pH8. O)溶液(Tris缓冲液)中。另外，类似地，将双链核酸(靶核酸)以IOOpM,InM和IOnM溶解在Tris缓冲液中。接下来，混合5 μ L荧光探针溶液、5 μ L猝灭探针溶液、5 μ L各靶核酸溶液和35 μ L Tris缓冲液。用热循环仪将这些溶液的温度升至95°C，然后经90分钟降至20°C，以使荧光探针与靶核酸杂交。荧光探针、猝灭探针和靶核酸的碱基序列如下(以5' —3'方向表示)突光探针aaacttgtggtagttggagctgttggcgtagg粹灭探针aacagctccaactaccacaagttt靶核酸gaagtacagttcattacgatacacgtctgcagtcaactggaattttcatgattgaattttgtaaggtattttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaataggggtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgatacagataaaggtttctctgaccattttcatgagtacttattacaagataattatgctgaaagttaagttatctgaaatgtaccttgggtttcaagttatatgtaaccattaatatgggaactttact在上述试样溶液中，由于存在大量猝灭探针，所有未结合至靶核酸的荧光探针结合至猝灭探针，从而使来自结合至猝灭探针的荧光探针的荧光基本上被猝灭(参见图13 ⑷)。然后，根据本发明的方法，使用上述试样溶液进行光的测量、脉冲信号的检测和计数。在测量中，将装备有共焦荧光显微镜和光子计数系统的光学系统的单分子荧光测量设备MF20 (Olympus，Inc.)用作光学分析装置，以获取各上述试样溶液的时间序列光强度数据(光子计数数据)。在该情况下，对于激发光，使用200yW488nm的激光，并用带通滤波器测量波长带域为510-560nm的光，并产生时间序列光强度数据。试样溶液中的光检测区域以15mm/秒的移动速度旋转，BIN TIME设为10 μ sec.，测量2秒，进行5次。然后，类似于实施方案1，在使通过测量获得的时间序列光强度数据平滑化后，通过微分完成峰的检测。在能够被看作是脉冲信号的区域中，计数可大致具有高斯函数并具有I以上强度的脉冲。从各试样溶液获得的脉冲数(五次测量的平均值)示于图13⑶。如从图中所理解的，脉冲数随着靶核酸浓度的增加而增加。特别地，在OM和IOOpM的情况之间的五次测量的标准差中无重叠这表明，根据本实施方案的方法，能够测量IOOpM以上的核酸浓度。实施方案6利用QUAL反应的核酸检测证实,根据本发明的方法,利用QUAL (粹灭自连接，Quenched auto-ligation)反应(非专利文献4)可检测具有特定碱基序列的核酸分子。如图14(A)所示，在QUAL反应 中，当将其中5'端标记有彼此相互接近的荧光分子(白色圆)和猝灭分子(黑色圆)的单链核酸(E探针-发光探针)和其中3'端被磷酰硫酸盐(phosphosulfate)修饰的单链核酸(N探针)在彼此接近的E探针的5'端与N探针的3'端的情况下结合至具有要试验的碱基序列的单链核酸(靶核酸-要观察颗粒)上时(图14(A)较上行)，E探针和N探针彼此结合(在图中，指定为X的部位)，同时释放5'端上的猝灭分子(图14(A)较下行)，以致5'端的荧光分子发光，从而变得能够检测具有特定碱基序列的核酸的存在。即，这是其中发光效率依赖于要观察颗粒的种类而改变的反应实例(参见图3(h))。具体地,将5'端被粹灭分子Dabcyl修饰和自5'端起第三个碱基t被突光分子Alexa488修饰的单链核酸(E探针,Japan bio-service)和3'端被磷酰硫酸盐修饰的单链核酸(N 探针，Japan bio-service)分别以 IOnM 和 IOOnM 溶解在 IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)溶液中。另外，类似地，将单链核酸(靶核酸)分别以10pM、100pM、lnM和IOnM溶解在IOOmMTris-HCl (pH8. 0)溶液中。然后，混合3yL E探针溶液、3 μ L N探针溶液、3 μ L各靶核酸溶液和21 μ L包含400mM NaCl的IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)溶液，用热循环仪将这些溶液的温度升至95°C，并随后在50°C下进行反应I小时。E探针、N探针和靶核酸的碱基序列如下E 探针tcttgcctacgccaccagctccaacN 探针 ttctgaattagctgtatcgtcaaggcac靶核酸gttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgaegataeagctaatteagaa因此，仅当E探针和N探针结合至靶核酸并释放E探针上的猝灭分子Dabcyl时，才会检测到E探针上的Alexa488的光。接下来，根据本发明的方法，使用上述试样溶液进行光的测量、脉冲信号的检测和计数。在测量中，将装备有共焦荧光显微镜和光子计数系统的光学系统的单分子荧光测量设备MF20 (Olympus，Inc.)用作光学分析装置，以获取各上述试样溶液的时间序列光强度数据(光子计数数据)。在该情况下，对于激发光，使用200 μ W480nm的激光并用带通滤波器测量波长带域为510-560nm的光，并产生时间序列光强度数据。试样溶液中的光检测区域以15mm/秒的移动速度旋转，BIN TIME设为10 μ sec.，测量2秒，进行5次。然后，类似于实施方案1，在使通过测量获得的时间序列光强度数据平滑化后，通过微分完成峰的检测。在能够被看作是脉冲信号的区域中，计数可大致具有高斯函数并具有I以上的强度的脉冲。如图14⑶所示，脉冲数随着靶核酸浓度的增加而增加。特别地，在OM和IOpM的情况之间的五次测量的标准差中无重叠这表明，根据本实施方案的方法，能够测量IOpM以上的核酸浓度。因此，根据上述本发明的方法，通过在试样溶液中移动微小区域即光检测区域的位置，即，扫描试样溶液内部并单独检测穿过光检测区域的颗粒或在不包括FCS、FIDA等中进行的统计学处理例如荧光强度波动的计算的情况下进行颗粒的计数，变得能够检测要观察颗粒的浓度或数密度低于FCS、FIDA等中所使用的水平的试样溶液中的要观察颗粒的状态或特性。就这一点而言，由于本发明的光学分析技术基本上使用与FCS、FIDA等相同的光学系统，所以其可与FCS、FIDA等一起进行。例如，在检测包含两种或更多种物质的溶液中这些物质之间的相互作用等的情况下，当物质之间的浓度差大时，例如，当一种物质的浓度为nM级，另一物质的浓度为pM级时，可以以如下方式进行对于较高浓度的物质通过FCS或FIDA进行测量和分析，而对于较低浓度的物质通过本发明的光学分析技术进行测量和分析。在此情况下，如图1(A)所示，有利于制备两种或更多种光检测器。
权利要求
1.一种光学分析方法，其通过使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自结合至在试样溶液中分散并随机运动的颗粒的发光探针的光从而检测所述颗粒，所述方法的特征在于包括以下步骤制备包含所述颗粒和所述发光探针的试样溶液，通过改变所述光学系统的光学通路而在所述试样溶液中移动所述光学系统的光检测区域的位置；在所述试样溶液中移动所述光检测区域的位置时，检测来自所述光检测区域的光；和在所述检测光中单独检测来自已结合至各所述颗粒的所述发光探针的光信号，从而单独检测所述颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括以下步骤对所述单独检测的颗粒的数量计数，从而对移动所述光检测区域的位置的过程中所检测的所述颗粒的数目计数。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述移动光检测区域的位置的步骤中，所述光检测区域的位置以预设的速度移动。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，在所述移动光检测区域的位置的步骤中，所述光检测区域的位置以比已结合至所述颗粒的所述发光探针的扩散移动速率快的速率移动。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，在所述单独检测来自已结合至各所述颗粒的所述发光探针的所述光信号从而单独检测所述颗粒的步骤中，基于检测的时间序列光信号的形状来检出一个颗粒进入所述光检测区域。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述制备所述试样溶液的步骤包括从所述试样溶液中分离未结合至所述颗粒的发光探针的步骤。
7.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述制备所述试样溶液的步骤包括使吸收来自所述发光探针的光的受体与未结合至所述颗粒的所述发光探针结合的步骤。
8.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述发光探针为当所述发光探针结合至所述颗粒时其发光特性改变的物质，和所述检测光为从已结合至所述颗粒的所述发光探针发出的光。
9.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述发光探针为具有能量供体部位和能量受体部位的物质，当所述能量供体部位和能量受体部位相互接近时引起荧光能量转移现象，其中所述能量供体部位和所述能量受体部位的距离在所述物质已结合至所述颗粒时的状态和在所述物质未结合至所述颗粒时的状态之间不同，从所述物质发出的光的波长特性在所述物质已结合至所述颗粒时的状态和在所述物质未结合至所述颗粒时的状态之间不同；和所述检测光为从所述已结合至所述颗粒的发光探针发出的光。
10.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述发光探针具有引起荧光能量转移现象的能量供体部位和能量受体部位；所述制备所述试样溶液的步骤包括进行将已结合至所述颗粒的所述发光探针分解的反应的步骤；和所述检测光为从通过所述反应分解的所述发光探针发出的光。
11.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于所述发光探针包括作为在荧光能量转移现象中的能量供体的第一探针和作为在荧光能量转移现象中的能量受体的第二探针；和所述检测光为通过在所述第一和第二探针已结合至所述颗粒的状态下发生的所述荧光能量转移现象而发出的所述第二探针的光。
12.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述颗粒具有作为由所述发光探针发出的光的能量受体的部位；和所述检测光为通过在所述发光探针结合至所述颗粒时发生的荧光能量转移现象而从所述颗粒的能量受体部位发出的光。
13.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述颗粒具有发光部位；所述发光探针具有作为所述颗粒的发光部位发出的光的能量受体的部位；和所述检测光为通过在所述发光探针结合至所述颗粒时发生的荧光能量转移现象而从所述发光探针发出的光。
14.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述颗粒为核酸，所述发光探针为核酸结合蛋白。
15.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述发光探针为由至少两种组分组成并且当结合至所述颗粒且所述至少两种组分的相互位置变化时发出荧光的物质。
全文摘要
公开了一种光学分析技术，其可使用发光探针检测试样溶液中的靶颗粒的状态或性质，所述试样溶液具有低浓度或数密度的所述靶颗粒。所述光学分析技术使用可检测来自溶液微小区域中的光的光学系统如共焦显微镜或多光子显微镜光学系统，从而在改变试样溶液中微小区域的位置时(即，在借助微小区域扫描试样溶液时)，检测来自结合至靶颗粒的发光探针的光，结果，单独检测穿过微小区域的颗粒，使得能够计数所述颗粒并获得所述颗粒的浓度或数密度的信息。
文档编号G01N21/64GK103026205SQ201180036710
公开日2013年4月3日 申请日期2011年7月21日 优先权日2010年7月26日
发明者田边哲也, 中田秀孝, 叶梨拓哉, 堀邦夫, 西川和孝 申请人:奥林巴斯株式会社