Tsh免疫测定以及用于在存在内源性污染物的情况下以有限洗涤形式进行tsh免疫测定的方法
【专利摘要】本发明涉及使用ELISA夹心测定进行的低洗涤促甲状腺激素(TSH)免疫测定，所述夹心测定具有有限的或不具有抗原捕获、检测抗体添加和底物导入步骤之间的洗涤步骤。本发明显示出与生物相似性干扰性交叉反应性物质例如滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)的低的交叉反应性。
【专利说明】TSH免疫测定以及用于在存在内源性污染物的情况下以有限洗涤形式进行TSH免疫测定的方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本发明要求2011年5月27日提交的美国临时申请号61/491，088 (将其完整内容和公开内容通过引用并入本文)的优先权。
发明领域
[0003]本发明总地来说涉及在具有最小洗涤容量的系统中进行免疫测定的方法。特别地，本发明涉及在存在促甲状腺激素(TSH)的相关的污染性(交叉反应性)内分泌糖蛋白激素类似物的情况下进行促甲状腺激素(TSH)测定的方法。本发明还涉及选择具有用于进行TSH测定的最佳性能特性的抗体的方法。这些测定还受益于包含进一步减小干扰性物质例如内分泌糖蛋白激素类似物的作用的清除剂(scavenging reagents)。
[0004]发明背景
[0005]最早于1959年开发的免疫测定已成为用于人和兽医学健康以及环境测试的有用的灵敏诊断工具(Wu，2006，Clinica Chimica Acta, 369:119)。其应用已是广泛的并且在本领域是熟知的。
[0006]存在几个进行免疫测定的方法，本发明聚焦在非竞争性或夹心免疫测定上。免疫测定还可被分类为非均相的或均相的。均相测定具有更简单的测定特征，但已被限定于高浓度药物(Engel & Khanna, 1992, Journal of Immunological Methods, 150:99)。非均相测定需要将结合的材料与未结合的材料分离并且是本发明的焦点。
[0007]夹心免疫测定通常作为两步测定来进行，所述测定包括首先将含抗原样品引入共价连接至固体支持物的捕获抗体。然后洗掉非特异性样品组分，留下结合至固体支持抗体的目标抗原。在第二步骤中，将检测或信号抗体引入测定，随后进行另一个洗涤步骤。最后，将检测底物添加至测定中来定量抗原浓度。具有相关洗涤步骤的两步骤免疫测定通常是优选的，因为它们减弱本底信号，从而允许高灵敏性检测。
[0008]“一步”夹心免疫测定可通过将检测抗体和含抗原样品一起引入共价连接至固体支持物的捕获抗体来进行。洗涤所得的测定以除去未结合的试剂。最后，将检测底物添加至测定以定量抗原浓度。
[0009]存在对具有有限洗涤液体积的一步测定的需要，因为它们更简单并且需要更少的步骤和更少的相关硬件复杂性来进行操作(特别是在护理现场应用中)。对于护理现场设备，减少或消除对洗涤步骤的需要减少了装置成本和测定时间、硬件成本和复杂度以及一次性装置的尺寸，这继而有益于减少环境中的废弃物以及其成本。
[0010]迄今为止，具有有限洗涤步骤或无洗涤步骤的一步免疫测定未曾用于抗原，其中内源相关抗原的存在产生混淆检测结果的高本底。当内源抗原以超过目标抗原的高摩尔浓度被发现(这对于一些疾病状况是常见的)时，这尤其如此。
[0011]有问题的抗原的实例是促甲状腺激素(TSH)，也称为促甲状腺素，其通常与相关的内分泌糖蛋白激素绒毛膜促性腺激素(CG)、促黄体激素(LH)和滤泡刺激激素(FSH)组合地存在。这4种相关激素具有相同的a亚基和高度相似的P亚基(Vassart，2004，Trendsin Biochemical Sciences, 29 (3): 119)。因此，抗a亚基的抗体不区分这4种激素(ffada, 1982, Clinical Chemistry, 28 (9): 1862)。也难以鉴定可区分所述4种相关激素的3 -特异性抗体(特别是在极高浓度的污染性激素存在的情况下)，因为这些激素具有极相似的初级序列(Cornell, 1973，The Journal of Biological Chemistry, 248(12):4327) ?此外，还难以鉴定TSH上的独特(抗原性)表位以及难以获得识别这些独特表位的抗体。对于夹心测定，还很重要的是:使用不重叠的捕获和信号抗体，所述抗体具有适当的特异性特征，这进一步限制了抗体的选择。
[0012]夹心免疫测定中的洗涤步骤帮助减少反应中的污染性激素的浓度，这减少了与污染性物质相关的信号。因此，不具有洗涤步骤或具有有限洗涤能力的一步夹心免疫测定一直以来在相关污染性激素分子存在的情况下，尤其当污染物以极高浓度存在时，不能特异性检测TSH。参见，例如，US20080311676，其描述了在免疫测定中使用洗涤步骤来减少交叉反应性物质的浓度的重要性。解决这些问题的努力可见于Hashida等人1986，AnalyticalLetters, 19，1121-36; Soos 等人，1984，Journal of Immunological Methods, 73，237;和Lode 等人,2003Clinical Biochemistry, 36, 121 中。
[0013]EP173973描述了用于TSH的测定的方法，其中使用具有特定缔合常数值的抗-(6-亚基TSH单克隆抗体。相关EP212522描述了特征在于TSH-P亚基特异性单克隆抗体识别不同表位的测定。该方法寻求减小因其它糖蛋白激素例如LH、CG和FSH存在而导致的抑制。
[0014]存在对具有减少的或消除的洗涤能力的一步骤夹心免疫测定(特别是用于护理现场测定的那些免疫测定)，以及特别地用于检测TSH的一步夹心免疫测定的需要。此外，存在对鉴定能够进行这样 的免疫测定的抗体试剂的需要。
[0015]发明概述
[0016]本发明涉及用于检测液体样品中的促甲状腺激素(TSH)，同时使由高度相关的内源内分泌糖蛋白激素滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)引起的干扰降至最低的装置、免疫测定和方法。
[0017]在一个实施方案中，本发明是促甲状腺激素(TSH)夹心免疫测定，包括至少两种表位相容性抗体，包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体，其中两种抗体对于TSH的解离常数(Kd)小于InM或为约InM，例如不超过0.5nM或不超过0.15nM，并且其中捕获抗体对于滤泡刺激激素(FSH)的Kd值大于1000nM,大于2500nM或大于3000nM，并且对于促黄体激素(LH)的Kd值大于500nM，大于1000nM或大于3000nM ;并且对于绒毛膜促性腺激素(CG)的Kd值大于200nM，大于500nM或大于2500nM，并且其中所述免疫测定使用单一洗漆步骤。
[0018]在另一个实施方案中，本发明是用于进行TSH免疫测定的方法，该方法包括步骤:(a)将液体样品插入于导管中包含免疫传感器的装置，所述免疫传感器具有针对TSH的捕获抗体；(b)将信号抗体溶解入所述液体样品中；(c)在所述免疫传感器上形成夹心复合物，所述复合物包含所述捕获抗体、TSH和所述信号抗体；(d)在不超过一个洗涤步骤中利用洗涤液从传感器洗掉未复合的信号抗体；和(e)检测与所述复合的信号抗体相关的信号。优选地，捕获抗体和信号抗体各自具有不超过InM，不超过0.5nM或不超过0.15nM的对于TSH的解离常数(Kd)。夹心复合物优选通过所述捕获和信号抗体与液体样品的大体上非相继的接触来形成。优选地在不存在一个或多个用于减少与FSH、LH和CG中的一个或多个的交叉反应的间插洗涤步骤的情况下形成夹心复合物。优选地，所述方法包含单一洗涤步骤以从捕获抗体除去样品和未结合的信号抗体，并且其中洗涤液包含用于报告分子的底物。该方法还包括下列步骤:在计量室中计量液体样品以形成具有I至500ia体积的计量的样品。任选地，该方法还包括爆裂洗涤液小袋以释放5至500 y L的洗涤液进入所述导管的步骤，所述洗涤液小袋与所述免疫传感器是流体连通的。任选地可以在洗涤液中形成多个空气段以促进免疫测定的洗涤。
[0019]在另一个实施方案中，本发明是用于非相继测定和具有低洗涤液循环的测定的TSH夹心免疫测定抗体选择方法，包括至少两种表位相容性抗体，包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体，其中捕获抗体对于TSH的解离常数(Kd)小于约InM，小于0.5nM或小于0.15nM，并且其中捕获抗体对于FSH的Kd值大于IOOOnM,大于2500nM或大于3000nM，对于LH的Kd值大于500nM，大于IOOOnM或大于3000nM ;并且对于CG的Kd值大于200nM，大于500nM或大于2500nM，并且其中信号抗体对于TSH的Kd小于约InM，小于0.5nM或小于0.15nM，并且其中信号抗体对于FSH的Kd值大于250nM或大于IOOOnM,对于LH的Kd值大于35nM，大于200nM或大于250nM ;并且对于CG的Kd值大于35nM或大于250nM。
[0020]在优选方面，所述信号抗体对于FSH的Kd优选大于250nM或大于IOOOnM,对于LH的Kd优选大于35nM，大于200nM或大于250nM，或大于IOOOnM,对于CG的Kd优选大于35nM或大于250nM。任选地，所述捕获抗体对于FSH的Kd值优选大于IOOOnM,优选大于2500nM或大于3000nM，对于LH的Kd值大于500nM，大于IOOOnM或大于3000nM，对于CG的Kd值优选大于200nM，大于500nM或大于2500nM。就范围而言，捕获抗体任选地具有范围在1000至5000nM内的Kd (FSH)，范围在500至5000nM内的Kd (LH)以及范围在200至5000nM内的Kd(CG)。信号抗体优选具有范围在250至5000nM内的Kd(FSH)，范围在200至5000nM内的Kd (LH)以及范围在35至5000nM内的Kd(CG)。更优选地，捕获抗体具有1000至5000nM内的Kd(LH)以及500至5000nM的Kd(CG)，并且更优选地，信号抗体具有35至5000nM的Kd(LH)。所使用的液体样品优选包括稀释的血液样品、未稀释的血液样品、稀释的血浆样品或非稀释的血浆样品。
[0021]捕获抗体和信号抗体各自优选能够结合TSH的TSH-P亚基上的至少两个不同表位。因此，捕获抗体和信号抗体优选是表位相容性抗体。在特别优选的实施方式中，捕获抗体和信号抗体选自下列捕获/信号抗体对:5409/T25C和T25C/5409。例如，捕获抗体可以包括小鼠单克隆抗体(Biospacific Cat#5409SPTNE-5)并且信号抗体可以包括小鼠单克隆抗体(Fitzgerald Cat#10_T25C)。
[0022]在一个方面，捕获抗体具有大于2500，例如大于3000的第一 Kd比率Kd(FSH):Kd(TSH)，并且信号抗体具有大于1500，例如大于1800的第二 Kd比率Kd(FSH):Kd(TSH)。任选地，第一 Kd比率为1500至50000，并且第二 Kd比率为1500至50000。更优选地，捕获抗体具有大于6000的第一 Kd比率Kd (FSH): Kd (TSH)。
[0023]附图概述:
[0024]根据下列非限定性图本发明将获得更好地理解。
[0025]图1是免疫传感器筒盖的等长俯视图；[0026]图2是免疫传感器筒盖的等长仰视图；
[0027]图3是免疫传感器筒的胶带垫圈的布局的俯视图；
[0028]图4是免疫传感器筒底座的等长俯视图；
[0029]图5是免疫传感器筒的布局的示意图；
[0030]图6是免疫传感器筒内的流体和空气路径、包括利用干试剂修正流体的位置的示意图；
[0031]图7显示CG的基于FRET的结合数据和其Kd值的测定；
[0032]图8显示FSH和LH的磁性珠粒捕获；
[0033]图9是显示使用聚苯乙烯珠粒产生的减少的FSH的交叉反应性的图；
[0034]图10是显示使用聚苯乙烯珠粒产生的减少的LH的交叉反应性的图；和
[0035]图11是显示使用磁性珠粒产生的减少的FSH的交叉反应性的图。发明详述
[0036]引言
[0037]在不同的实施方案中，本发明涉及免疫测定、用于在干扰性物质存在的情况下，进行夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)(优选具有有限的洗涤步骤或不具有洗涤步骤)的装置和方法。本发明有益地允许在这些污染性干扰性物质存在的情况下获得准确的测定结果。在第一实施方案中，本发明涉及用于进行促甲状腺激素(TSH)夹心免疫测定的装置和方法以及选择用于这样的免疫测定的抗体的方法。在第二实施方案中，本发明涉及免疫测定，特别是TSH免疫测定，以及使用单个洗涤步骤或不使用洗涤步骤的相关装置和方法。在第三实施方案中，本发明涉及免疫测定，特别是TSH免疫测定，以及使用以针对内源性污染物的抗体涂覆的清除珠粒的相关装置和方法，所述清除珠粒减小或消除与此类污染物相关的干扰。或者，可将此类抗体共价地结合至筒表面或可在反应介质中包含游离抗体。任选地，可将这些实施方案的一个或多个彼此组合。
[0038]TSH免疫测定和选择用于TSH免疫测定的抗体的方法
[0039]在第一实施方案中，本发明涉及针对TSH的免疫测定和用于进行这样的测定的相关装置和方法。尽管在高度相关的内源性内分泌糖蛋白激素滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)存在的情况下，本发明的免疫测定仍有益地提供TSH的准确检测。在某些疾病状态下，这些相关激素可以以非常高的浓度存在。在本文中就1-STAT?,免疫测定平台(Abbott Point of Care Inc.，Princeton, NJ, USA)对上述测定进行了示例，所述测定平台是低洗涤容量平台。参见共同拥有的美国专利号7，419，821，将其整体通过引用并入本文。在本说明书中，术语“低洗涤”包括组合的一次性测试装置，其包括具有相对少量(通常大约数十微升至约5毫升)的洗涤液的小袋，或类似的装置(其中从与所述装置衔接的仪器递送相似量的洗涤液)。在一些示例性实施方案中，装置和方法使用5至500 ii L，例如25至250 y L，或50至150 u L，优选约100 u L的洗涤体积。其还包括这样的测定概念，其中将捕获抗体、分析物和信号抗体混合在一起以形成夹心免疫测定，随后将洗涤液用于从在捕获抗体上形成的夹心除去具有未结合的分析物和未结合的信号抗体的样品，所述捕获抗体优选以一定的方式固定例如固定在可具有磁性的珠粒上或固定在传感器上。通常将这些类型的装置和系统与病患护理现场的测试结合。
[0040]在另一个方面，本发明涉及选择用于在具有有限的洗涤容量的系统中进行夹心ELISA测定的抗体的方法。具体地，选择具有减小的交叉反应性的抗体，这继而增加夹心ELISA的分析特异性。这些特征对于低洗涤夹心ELISA测定特别有用。作为具体的实例，本文中显示了在内源性内分泌糖蛋白激素FSH、LH和CG存在的情况下使用1-STAT⑩筒的TSH测定的性能。相反地，测定TSH的典型的现有商业系统利用多个洗涤步骤来减少在某些疾病状况下可能以高摩尔浓度存在的内源性内分泌糖蛋白激素的存在。然而，很明显地，这些多洗涤系统也受益于具有本说明书中公开的这些特异性特征的抗体的使用，并且本发明不应当被认为限定于使用有限的洗涤容量的免疫测定系统或装置。
[0041 ] 在优选实施方案中，选择两个夹心抗体，其主要针对TSH分子的P -亚基或与该区域的表位重叠，其显示期望的特异性程度。这两个夹心抗体的理想特征是它们识别TSH的^ -亚基的表位(优选地不同表位)和不唯独地TSH的a -亚基。预期该识别可包括横跨a和0亚基的表位，显示对TSH的高亲和力和对其它交叉反应性物质的低亲和力。此外，这些抗体优选显示对于TSH分子的低Kd，同时具有对于其它内源性糖蛋白激素FSH、LH和CG的高Kd值。
[0042]如本文中所用，术语“解离常数”或“Kd”是指一般反应的平衡常数:
[0043]
【权利要求】
1.一种促甲状腺激素(TSH)夹心免疫测定，其包括至少两种表位相容性抗体，包含至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体，其中两种抗体对于TSH的解离常数(Kd)均小于InM或为约InM，并且其中捕获抗体对于滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)的Kd分别大于1000nM,大于1000nM,和大于500nM，并且其中该免疫测定使用单一洗涤步骤。
2.权利要求1的免疫测定，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.5nM的对于TSH 的 Kd0
3.权利要求1的免疫测定，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.15nM的对于TSH 的 Kd0
4.权利要求1的免疫测定，其中信号抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于250nM，大于35nM和大于35nM。
5.权利要求1的免疫测定，其中捕获抗体具有大于6000的第一Kd比率Kd (FSH): Kd (TSH)，并且信号抗体具有大于1500的第二 Kd比率Kd (FSH): Kd (TSH)。
6.权利要求1的免疫测定，其中第一Kd比率大于3000并且第二 Kd比率大于1800。
7.权利要求1的免疫测定，其中第一Kd比率为1500至50000并且第二 Kd比率为1500至 50000。
8.权利要求1的免 疫测定，其中捕获抗体具有大于1000nM的Kd(FSH)，大于1000nM的Kd(LH)，和大于500nM的Kd (CG)，并且其中信号抗体具有大于300nM的Kd(FSH)，大于35nM的 Kd(LH)和大于 35nM 的 Kd(CG)。
9.权利要求1的免疫测定，其中捕获抗体具有1000至5000nM的Kd(FSH)，1000至5000nM的Kd(LH)，和500至5000nM的Kd(CG)，并且其中信号抗体具有250至5000nM的Kd (FSH)，35 至 5000nM 的 Kd (LH)，和 35 至 5000nM 的 Kd (CG)。
10.权利要求1的免疫测定，其中捕获抗体和信号抗体各自能够结合TSH的TSH-@亚基上的至少两个不同表位。
11.权利要求1的免疫测定，其中其中所述捕获抗体和信号抗体是表位相容性抗体。
12.权利要求1的免疫测定，其中所述捕获抗体和信号抗体选自下列捕获/信号抗体对:5409/T25C 和 T25C/5409。
13.权利要求1的免疫测定，其中所述捕获抗体和信号抗体选自下列捕获/信号抗体对:5409/10-1179-456 和 10-1179-456/5409。
14.一种用于进行TSH免疫测定的方法，所述方法包括步骤: (a)将液体样品插入于导管中包含免疫传感器的装置，所述免疫传感器具有针对TSH的捕获抗体； (b)将信号抗体溶解进入所述液体样品； (c)在所述免疫传感器上形成夹心复合物，所述复合物包含所述捕获抗体、TSH和所述信号抗体； (d)在不超过一个洗涤步骤中利用洗涤液从传感器洗掉未复合的信号抗体；和 (e)检测与所述复合信号抗体相关的信号； 其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过InM的对于TSH的解离常数(Kd)。
15.权利要求14的方法，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.5nM的对于TSH的Kd。
16.权利要求14的方法，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.15nM的对于TSH的KcL
17.权利要求14的方法，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.15nM的对于TSH的解离常数(Kd)，其中捕获抗体对于滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)的Kd分别大于1000、大于1000和大于500nM，并且其中信号抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于250，大于35和大于35nM。
18.权利要求14的方法，其中捕获抗体具有大于6000的第一Kd比率Kd (FSH): Kd (TSH)，并且信号抗体具有大于1500的第二 Kd比率Kd (FSH): Kd (TSH)。
19.权利要求14的方法，其中夹心复合物通过所述捕获抗体和信号抗体与液体样品的大体上非相继的接触形成。
20.权利要求14的方法，其中在无一个或多个用于减小与FSH、LH和CG中的一个或多个的交叉反应的间插洗涤步骤的情况下，形成夹心复合物。
21.权利要求14的方法，其中所述液体样品是稀释的血液样品、未稀释的血液样品、稀释的血浆样品或非稀释的血浆样品。
22.权利要求14的方法，其中捕获抗体包括小鼠单克隆抗体(BiospacificCat#5409SPTNE-5)，并且信号抗体包括小鼠单克隆抗体(Fitzgerald Cat#10-T25C)。
23.权利要求14的方法，其中捕获抗体共价地结合至珠粒。
24.权利要求14的方法，其中将信号抗体缀合至选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光部分的报道分子。
25.权利要求14的方法，其中所述检测步骤是电化学检测。
26.权利要求14的方法，其中所述检测步骤是光学检测。
27.权利要求14的方法，包括单一洗涤步骤来从捕获抗体除去样品和未结合的信号抗体，并且其中洗涤液还包含报告分子的底物。
28.权利要求14的方法，还包括在计量室中计量液体样品以形成具有I至500y L的体积的计量的样品。
29.权利要求14的方法，还包括爆裂洗涤液小袋以释放5至500y L的洗涤液进入所述导管，所述洗涤液小袋与免疫传感器是液体连通的。
30.权利要求14的方法，还包括在所述洗涤液中形成多个空气段。
31.权利要求14的方法，其中捕获抗体和信号抗体各自能够结合TSH的TSH-P亚基上的至少两个不同的表位。
32.权利要求14的方法，其中捕获抗体和信号抗体是表位相容的抗体。
33.权利要求14的方法,其中捕获抗体和信号抗体选自下列捕获/信号抗体对:5409/T25C和 T25C/5409。
34.权利要求14的方法，其中捕获抗体和信号抗体选自下列捕获/信号抗体对:5409/10-1179-456 和 10-1179-456/5409。
35.用于非相继测定和具有低洗涤液循环的测定的促甲状腺激素(TSH)夹心免疫测定抗体选择方法，包括至少两种表位相容性抗体，包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体，其中捕获抗体对于滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)的Kd分别大于1000、大于1000和大于500nM，并且其中信号抗体对于TSH的Kd小于约InM，对于FSH、LH和CG的Kd分别大于250，大于35和大于35nM。
36.权利要求35的方法,其中所述捕获抗体和信号抗体各自具有不大于0.5nM的对于TSH 的 Kd0
37.权利要求35的方法，其中所述捕获抗体和信号抗体各自具有不大于0.15nM的对于TSH 的 Kd0
【文档编号】G01N33/76GK103649755SQ201180072165
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2011年11月29日 优先权日:2011年5月27日
【发明者】王丹, G·B·科里尔, J·P·斯肯纳, 阮俏俏, S·泰丁 申请人:雅培医护站股份有限公司