专利名称：一种糖化血红蛋白的检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种糖化血红蛋白的检测方法，具体地说，涉及一种离子交换树脂均相吸附分离法检测人血糖化血红蛋白的方法及检测试剂盒，用于体外定量测定人全血中的糖化血红蛋白的浓度，属于医用临床生化诊断试剂领域。
背景技术：
糖化血红蛋白Alc (Glycosylated hemoglobin Al,即HbAlc),为连接有己糖的血红蛋白Al，是血红蛋白在高血糖的作用下发生非酶促糖化反应的产物，通常占总Hb的5 8%。正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生产量与反应物的浓度成正比，由于蛋白质浓度保存相对稳定，糖化水平主要决定于血葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖接触的时间 长短有关。HbAlc的测定可反映测定前6 10周内的平均血糖水平。糖尿病是内分泌代谢疾病，以高血糖为其主要标志。糖尿病患者HbAlc值与空腹血糖呈正相关。健康人HbAlc为5 8%，未控制患者控制不好的糖尿病患者HbAlc可高达10 20% ;新发生的糖尿病人，虽有血糖水平增高，但可不见HbAlc明显增高。HbAlc的测定在临床上有着重要的意义，可作为糖尿病控制程度的良好指标，尤其对I型糖尿病和妊娠期糖尿病的治疗有监控作用。在临床上还可以估计治疗效果和治疗适应性，还可协助判断预后。目前，临床常用测定HbAlc的方法主要有酶联免疫法、胶乳免疫凝集法、离子树脂微柱层析法等。酶联免疫法是使用酶联免疫测定技术测定HbAlc，使用酶标仪、洗板机等，该方法操作繁琐，耗时长，受影响因素较多。胶乳免疫凝集法是利用抗原抗体反应形成复合物的自然凝集效果，以胶乳放大凝集信号，测定反应液浊度，一般使用全自动生化分析仪，目前应用比较广泛，但受方法及使用仪器限制，标本需集中测定。离子树脂微柱层析法是利用离子树脂的特异性吸附作用，将样本流过离子树脂层析柱，从而将HbAlc从样本中分离出来，再与总血红蛋白比较测定器含量，特异性高、精密度高、重复性好，在临床上有广泛应用，但是操作繁琐，耗时很长，受环境温度、挥发性酸碱物质影响大，如果不是熟练人员则人为误差也很大；另外，有改进自然层析为负压引流或者正压挤出的方法，也仅仅是缩短了一定的操作时间，同时带来了液体因流速过快跟树脂接触时间短而吸附不完全的弊端。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种糖化血红蛋白的检测方法及检测试剂盒，用于体外定量测定人全血中的糖化血红蛋白的浓度，该方法将微柱层析法进行彻底改进，将层析法改为液体均相吸附分离法，精密度高、简便快速，大大缩短了操作时间，降低了操作人员的劳动强度，无需大型仪器设备，无需集中测定，可少量甚至单个测定，可在病房及基层医疗机构方便开展。为解决以上问题，本发明采用的技术方案是一种糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于所述检测方法利用离子树脂对血红蛋白的特异性吸附作用，首先使用溶血剂制取血红蛋白样本，在25°C 40°C下，将离子树脂与制取的血红蛋白样本充分混匀，将血液中未糖化的血红蛋白完全吸附，血液中的糖化血红蛋白则留在液体中；
然后，测定吸附处理后液体、全血的吸光度值，根据处理后液体与全血吸光度值的比值得到糖化血红蛋白的含量。进一步地，所述血红蛋白样本的制备包括以下步骤
以EDTA抗凝采血管采集血样，制取人抗凝全血样本；吸取O. 5ml溶血剂加入试管中；吸取IOOul上述人抗凝全血样本加入上述试管中；混合均匀后放置5 10分钟，得到血红蛋白样本。进一步地，所述吸附处理后液体吸光度值的测定取单人份包装的离子树脂容器，内装离子树脂悬浮液；向上述容器中按照血红蛋白样本与离子树脂的体积比为I : 30的比例加入血红蛋白样本，密封； 将上述容器放入恒温混匀器内，在25°C 37°C下混匀5 15分钟，然后静置5 15分钟；取出容器，取上清液在405 415nm进行比色；测定时以蒸馏水作空白调零，测定吸光度值；
全血吸光度值的测定试管内加入5ml蒸馏水；再吸取20ul血红蛋白样本加入，混合均匀；以蒸馏水做空白调零，测定吸光度值。根据公式计算糖化血红蛋白的百分含量
4*/I/rfn A-T-TKri-, Θ_ 糖化血红蛋白吸光度 χ10
糖化血红蛋白含里〔重里%) - 总血红蛋白吸光度
进一步地，所述离子树脂为5 20mg/mld的阳离子交换树脂悬浮液，为ReX-70、SP_C50和CM-C50其中之一。进一步地，所述溶血剂为质量体积百分比为O. 1%的皂素溶液。进一步地，所述检测试剂盒包括包装盒、离子树脂、溶血剂、标准液；
所述离子树脂为5 20mg/mld的阳离子交换树脂悬浮液，为ReX-70、SP_C50和CM-C50其中之一，为单人份包装，为带盖的一次性狭缝塑料比色杯或者为带盖的一次性小瓶；所述溶血剂为O. 1%的阜素溶液。所述试剂盒用于体外定量测定人全血中的糖化血红蛋白(Glycosylatedhemoglobin Al, HbAlc)的浓度。适用仪器为适用于各种可以测定405 415nm吸光度的设备，如半自动生化仪、分光光度计、酶标仪等。HbAlc可作为糖尿病控制程度的良好指标，尤其对I型糖尿病和妊娠期糖尿病的治疗有监控作用。在临床上还可以估计治疗效果和治疗适应性，还可协助判断预后。本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点
本发明将微柱层析法进行彻底的改进，将层析法改为液体均相吸附分离法，提供一种新型离子树脂分离法试剂盒，使操作时间大大缩短，并使操作简便，降低了操作人员劳动强度，缩短了病人等待结果的时间。本发明采用上述方法，使用一次性塑料比色皿或者小瓶作为反应容器，有利于使反应过程的温度保持恒定，从而保证了所有测定条件的同一性，减少了误差，保证了结果的准确性，提高了精密度。
本发明无需大型仪器设备，无需集中测定，可少量甚至单个测定，从而应用范围更广，可在检验科、内科病房及基层医疗机构方便开展，使用方便。下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1，一种检测试剂盒，包括包装盒、离子树脂、溶血剂、标准液；
离子树脂为5 20mg/mld的阳离子交换树脂悬浮液，为Rex-70，为单人份包装，为带盖的一次性狭缝塑料比色杯或者为带盖的一次性小瓶；溶血剂为O. 1%的阜素溶液,为溶血使 用，标准液为冻干全血，经国家标准品校准赋值，用来进行校准，使用前以蒸馏水复溶。储存条件及有效期为原装试剂2 8°C避光保存，有效期18个月；
上述试剂盒用于体外定量测定人全血中的糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobinAl，HbAlc)的浓度。适用仪器为适用于各种可以测定405 415nm吸光度的设备,如半自动生化仪、分光光度计、酶标仪等。样本要求以EDTA抗凝采血管采集的血样，在2 8°C可保存4 7天。HbAlc可作为糖尿病控制程度的良好指标，尤其对I型糖尿病和妊娠期糖尿病的治疗有监控作用。在临床上还可以估计治疗效果和治疗适应性，还可协助判断预后。采用上述检测试剂盒检测糖化血红蛋白的方法，按照以下步骤进行采用的是离子交换树脂均相吸附分离法，利用离子树脂对血红蛋白的特异性吸附作用，首先使用溶血剂制取血红蛋白样本，在25 40°C条件下，将离子树脂与制取的血红蛋白样本充分混匀，将血液中未糖化的血红蛋白完全吸附，而血液中的糖化血红蛋白则留在液体中，然后测定吸附处理后液体、全血的吸光度值，然后将糖化血红蛋白的吸光度值与总血红蛋白的吸光度值进行比较，根据公式计算出糖化血红蛋白的浓度。具体操作方法如下
(1)血红蛋白样本的制备=WEDTA抗凝采血管采集血样，制取人抗凝全血样本；吸取
O.5ml溶血剂加入试管中；吸取IOOul上述人抗凝全血样本加入上述试管中；混合均匀后放置5 10分钟，得到血红蛋白样本；
(2)吸附处理后液体吸光度值的测定取单人份包装的离子树脂容器，为带盖的一次性狭缝塑料比色杯或者为带盖的一次性小瓶，内部装有离子树脂悬浮液，含量为5 20mg/ml ;向上述容器中按照血红蛋白样本与离子树脂的体积比为I : 30的比例加入步骤(I)制备的血红蛋白样本，盖上容器盖密封；将上述容器放入恒温混匀器，在25 37°C混匀5 15分钟，然后静置5 15分钟，优选为静置10分钟；取出容器，取上清液在405 415nm进行比色；测定时均以蒸馏水作空白调零，记录样本吸光度值；
(3)全血吸光度值的测定取试管加入5ml蒸馏水；再吸取20ul步骤(I)制备的血红蛋白样本加入，混合均匀；以蒸馏水做空白调零，测定并记录吸光度值；
(4)计算结果根据公式
权利要求
1.一种糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于所述检测方法利用离子树脂对血红蛋白的特异性吸附作用，首先使用溶血剂制取血红蛋白样本，在25°c 40°C下，将离子树脂与制取的血红蛋白样本充分混匀，将血液中未糖化的血红蛋白完全吸附，血液中的糖化血红蛋白则留在液体中； 然后，测定吸附处理后液体、全血的吸光度值，根据吸附处理后液体与全血吸光度值的比值得到糖化血红蛋白的含量。
2.如权利要求I所述的一种糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于所述血红蛋白样本的制备包括以下步骤 以EDTA抗凝采血管采集血样，制取人抗凝全血样本；吸取O. 5ml溶血剂加入试管中；吸取IOOul上述人抗凝全血样本加入上述试管中；混合均匀后放置5 10分钟，得到血红蛋白样本。
3.如权利要求I或2所述的一种糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于所述吸附处理后液体吸光度值的测定取单人份包装的离子树脂容器，内装离子树脂悬浮液；向上述容器中按照血红蛋白样本与离子树脂的体积比为I : 30的比例加入血红蛋白样本，密封； 将上述容器放入恒温混匀器内，在25°C 37°C下混匀5 15分钟，然后静置5 15分钟；取出容器，取上清液在405 415nm进行比色；测定时以蒸馏水作空白调零，测定吸光度值； 全血吸光度值的测定试管内加入5ml蒸馏水；再吸取20ul血红蛋白样本加入，混合均匀；以蒸馏水做空白调零，测定吸光度值。
4.如权利要求3所述的一种糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于所述离子树脂为5 20mg/mld的阳离子交换树脂悬浮液，为Rex_70、SP-C50和CM-C50其中之一。
5.如权利要求2所述的一种糖化血红蛋白的检测方法，其特征在于所述溶血剂为质量体积百分比为O. 1%的皂素溶液。
6.一种实现如权利要求1-5其中之一所述糖化血红蛋白检测方法的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包括包装盒、离子树脂、溶血剂、标准液； 所述离子树脂为5 20mg/mld的阳离子交换树脂悬浮液，为ReX-70、SP_C50和CM-C50其中之一，为单人份包装，为带盖的一次性狭缝塑料比色杯或者为带盖的一次性小瓶； 所述溶血剂为O. 1%的阜素溶液。
全文摘要
一种糖化血红蛋白的检测方法，利用离子树脂对血红蛋白的特异性吸附作用，首先使用溶血剂制取血红蛋白样本，在25～40℃下，将离子树脂与制取的血红蛋白样本充分混匀，将血液中未糖化的血红蛋白完全吸附，血液中的糖化血红蛋白则留在液体中，然后，测定吸附处理后液体、全血的吸光度值，根据处理后液体与全血吸光度值的比值得到糖化血红蛋白的含量。本发明将微柱层析法改为液体均相吸附分离法，使操作时间大大缩短，并使操作简便，降低了操作人员劳动强度，缩短了病人等待结果的时间；使用一次性塑料比色皿或者小瓶作为反应容器，减少了误差，提高了精密度；应用范围更广，可在检验科、内科病房及基层医疗机构方便开展，使用方便。
文档编号G01N1/34GK102890065SQ20121041425
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者孙希武, 秦英, 王永庆, 吐尔洪·买买提 申请人:潍坊鑫泽生物科技有限公司