专利名称：一种检测金黄色葡萄球菌的方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种快速富集、筛选、定性及定量检测金黄色葡萄球菌的方法及其专用试纸。
背景技术：
民以食为天，食品是人类赖以生存和发展的最基本的物质条件，但是全球及我国接连不断发生的食源性病原微生物引起的食品安全事故和突发性公共卫生事件却引发了人们对食品安全的高度关注，据联合国世界卫生组织统计，食源性疾病的漏报率在95%以上，其中因食源性致病微生物而引起的感染和食物中毒超过85%。食源性致病菌快速检测一直是研究关注的焦点，食源性致病菌快速检测是采用微生物学、化学、生物化学、生物物 理、免疫学的方法对食品及其加工、贮藏等环境中的致病菌进行分离、检测、鉴定和计数。现在广泛使用的食源性病原微生物检测方法主要有以下几种平皿培养分离计数法、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与突光PCR检验方法、酶联免疫吸附实验(ELISA)等。在食源性致病微生物中，金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多，例如近期某名牌速冻水饺引起中毒的事件。因此，建立健全的食品安全标准和研究食源性致病菌的快速检测方法就显得尤为重要。胶体金免疫层析法自1971年被Faulk等人创立以来，由于其具有方便快速、特异性强、稳定性好、不需要特殊仪器和试剂、肉眼可判断结果等优点而得到广泛的应用。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，即氯金酸(HAuC14)在还原剂作用下,聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金与抗体蛋白吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。免疫层析法是一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。传统的平皿培养分离鉴定法是应用微生物增菌培养、分离、生化鉴定等方法对食品中可能存在的食源性致病菌进行定性和定量的检验。其特点是稳定可靠，是目前最成熟，使用最广泛的细菌检验方法，但是此法存在检测时间长，过程繁琐，对操作人员技术要求高以及对特定血清型难以分离鉴定的问题。PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的DNA复制。样品经前处理增菌后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，在加入引物后，以提取的DNA为模版进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对样品中是否存在食源性致病菌进行快速检验用PCR技术检测有害微生物，具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。荧光PCR即在普通PCR基础上加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模版，可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。但是PCR反应受样品情况的影响比较大，特别在食源性有害微生物检查中，食品中的成分(糖类、酸类，油脂等物质)会干扰反应的正常进行。而检测的环境，中间处理环节也会带来一些PCR反应抑制剂，从而使PCR反应呈现较高的假阳性和假阴性率。最为关键的是 ，PCR检测无从判断食源性病原微生物的感染性，即DNA或RNA检测的阳性结果无法判断是无感染性的死亡微生物还是具备感染性的活微生物。酶联免疫吸附分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术主要依据抗原(抗体)能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；抗体(抗原)与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；结合物与相应的抗原(抗体)反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体(抗原)的含量。酶联免疫吸附分析法具有灵敏度高、快速、特异性很强、和测试成本低等特点，但是此法需要大型仪器来辅助，不利于现场的快速检测。同样，酶联免疫吸附分析法也有抗原阳性的结果无法判断是死亡微生物还是活微生物的缺陷。为对我国食品安全作出贡献，丰富致病菌的检测方法，提高对食源性致病菌的检测速度，为可能出现的食品安全问题提供应对方法，需要对现有食源性致病菌的检测技术做出改进，寻找一种集富集、筛选、定性、定量于一体的具备感染性的食源性致病菌的检测方法。实际应用中，要求该方法具有快速、简便、稳定性好、灵敏度高、不需要大型仪器等特点，为食品安全检测、临床快速诊断以及水质等样品现场快速筛查提供直观的、肉眼可辨的结果。
发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种检测金黄色葡萄球菌的方法及其专用的检测试纸，以克服现有的检测方法中灵敏度要求高、富集过程复杂、检测时间长、无法区分致病菌活性，且需要大型仪器等缺陷。技术方案本发明的技术方案之一是提供一种检测金黄色葡萄球菌的方法，步骤包括使包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子与待测样品混合形成抗体-磁性粒子-金黄色葡萄球菌的复合物；在外加磁场吸引作用下，收集所述的复合物；将所述的复合物接种到培养基中进行6-12小时的培养；用金黄色葡萄球菌胶体金免疫层析试纸进行定性或定量检测。上述方法的优选方案之一为，所述的包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子为以Fe3O4纳米粒子为内核，以SiO2为外壳，表面标记金黄色葡萄球菌特异性抗体的磁性纳米粒子。
上述检测金黄色葡萄球菌的方法的优选方案之二为，所述的包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子 是采用如下方法制备的，步骤包括(a)将包裹SiO2的Fe3O4磁性纳米粒子分散在有机溶剂中，加入N-(2_氨基乙基)-3_氨基丙基三甲基硅烷，混合反应，制成表面氨基化的超顺磁性纳米粒子；其中，N- (2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷与包裹SiO2的Fe3O4磁性纳米粒子比例为O. 06mL到O. 12mL比Img纳米粒子；(b)将表面氨基化的磁性纳米粒子分散于含质量浓度为1% 2%戊二醛的磷酸缓冲液中，将金黄色葡萄球菌特异性抗体与步骤(a)所得表面氨基化的磁性纳米粒子偶联，得到包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子；其中，所述的磷酸缓冲液的pH = 7. 4。上述检测金黄色葡萄球菌的方法的优选方案之三为，所述的特异性抗体为抗金黄色葡萄球菌的多克隆抗体或单克隆抗体。上述检测金黄色葡萄球菌的方法的优选方案之四为，所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体的质量比为I : O. 005 O. 05。上述检测金黄色葡萄球菌的方法的优选方案之五为，所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体的质量比为I : O. 003 O. 03。上述检测金黄色葡萄球菌的方法的优选方案之六为，所述的外加磁场的强度为3000 7000Gs。本发明的技术方案之二是提供一种用于上述检测方法的胶体金免疫层析试纸，包括涂布有胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物的结合垫；和沿层析方向依次喷涂有金黄色葡萄球菌单克隆抗体的检测线、喷涂有羊抗兔IGg抗体的质控线的分析膜；其中，按上述的方法进行检测，所述胶体金免疫层析试纸的检测时灵敏度为104cfu/mL菌液。上述的胶体金免疫层析试纸的优选方案之一为，所述的试纸还包括PVC底板、样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫，且沿层析方向的叠放顺序依次为底板、样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫。上述的胶体金免疫层析试纸的优选方案之二为，所述的胶体金平均粒径范围为10_80nm。上述的胶体金免疫层析试纸的优选方案之三为，所述的胶体金免疫层析试纸是以如下方法制备的，步骤包括a)、制备胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物采用两次离心的方法将胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体包被于10-80nm粒径的胶体金表面，13000r/min离心，并用硼酸缓冲溶液离心洗涤，浓缩至原体积的1/50-1/2，4°C冷藏保存；b)、制备样品垫将玻璃纤维膜浸入含有BSA和表面活性剂吐温20的PBS缓冲溶液中，取出在网孔平板上于30-45°C晾干备用；c)、制备结合垫将a)步骤中制备的胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物分散于含BSA和PBS的缓冲溶液中，并均匀涂布在剪切好的玻璃纤维素膜上，在网孔平板上于30-45°C晾干备用；d)、制备分析膜将金黄色葡萄球菌单克隆抗体和羊抗鼠IgG ( 二抗)定点涂布在分析膜的不同位置，分别作为检测线和质控线，于30-45°C晾干备用；e)、组装胶体金免疫层析试纸将吸水垫和步骤b) d)所制备的结合垫、样品垫、分析膜依照沿层析方向依次为底板、样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫的顺序叠放，贴在PVC底板上,并切成试纸形状。本发明可以通过如下方式实现，也可以使用同样效果的类似方式将超声粉碎处理过的待测样品(如食品)与包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子混合，形成抗体-磁性粒子-金黄色葡萄球菌的复合物；在外加磁场吸引作用下，收集所述的复合物；将所述的复合物或由其上洗脱下来的金黄色葡萄球菌在液体或固体培养基中进行不超过2小时的培养；将经富集和培养的待测样品滴加到样品垫上，样品通过渗透与虹吸作用进入结合垫，使结合垫上固定的所述的纳米金颗粒-抗体复合物重新溶解游离，样品中的金黄色葡萄球菌抗原与纳米金颗粒-抗体复合物结合成纳米金颗粒-抗体-抗原像三明治一样的夹心层复合物，在吸水垫的虹吸作用下，上述夹心复合物离开结合垫进入分析膜，向吸水垫方向流动，在此过程中上述纳米金颗粒-抗体-抗原复合物在分析膜上被固定在分析膜上的金黄色葡萄球菌的抗体拦截，形成纳米金颗粒-抗体-抗原-抗体复合物，从而使检测线显红色，而未与金黄色葡萄球菌抗原结合的纳米金颗粒-抗体复合物则继续像吸水垫方向移动，在被固定在质控线上的羊抗鼠(二抗)拦截，形成纳米金颗粒-抗体-二抗复合物，从而使质控线显色。结果判断检测线和质控线都显红色为阳性；只有质控线显红色，检测线不显色为阴性；无论检测线显色与否，质控线不显色则视为无效。检测线上拦截的胶体金的数量与样品中的抗原的含量有关，即样品中的抗原含量越多，检测线上拦截下来的胶体金越多，检测线的红色越深，在金标免疫层析仪上的信号强度也就越强，以该信号强度与标准浓度的金黄色葡萄球菌菌液为基准作标准曲线，从而实现金黄色葡萄球菌的定量检测。如本文所述，本发明中的“胶体金”即是特定粒径的纳米颗粒，一般粒径为10-80nm，其实现方法为用I %的氯金酸，在适量还原剂柠檬酸三钠的作用下，制成粒径在10-80nm的纳米金颗粒，由于静电的作用而呈一种稳定的胶体状态，所述的胶体金在500-550nm左右有强吸收峰，并且本身呈显酒红色或者紫色，因此可用作免疫层析反应的标记物。所述胶体金颗粒参与了金黄色葡萄球菌单克隆抗体吸附到金颗粒表面的包被过程，其吸附机理是利用所述胶体金在碱性的条件下显负电，与金黄色葡萄球菌单克隆抗体的正电基团靠静电吸附而牢固结合，因而胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物具有良好的稳定性。上述金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸的一种优选方案为，所述的底板材料为PVC塑料板，所述的样品垫为玻璃纤维素膜，所述的结合垫材料为玻璃纤维素膜，所述的分析膜材料为硝酸纤维素膜(即是NC膜)，所述吸水垫的材料为植物纤维滤纸。它们沿层析方向依次按样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫的顺序排列在PVC塑料底板上。如本文所述，本发明中的“样品垫”是检测时样品的滴加部位；如本文所述，本发明中的“结合垫”是固定有胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物的前处理过的玻璃纤维素膜，在滴加被检样品后，该复合物可以在试纸上和样品中的金黄色葡萄球菌发生免疫层析反应；如本文所述，本发明中的“分析膜”是金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸的核、心，金黄色葡萄球菌单克隆抗体和羊抗兔IGg抗体分别被喷涂固定在分析膜的不同位置，分别作为检测线和质控线。如本文所述，本发明中的“吸水垫”在检测的过程中通过虹吸作用提供层析的动力；
如本文所述，本发明的“PVC塑料底板”为整个试纸提供固定形状的支撑和其它试纸组成部件的附着。有益效果本发明的方法和试纸集富集、筛选、定性、定量于一体，能够检测仍然具备感染活性的食源性致病菌的检测方法。该方法具有快速(3小时内)、简便、稳定性好、灵敏度高、不需要大型仪器等特点，检测灵敏度达104cfu/mL菌液。
图I本发明的胶体金免疫层析试纸的结构示意图，它的一种表现形式是由底板、吸水垫、分析膜、结合垫及结合垫上散布的胶体金颗粒-抗体复合物、样品垫按照一定得叠放次序固定于粘性PVC底板上制成，分析膜上沿层析方向依次固定有检测线、质控线。图2本发明的胶体金免疫层析试纸的结果判定图，检测线和质控线都显色为阳性；只有质控线显色，检测线不显色为阴性；无论检测线显色与否，质控线不显色则视为无效。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子标记操作手册或临床检测操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I免疫化超顺磁性纳米磁珠的制备及细菌富集I、磁核Fe3O4的合成及其包硅用双蒸水分别配制FeSO4 · 7H20、FeCl3 · 6Η20、2· 5mol/L的NaOH三种溶液，将所配FeSO4 · 7H20、FeCl3 · 6H20两种溶液混合，使混合溶液中二价铁离子的浓度为O. 15mol/L,，三价铁离子的浓度为O. 25mol/L，在剧烈搅拌下将上述配置好的NaOH溶液缓缓滴加到混合铁盐溶液中，将所得的沉淀在60°C陈化2h，用双蒸水将沉淀物清洗3 5次，过滤后在60°C干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即为产物，60°C干燥，室温保存备用。由于磁核Fe3O4的分散性差，粒径不均匀，且易和其它物质发生反应，所以必须对磁核进行包硅，以得到化学性能稳定、分散性好的核壳型磁珠。本实验采用反相微乳液法对磁核Fe3O4进行包裹，将TritonX-100、正己醇、环己烷按照I : I : 2至I : I : 10的比例混合均勻，超声使其形成稳定的微乳液体系，再加入磁性Fe3O4纳米粒子,超声并向体系中滴加质量浓度为30% 35%的浓氨水至体系分散均匀，继续向体系中缓慢滴加正硅酸乙酯(TEOS)。反应完成后，静置过夜使粒子陈化。在磁场的作用下分离磁性纳米粒子后，用乙醇洗涤粒子5次，在400°C下煅烧粒子，以去除粒子表面的有机物，收集二氧化硅包裹的磁性纳米粒子，干燥并室温保存备用。2、表面氨基化磁性纳米粒子的制备及其免疫化取IOOmg的二氧化硅包裹的磁性纳米粒子，将其分散于400mL甲醇/丙三醇(体积比为I : 3 I : 5)的混合溶液中，再加入300至IOOOyL的蒸馏水，超声使纳米粒子分散均匀，搅拌并向体系中加入5mL至IOmL的N-(2-氨基乙基)_3_氨基丙基三甲基硅烷，反应O. 5h后，在3000Gs磁场作用下分离纳米粒子，用乙醇和蒸馏水各洗涤3次，得到表面修饰了 -NH2的磁性纳米粒子，置于60°C真空烘箱中干燥后室温保存备用。取上述制备的表面氨基化的磁性纳米粒子IOOmg分散于O. 01mol/L的PBS(pH =
7.4)溶液中，再加入戊二醛溶液使其终浓度为1<% 2%，反应Ih后，用上述PBS溶液洗涤磁性纳米粒子3次，以除去过量的戊二醛，再加入抗金黄色葡萄球菌的单克隆抗体，继续反应4 6h，磁性纳米粒子表面的氨基与抗体上的氨基连接，形成免疫化超顺磁纳米粒子。在3000Gs磁场下磁性分离，将得到的磁性粒子重新分散于缓冲溶液中，使其终浓度浓度为50mg/ml。4 °C保存备用。实施例2金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸的制备I、胶体金标记金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物的制备将金黄色葡萄球菌单克隆抗体标记于所制备好的平均粒径为IO-SOnm的胶体金表面，然后用O. 002M的硼酸缓冲溶液两次离心洗涤，浓缩至原体积的1/50-1/2，一般为1/25，4°C保存备用。2、胶体金免疫层析试纸的制备2. I样品垫的制备本实施例选用玻璃纤维素膜作样品垫材料，将玻璃纤维素膜放入样品垫处理液(O. OlM的PBS (PH = 7. 4)，含有I % BSA, O. I %的Trion X-100)中浸泡，于30-45 °C干燥，一般选用37 °C。2. 2结合垫的制备本实施例选用玻璃纤维素膜作样品垫材料，将上述制备的胶体金标记金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物重新分散于O. OlM的PBS (PH = 7. 4，含5%的蔗糖，I %的BSA)中，并喷涂于结合垫上，于30-45°C干燥备用，一般选用37°C。2. 3分析膜(硝酸纤维素膜或者NC膜)的制备用划膜仪将金黄色葡萄球菌单克隆抗体和羊抗兔IGg抗体分别定点喷涂在分析膜的不同位置，自上而下依次是质控线、检测线。将喷涂好抗体的NC膜于30-45°C干燥备用，一般选用37°C。 2. 4胶体金免疫试纸的组装所述金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸的组装将吸水垫和(b_d)所制备的结合垫、样品垫、分析膜依照重叠次序关系贴在PVC底板上，其中重叠次序为所述PVC底板在最底层，其上中间部位为分析膜，在靠近质控线的一端重叠所述的吸水垫，在靠近检测线的一端重叠所述结合垫，在结合垫上重叠样品垫。组装好的PVC板纵向剪切成宽度为4_的条状，装在有样品窗和检测窗的塑料壳内即成为金黄色葡萄球菌的快速检测试纸。实施例3
I、通过检测90份食品样品对本发明的试纸进行特异性测试
将50份含金黄色葡萄球菌的食品样品、10份含大肠杆菌0157:H7的食品样品、10份含有单增李斯特菌的食品样品、10份阪崎肠杆菌的食品样品、10份空白培养基作为待测样品，分别超声IOmin后，取出5ml与50 μ I包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子混合，形成抗体-磁性粒子-金黄色葡萄球菌的复合物；在外加磁场吸引作用下，收集所述的复合物；将所述的复合物接种到7. 5%氯化钠肉汤培养基中培养6-12h，在3000Gs磁场下磁性分离出抗体-磁性粒子-金黄色葡萄球菌的复合物,磁性分离后的菌液在15000r/min下离心20min，然后溶解于O. 9%的氯化钠溶液中，取出100 μ L滴加到检测条的样品孔中，静置IOmin后观察结果。试纸目测结果50份含金黄色葡萄球菌的食品样品均显示为阳性样品；10份含大肠杆菌0157:Η7的食品样品、10份含有单增李斯特菌的食品样品、10份阪崎肠杆菌的食品样品、10份空白培养基均显示为阴性样品。在试验中，质控线不显色的试纸，其结果均视为无效。本实施例的结果充分证明本发明金黄色葡萄球菌胶体金免疫层析试纸的特异性很好。2、金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸的灵敏度测试挑取一个金黄色葡萄球菌的菌落接种到3mL的7. 5%氯化钠肉汤液态培养基中，37°C培养18h，经计数菌液浓度为lX108cfu/mL左右。先超声IOmin后，再用O. OlM的PBS (pH = 7. 4)(或者O. 9%的NaCl溶液)作为稀释液，配置上述金黄色葡萄球菌系列浓度如下108、IO7, IO6, ΙΟ5、104、IO3,102、10、0cfu/mL，将上述稀释好的菌液分别滴加到检测条的样品孔内，静置IOmin后观察结果，滴加菌液浓度为104-108cfu/mL的检测条的检测线和质控线均显红色，为阳性；而菌液浓度为103、102、10、0cfU/mL只有质控线显红色，为阴性。本发明金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸的灵敏度为104cfu/mL。3、金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸的稳定性测试将上述试纸密封干燥，置于室温下的干燥柜里，每隔30天取出和新制的试纸，按照本实施例3中1(特异性测试)的方法平行检测金黄色葡萄球菌的阳性和阴性食品样品，比较二者检测结果。结果显示，金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸于室温下干燥保存6个月后，和新制的试纸平行检测金黄色葡萄球菌的阳性和阴性样品，结果测试条的的特异性和灵敏度均没有降低，说明本发明的测试条稳定性良好。实施例4定量检测30份食品样品I、将经过前培养后的金黄色葡萄球菌的浓度为108cfu/mL的菌液作为标准菌液，先超声IOmin后，再用O. OlM的PBS (pH = 7. 4)(或者O. 9%的NaCl溶液)作为菌液的稀释液，配置系列浓度标准品如下IO8、107、IO6、ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2、10、0cfu/mL。2、将上述稀释好的各浓度待测菌液滴加到检测卡的检测孔中，IOmin后通过定量检测仪(金标免疫层析仪)读出定量检测线和质控线的比值(每个样品平行测定三次取平均值)，绘制相应的标准曲线。3、用上述标准曲线设置金标免疫层析定量检测仪的内置标准曲线。 4、按照上述实施例3中I (特异性测试)的方法检测30份含金黄色葡萄球菌的食品样品，菌液滴加到样品窗IOmin后，将试纸条插入金标免疫层析仪的样品口进行检测，测出食品样品中的金黄色葡萄球菌经富集并培养6-12小时后的浓度。食品样品中的金黄色葡萄球菌的量与其富集并培养6-12h后的的量成正比，从而间接求得食品样品中金黄色葡萄球菌的含量。5、以传统平皿培养分离鉴定法所测得的金黄色葡萄球菌菌落数为标准，进行两组结果的比较，所得的比值范围为试纸定量 法平皿培养法= 0.276 7. 28 1，试纸法测得的菌落数均处于与平皿培养法相同的数量级之内。
权利要求
1.一种检测金黄色葡萄球菌的方法，步骤包括使包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子与待测样品混合，形成抗体-磁性粒子-金黄色葡萄球菌的复合物；在外加磁场吸引作用下，收集所述的复合物；将所述的复合物接种到培养基中进行6-12小时的培养；用金黄色葡萄球菌胶体金免疫层析试纸进行定性或定量检测。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子为以Fe3O4纳米粒子为内核，以SiO2为外壳，表面标记金黄色葡萄球菌特异性抗体的磁性纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子是采用如下方法制备的，步骤包括 (a)将包裹SiO2的Fe3O4磁性纳米粒子分散在有机溶剂中，加入N-(2_氨基乙基)_3_氨基丙基三甲基硅烷，混合反应，制成表面氨基化的超顺磁性纳米粒子；其中，N-(2-氨基乙基)-3_氨基丙基三甲基硅烷与包裹SiO2的Fe3O4磁性纳米粒子比例为O. 06mL到O. 12mL比Img纳米粒子； (b)将表面氨基化的磁性纳米粒子分散于含质量浓度为1% 2%戊二醛的磷酸缓冲液中，将金黄色葡萄球菌特异性抗体与步骤(a)所得表面氨基化的磁性纳米粒子偶联，得到包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子；其中，所述的磷酸缓冲液的pH =7. 4。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述的特异性抗体为抗金黄色葡萄球菌的多克隆抗体或单克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体的质量比为I : O. 005 O. 05。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表面氨基化的磁性纳米粒子与抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体的质量比为I : O. 003 O. 03。
7.一种用于权利要求I所述方法的胶体金免疫层析试纸，包括涂布有胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物的结合垫；和沿层析方向依次喷涂有金黄色葡萄球菌单克隆抗体的检测线、喷涂有羊抗兔IGg抗体的质控线的分析膜；其中，按权利要求I的方法进行检测，所述胶体金免疫层析试纸的检测时灵敏度为104cfu/mL菌液。
8.根据权利要求7所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述的试纸还包括PVC底板、样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫，且沿层析方向的叠放顺序依次为底板、样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫。
9.根据权利要求7所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述的胶体金平均粒径范围为10_80nm。
10.根据权利要求7所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述的胶体金免疫层析试纸是以如下方法制备的，步骤包括 a)、制备胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物采用两次离心的方法将胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体包被于10-80nm粒径的胶体金表面，13000r/min离心，并用硼酸缓冲溶液离心洗涤，浓缩至原体积的1/50-1/2，4°C冷藏保存； b)、制备样品垫将玻璃纤维膜浸入含有BSA和表面活性剂吐温20的PBS缓冲溶液中，取出在网孔平板上于30-45°C晾干备用；c)、制备结合垫将a)步骤中制备的胶体金标记的金黄色葡萄球菌单克隆抗体复合物分散于含BSA和PBS的缓冲溶液中，并均匀涂布在剪切好的玻璃纤维素膜上，在网孔平板上于30-45 °C晾干备用； d)、制备分析膜将金黄色葡萄球菌单克隆抗体和羊抗鼠IgG(二抗)定点涂布在分析膜的不同位置，分别作为检测线和质控线，于30-45°C晾干备用； e)、组装胶体金免疫层析试纸将吸水垫和步骤b) d)所制备的结合垫、样品垫、分析 膜依照沿层析方向依次为底板、样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫的顺序叠放，贴在PVC底板上，并切成试纸形状。
全文摘要
本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的方法，即一步法富集筛选金黄色葡萄球菌，步骤包括利用包被有金黄色葡萄球菌特异性抗体的超顺磁纳米粒子与金黄色葡萄球菌发生特异性结合形成复合物；在外加磁场吸引作用下，收集超顺磁纳米粒子复合物；将富集的复合物接种到培养基中进行6-12小时的培养；并用金黄色葡萄球菌胶体金免疫层析试纸进行定性或定量检测。还提供相应的快速检测金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸，灵敏度达104cfu/mL菌液，可用于食品安全检测、临床快速诊断以及水质等样品现场快速筛查。
文档编号G01N33/558GK102645536SQ20121011629
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者徐宽, 支援, 沈鹤柏, 牛凯莉 申请人:沈鹤柏