专利名称：一种用于沙门氏菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于一种对沙门氏菌进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的 FtlF1-ATPase 分子马达生物传感器 Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro_sdf 对沙门氏菌(Salmonella)的属特异性基因invA、hut，毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf进行检测，从而对Salmonella是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断。
背景技术：
Salmonella是自然界普遍存在的一种致病菌，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占第一位或第二位。它引起的疾病主要分为两大类一类是伤寒等烈性传染病，另一类是急性肠胃炎。常见的肉类食品和奶蛋类食品都可以被沙门氏菌污染，其中鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等是常见的污染菌，它们是引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌，已对食品安全构成了严重威胁。Salmonella致病性的分子机制，目前的研究主要涉及Salmonella的毒力相关基因，包括 inv、hut、stn、spv、fim、hilA 等。沙门氏菌的侵袭蛋白(invasion protein, inv)是研究的热点，该蛋白决定细菌进入宿主上皮细胞的能力，与沙门菌的致病性密切相关，侵袭蛋白是由inv基因簇(invA、invB、invC、invD和invE等一组基因)编码,其中invA为沙门氏菌的主要毒力因子。研究表明invA基因是沙门氏菌A E群高度保守基因，对人类致病的沙门氏菌99%属A至E群。且invA基因编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白，该蛋白决定沙门氏菌对肠粘膜细胞的侵袭力，invA基因适合致病性沙门氏菌的检测，但作为沙门氏菌属特异性基因有一定的确定，有漏检的可能。hut为编码组氨酸操纵子基因，高度保守。stn为编码肠毒素的基因。在不同血清型沙门氏菌的毒性质粒中存在一个IOkb左右高度保守区域，毒性区域位于一个8. 2kb片段中，具有一个操纵子和5个编码基因(spvR，spvA, spvB, spvC, spvD)。spy基因编码与沙门氏菌毒性质粒相关的毒力因子，与沙门氏菌的致病性有关。Fim是编码菌毛的基因，是沙门氏菌中高度保守的属特异基因。Hil是侵袭基因正调节蛋白的编码基因。上述基因常用于Salmonella的PCR检测鉴定。另外sdf基因作为肠炎沙门氏菌的种特异性基因常用于肠炎沙门氏菌的PCR检测鉴定。 为了便于进行临床诊断、流行病学调查、食品中微生物检测及医院感染监控，微生物的分型与检测研究是必不可少的内容。目前，随着分子生物学的发展以及与流行病学的密切结合，分子分型技术以其敏感性高、特异性强、分型率和分辨率高等优点，在流行病学调查、食物中毒的预警和溯源、食源性疾病的诊断以及微生物的检测等方面发挥了重要的作用，并逐步替代了传统的生化分型和血清学分型技术，如重复序列PCR(rep-PCR)、随机扩增多态性DNA分析技术(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、多位点序列分析(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)等。然而，上述方法操作起来都比较繁琐，程序比较复杂。因此，在上述分子分型方法的优点基础上，开发一种操作简便、价格低廉的分子分型方法将具有重要意义。
发明内容
本发明以Salmonella属特异性基因invA、hut,毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf为靶基因设计4个探针，通过“ ε亚基抗体-链霉素-生物素-探针”系统将探针与FtlF1-ATPase分子马达连接构建FtlF1-ATPase分子马达生物传感器，进而与相应辅助试剂配套构建分子马达生物传感器分子分型试剂盒，从而对Salmonella是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断，从而建立Salmonella的分子马达分子分型方法，为Salmonella的快速分型和溯源提供技术基础。本发明所采用的技术方案为以Salmonella属特异性基因invA、hut,毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf靶基因设计4个探针，首先将生物素标记的ε亚基抗体结合在FtlF1-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素(Sti^ptavidin)与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合，构建FtlF1-ATPase分子马达生物传感器，对目标Salmonella的DNA进行检测,从而对Salmonella是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断。一方面，对属特异性基因invA、hut的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对spvR和sdf的检测可以对目标菌是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌做出判断。利用FtlF1-ATPase作为载体对目标物进行检测具有快速、灵敏度高、特异性强的特点。在FtlF1-ATPase分子马达上连接特异的核酸探针，可以实现对目标基因快速、高特异性、高通量的检测。本发明涉及的Salmonella的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，包括以下试剂沙门氏菌分子分型试剂盒组成
权利要求
1.一种基于分子马达生物传感器技术的沙门氏菌(Salmonella)分子分型试剂盒，其特征在于包括以下组分 副溶血性弧菌分子分型试剂盒组成
2.根据权利要求I所述的Salmonella的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，其特征在于分子马达生物传感器的构建，包括 (1)载色体(Chromatophore)的制备 从玫瑰红嗜热菌(Thermomicrobium roseum)中提取载色体，FtlF1-ATPase存在于载色体上。FtlF1-ATPase—般由8个亚基组成，分别为α3β3γ δ ε ab2cn，是一种可旋转分子马达。
(2)F-DHPE标记载色体 F-DHPE是一种脂染料探针，可以嵌入到磷脂分子层中。同时F-DHPE也是一种pH指示剂，将其嵌入磷脂双分子层可以用来测量磷脂层外面的PH变化。在pH7. 0-9. O范围内，F-DHPE的荧光强度与pH值呈正相关。本发明将F-DHPE标记到分子马达载色体磷脂分子层中用以指示FtlF1-ATPase合成ATP的效率。
(3)生物素标记ε亚基抗体 用生物素(biotin-AC5-Sulfo_0s)标记ε亚基抗体N端。
(4)探针合成及标记 以Salmonella属特异性基因invA、hut,毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf为模板设计探针，并用生物素(biotin-AC5-Sulfo-0s)标记探针5’端。一方面，对属特异性基因invA和hut的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对spvR和sdf的检测可以对目标菌是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌做出判断。探针序列如下表
3.根据权利要求I所述的Salmonella的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，应用其进行分子分型，其特征是依次包括以下步骤 (1)细菌的培养及DNA的提取 (2)用分子马达生物传感器进行分子分型 ①取4个I.5mL EP管，各加入待测样本10 μ L。将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却； ②分别取2 μ L Chro-invA、Chro_hut、Chro-spvR、Chro-sdf,用合成 buffer 稀释到一定的倍数。取稀释后的生物传感器分别加入上述EP管； ③阴性对照用10μ L无菌水代替DNA提取液进行。另取I个EP管加入10 μ L无菌水，沸水浴中加热3min,然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10 μ L合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀； ④向上述EP管中分别加入30μ L启动buffer (由ADP和上述合成buffer配置，体积比I : 3)，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠； ⑤将上述反应体系放入37°C恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450 μ LPBS缓冲液，振荡使体系混匀； ⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50 μ L,然后对每个加样孔分别加入30 μ L已配置好的荧光素酶溶液(将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置Ih)，用枪反复吹打几次使体系混匀； ⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值； ⑧将样本荧光值绝对值与H2O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著(P < 0. 05)表示检出该基因； (3)分型判断 检出属特异性基因invA和hut,可判断该菌为沙门氏菌；检出spvR,可判断具有毒性质粒；检出sdf，可判断该菌为肠炎沙门氏菌。
全文摘要
本发明属于一种对沙门氏菌进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的F0F1-ATPase分子马达生物传感器Chro-invA、Chro-hut、Chro-spvR、Chro-sdf对沙门氏菌的属特异性基因invA、hut，毒性质粒基因spvR和肠炎沙门氏菌种特异性基因sdf进行检测，从而对沙门氏菌是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断。第一，对属特异性基因invA、hut的检测可以对目标菌进行鉴定；第二，对spvR的检测可以对目标菌是否携带毒性质粒做出判断；第三，对sdf的检测可以对目标菌是否为肠炎沙门氏菌做出判断。方法包括试剂盒中F0F1-ATPase分子马达生物传感器的构建、用F0F1-ATPase分子马达生物传感器进行分子分型，最后根据分型结果对沙门氏菌是否携带毒性质粒以及是否为肠炎沙门氏菌进行分型判断。其优点在于灵敏度高、快速、操作简单、成本低廉。
文档编号G01N21/64GK102912021SQ20121040609
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者张捷, 周琦, 王静, 卢晓宇, 李兆杰, 张惠媛, 齐玮, 刘岩, 汪琦, 张昕, 陈广全, 王小晋, 王佩荣, 乐加昌 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 威海出入境检验检疫局