专利名称：用于检测水体毒性的微生物反应器及水体毒性的检测方法
技术领域：
本发明属于水体检测技术领域，尤其涉及一种用于检测水体毒性的微生物反应器及水体总毒性的检测方法。
背景技术：
随着人类生产活动的发展，大量化学品不断进入水环境中，成为水体污染的主要污染源。这些化学品污染物大多不是人体组成成分，也不是人体所需营养物质或维持正常生理功能必须的物质，但其可与人体接触并进入人体，产生一定的生物学作用，如当有毒有害化学品通过食物网的放大作用进入人体内可能会危害人体健康甚至生命。另外，水体中化学品污染也会使水体中的生物收到危害，因此，对水体毒性进行检测及监测是评价水体是否收到污染以及判断污染程度的重要手段。在水体毒性检测及监测方法中，生物检测由于结果直观等优点而受到广泛关注， 蛙类、鱼类、小鼠、浮游生物、海藻等生物已被用于水体毒性检测，但是，以上述生物进行水体毒性检测时具有测试周期长、成本高、操作复杂等缺点，不仅难以推广，而且不能满足现场快速检测需要。微生物种群数量大、生长周期短、对环境变化的敏感性高，具有与高等动物类似的物理化学特性和酶作用过程，因此适合开发省时、低耗、无道德争议的快速生物学毒性测试方法，尤其适合开发小型便携式水体毒性检测设备。在微生物毒性检测方法中，基于发光微生物的检测技术应用最为广泛。国际IS011348-3规定使用深海发光细菌 V. fischeri作为受试生物，为了平衡渗透压，测试必须在高盐度条件下进行，可能会引起样品中某些化学品性质的改变，如，对于低浓度金属样品，盐度校正会导致假阴性的结果；而对于一些溶解度低的样品，如苯酚等，则会由于毒物的析出而导致假阳性结果。而且，该方法采用荧光检测，检测信号易受水体浊度影响，不适于浑浊和有颜色的样品。另外，发光细菌在自然界中不是普遍存在的微生物，获得和保存较为困难，商品发光细菌价格较为昂贵， 导致检测成本较高。电分析仪器具有检测灵敏度高、成本低、适合小型化等优点，广泛应用于环境监测、生物分析、医学检测等领域。在微生物的新陈代谢过程中，微生物可以通过自身的呼吸作用将电子传递给电子媒介体，当毒性物质存在时，微生物的呼吸作用受到抑制，进而阻碍微生物和电子媒介体之间的电子传递，因此，可以开发基于微生物的用于水体毒性检测和监测的电化学方法和仪器。如美国Lincon Technology开发了 Micredox系统，其可以用于检测水体的生物需氧量；新西兰的Pasco等人将铁氰化钾引入Micredox系统，通过测定在不同毒性物质存在条件下微生物与作为电子媒介体的铁氰化钾分子之间的电子传递速率， 证实该系统可用于水体毒性检测。但是，该系统直接以悬浮微生物为受试生物，悬浮微生物使用时每次都需要重新培养、离心、清洗等过程，不仅增加了操作时间和操作复杂性，而且由于每次培养的悬浮微生物状态不可能达到完全一致，会影响检测的灵敏度及稳定性
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于检测水体毒性的微生物反应器及水体毒性的检测方法，本发明提供的检测方法灵敏度高、稳定性好、操作简单，适于在线水体毒性检测和监测。本发明提供了一种用于检测水体毒性的微生物反应器，包括载体和固定在所述载体上的微生物。优选的，所述载体为活性炭、多孔陶土、微孔玻璃、海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶或聚氨酯泡沫。优选的，所述微生物为大肠杆菌、荧光假单孢菌、恶臭假单孢菌和阴沟肠杆菌中的一种或多种。与现有技术相比，本发明提供的微生物反应器包括载体和固定在所述载体上的微生物。在该微生物反应器中，微生物被固定在载体中，不能移动，但是小分子底物和反应代谢产物等可自由出入载体内部，不仅能够保持活性且能够重复利用，用于检测水体毒性时无需每次都重复培养、离心、清洗等过程，不仅节省了操作时间、降低了操作复杂性，而且由于微生物在所述载体上能够长时间保持活性不变，不会影响检测的灵敏度及稳定性。本发明还提供了一种水体毒性的检测方法，包括以下步骤a)向上述技术方案所述的微生物反应器中加入电子媒介体和待测水样，培养后得到混合溶液；b)采用三电极体系检测所述步骤a)中得到的混合溶液的电流。优选的，在所述步骤a)之前还包括向上述技术方案所述的微生物反应器中加入电子媒介体和标准水样，培养后得到第一混合溶液；采用三电极体系检测所述第一混合溶液的电流。优选的，所述培养的温度为35°C 38°C，所述培养的时间为0. 5h 池。优选的，所述步骤a)中，所述电子媒介体为铁氰化钾、中性红、二茂铁或二茂铁的衍生物。优选的，所述步骤a)中，所述电子媒介体在所述待测水样中的浓度为40mmol/L 50mmol/L。优选的，所述步骤b)中，所述三电极体系中的工作电极为微阵列电极。优选的，所述微阵列电极为钼微阵列电极。本发明以固定于载体上的微生物作为受试生物，在所述微生物反应器中加入电子媒介体和待测水体后，可采用三电极体系检测待测水样的电流，从而获得水体毒性检测结果。本发明以固定于载体上的微生物作为受试生物不仅能够保持活性且能够重复利用，用于检测水体毒性时无需每次都重复培养、离心、清洗等过程，不仅节省了操作时间、降低了操作复杂性，而且由于微生物在所述载体上能够长时间保持活性不变，不会影响检测的灵敏度及稳定性；本发明通过电化学方法检测待测水体的毒性，不受水体浊度和色度的影响， 同时能够以多种微生物作为受试生物，避免了对毒性物质的选择性，具有更高的灵敏度和稳定性，更加适合水体毒性的检测需求。实验结果表明，采用本发明提供的方法检测得到的毒性物质的IC50值与采用MICR0T0X检测仪检测得到的IC50值相当，低于以悬浮微生物为受试生物检测得到的IC50值。
图1为本发明实施例1制备的包埋有大肠杆菌的海藻酸钙细丝的电镜照片；图2为本发明实施例制备的未包埋有大肠杆菌的海藻酸钙细丝的电镜照片；图3为本发明实施例21提供的浓度与电流抑制率的曲线图；图4为本发明实施例22提供的浓度与电流抑制率的曲线图；图5为本发明实施例23提供的浓度与电流抑制率的曲线图；图6为本发明实施例M提供的浓度与电流抑制率的曲线图；图7为本发明实施例沈提供的固定微生物重量与电流抑制率的曲线图。
具体实施例方式本发明提供了一种用于检测水体毒性的微生物反应器，包括载体和固定在所述载体上的微生物。本发明提供的微生物反应器中，微生物被固定在载体中，不能移动，但是小分子底物和反应代谢产物等可自由出入载体内部，不仅能够保持活性且能够重复利用，用于检测水体毒性时无需每次都重复培养、离心、清洗等过程，不仅节省了操作时间、降低了操作复杂性，而且由于微生物在所述载体上能够长时间保持活性不变，不会影响检测的灵敏度及稳定性。在本发明中，所述载体的作用在于固定微生物，其需要满足以下特性操作过程简单易行；对细胞无毒害作用；传质性能良好；不易被微生物分解；性质稳定；强度高、寿命长等。在本发明中，所述载体可以为无机材料、天然有机材料或者合成有机材料等，其中，无机材料包括但不限于活性炭、多孔陶土、微孔玻璃等，优选为活性炭，具有强度大、传质性好、 对细胞无毒害、制备过程简单等优点；天然有机材料包括但不限于海藻酸盐、卡拉胶、琼脂等，优选为海藻酸盐，具有对微生物无毒害作用、传质性好等优点；合成有机材料包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶、聚氨酯泡沫等，优选为聚乙烯醇凝胶，具有强度高、化学稳定性好等优点。在本发明中，所述微生物作为检测水体毒性的受试生物存在，本发明对其并无特殊限制，可以为单一菌种，也可以为混合菌种，本领域技术人员可根据需要进行选择或确定。所述微生物优选为大肠杆菌、荧光假单孢菌、恶臭假单孢菌和阴沟肠杆菌中的一种或多种，更优选为大肠杆菌或荧光假单孢菌。本发明对所述微生物固定在所述载体上的方式没有特殊限制，可以为吸附、包埋、 交联、化学共价或自身固定化等方法。本发明对所述微生物的个数与所述载体的重量没有特殊限制，本领域技术人员可根据选用的微生物种类、载体种类和固定方式自行确定。本发明对所述微生物反应器的制备方法没有特殊限制，可以按照以下方法制备(1)吸附法依据带电微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力的作用， 使微生物固定在载体表面和内部形成微生物反应器的方法，具体包括以下步骤将载体干燥后置于接种菌体的培养液中，培养后得到微生物反应器。在采用吸附法制备微生物反应器时，所述载体为具有吸附功能的多孔类载体，如活性炭等。
本发明首先将载体干燥后在接种有菌体的培养液中进行培养，培养过程中，微生物被吸附到载体内部或表面，形成微生物反应器。本发明对所述干燥和培养的参数均没有特殊限制，本领域技术人员可根据选用的载体种类、微生物种类等进行选择和确定。如，载体为碳毡、微生物为荧光假单孢菌时，干燥的温度优选为60°C 100°C，时间优选为池 8h ；培养温度优选为28 V 32°C，时间优选为20h 25h，优选在80r/min 120r/min的转速下进行培养。(2)包埋法又叫包埋固定化，是使微生物细胞包埋在聚合物或膜内，或使微生物细胞扩散进入多孔性的载体内部，小分子底物及反应代谢产物可自由出入，而微生物固定不动。以海藻酸钙为例，采用包埋法制备微生物反应器的方法如下培养微生物，得到微生物悬浮液；将海藻酸钠溶于水中，得到海藻酸钠溶液；将所述微生物悬浮液和所述海藻酸钠溶液混合，得到混合溶液；采用注射器将所述混合溶液注入到氯化钙溶液中，得到包埋有微生物的海藻酸钙丝；将所述包埋有微生物的海藻酸钙丝固化后，得到微生物反应器。本发明对所述培养微生物的方法没有特殊限制，根据选用的不同种类的微生物进行扩大培养即可。本发明对所述微生物的个数和所述海藻酸钙的重量比没有特殊限制，本领域技术人员可以自行确定。(3)交联法利用微生物中酶分子中的氨基或羟基与交联剂的官能基团发生反应，交联形成共价键，使微生物菌体相互形成网状结构，实现微生物的固定化。(4)化学共价法使非水溶性载体与微生物以共价键的形式结合。(5)自身固定化法依靠微生物自身的絮凝作用在载体上固定化形成。得到微生物反应器后，可将其用于水体毒性检测及监测，且使用时无需每次都重复培养、离心、清洗等过程，不仅节省了操作时间、降低了操作复杂性，而且由于微生物在所述载体上能够长时间保持活性不变，不会影响检测的灵敏度及稳定性。本发明还提供了一种水体毒性的检测方法，包括以下步骤a)向上述技术方案所述的微生物反应器中加入电子媒介体和待测水样，得到混合溶液；b)采用三电极体系检测所述步骤a)中得到的混合溶液的电流。本发明以固定于载体上的微生物作为受试生物，在所述微生物反应器中加入待测水样和电子媒介体后，可采用三电极体系检测待测水样电流，本发明通过电化学方法检测待测水样的毒性，不受水体浊度和色度的影响，同时能够以多种微生物作为受试生物，避免了对毒性物质的选择性，具有更高的灵敏度和稳定性，更加适合水体毒性的检测需求。本发明提供的方法可用于水体急性毒性检测，也可以用于水体毒性日常监测，用于水体毒性日常监测时，将电子媒介体和待测水体加入到上述技术方案所述的微生物反应器中进行培养，同时采用三电极体系检测所述待测水体的电流，根据电流变化即可判断水体日常毒性；用于水体急性毒性检测时，以未受污染的水或自来水作为标准水体，将标准水样和待测水样分别与电子媒介体混合之后加入到上述技术方案所述的微生物反应器中进
6行培养，同时采用三电极体系分别检测所述标准水样和待测水样的电流，进行对比后即可判断待测水体急性毒性情况。在本发明中，所述水体急性毒性检测方法具体包括以下步骤向上述技术方案所述的微生物反应器中加入标准水样和电子媒介体，得到第一混合溶液；采用三电极体系检测所述第一混合溶液的电流值；向上述技术方案所述的微生物反应器中加入电子媒介体和待测水样，得到第二混合溶液；采用三电极体系检测所述第二混合溶液的电流值；根据所述第一混合溶液的电流值和所述第二混合溶液的电流值判断水体毒性污染情况。所述对水体的日常监测方法具体包括以下步骤向上述技术方案所述的微生物反应器中加入电子媒介体和待测水样，得到混合溶液；采用三电极体系检测所述混合溶液的电流值；根据电流值的变化即可判断水体毒性变化情况。在本发明中，对所述标准水样和待测水样进行检测或监测时所采用的微生物反应器、电子媒介体的种类、用量等均相同，本发明以待测水体为例进行说明。对待测水体毒性进行检测时，首先向上述技术方案所述的微生物反应器中加入电子媒介体和待测水样，进行培养后得到混合溶液。本发明对所述培养的温度、时间和方式没有特殊限制，可根据选用的微生物的种类进行确定，如微生物为大肠杆菌时，优选为35°C 38°C下保温培养0. 5h 2h。在进行培养过程中，微生物进行新陈代谢，消耗氧气分解有机物，并将其转化为简单的无机物，如式(1)、式(2)所示02(aq)+4H++4e" ^ 2H20(I) (2)在此过程中，有机物被微生物降解，生成CO2,并产生4个电子；水中的氧分子接受 4个电子，生成两个水分子；由于氧气在水中的溶解度较低，在无氧的条件下，电子媒介体， 如铁氰化钾等可取代氧作为人工电子受体，生成CO2和亚铁氰化钾，如式C3)所示由式⑴、式⑵和式⑶可知，微生物降解有机物的过程可被简化为电子传递的过程，即微生物降解速率与电子传递速率成比例，进而导致呼吸速率与电子传递成比例。当毒性物质侵入水体时，上述微生物的正常呼吸作用将受到抑制，甚至导致微生物的死亡，微生物由于呼吸作用向外传递的电子的数量也会随之减少。根据该过程，可以采用待测水体进入微生物反应器前后微生物呼吸速率受到的抑制程度表征水体毒性，具体为采用电流抑制率与浓度之间的关系(ic，Inhibitory Concentration)来表征水体毒性，可通过公式(I)计算电流抑制率
权利要求
1.一种用于检测水体毒性的微生物反应器，包括载体和固定在所述载体上的微生
2.根据权利要求1所述的微生物反应器，其特征在于，所述载体为活性炭、多孔陶土、 微孔玻璃、海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶或聚氨酯泡沫。
3.根据权利要求1所述的微生物反应器，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌、荧光假单孢菌、恶臭假单孢菌和阴沟肠杆菌中的一种或多种。
4.一种水体毒性的检测方法，包括以下步骤a)向权利要求1 3任意一项所述的微生物反应器中加入待测水样和电子媒介体，培养后得到混合溶液；b)采用三电极体系检测所述步骤a)中得到的混合溶液的电流。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤a)之前还包括 向标准水样中加入电子媒介体和权利要求1 3任意一项所述的微生物反应器，培养后得到第一混合溶液；采用三电极体系检测所述第一混合溶液的电流。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述培养的温度为30°C 40°C，所述培养的时间为0. 5h 2h。
7.根据权利要求3 6任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，所述电子媒介体为铁氰化钾、中性红、二茂铁或二茂铁的衍生物。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，所述电子媒介体在所述待测水样中的浓度为40mmol/L 50mmol/L。
9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述三电极体系中的工作电极为微阵列电极。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述微阵列电极为钼微阵列电极。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测水体毒性的微生物反应器，包括载体和固定在所述载体上的微生物。本发明还提供了一种水体毒性的检测方法，包括以下步骤a)向上述技术方案所述的微生物反应器中加入电子媒介体和待测水样，培养后得到混合溶液；b)采用三电极体系检测所述步骤a)中得到的混合溶液的电流。本发明以固定于载体上的微生物作为受试生物不仅能够长时间保持活性且能够重复利用，相对于悬浮微生物用于检测水体毒性来讲，无需每次都经历重复培养、离心、清洗等过程，不仅节省了操作时间、降低了操作复杂性，而且由于微生物在所述载体上能够长时间保持活性不变，不会影响检测的灵敏度及稳定性。
文档编号G01N27/327GK102520040SQ20121000480
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者董绍俊, 雍达明 申请人:中国科学院长春应用化学研究所