专利名称：一种检测人蛋白c活性的方法
技术领域：
本发明属于蛋白质检测领域，涉及一种的检测人蛋白C活性的发色底物法。
背景技术：
人蛋白C (protein C，简称PC)是一种分子量约为62kD的糖蛋白，在血浆中含量约为2-6 mg/L。健康人的血浆蛋白C活性为100%(即I IU/ml)。临床多以占正常血浆蛋白C浓度的百分数来衡量PC的水平，健康成人的下限为65% — 75% (即O. 65—0. 75 IU/ml)，上限为124% —165%(即1. 24—1. 65 IU/ml)。该蛋白在人体中主要有抗凝血和抗炎症等作用，当人体中有生理活性的蛋白C显著降低时，会引发静脉血栓、弥散性血管内凝血等疾病，严重危及患者生命。检测人蛋白C活性的方法有凝固法和发色底物法。考虑到检测费用、时间等，在日常检测中一般采用发色底物法。
传统的检测蛋白C的发色底物法包括以下几个步骤37°C激活5-10分钟一37°C显色5-10分钟一终止一读数。目前该方法存在以下不足开始要加入激活剂进行孵育激活，然后再加入作用底物进行显色，最后加入终止液终止反应，在整个实验过程中要进行三次的间断性添加试剂，操作繁琐，费时费力，而且在多样品检测时容易造成操作失误。基于上述因素，本发明通过优化反应体系和实验条件，建立了新的检测人蛋白C的发色底物法，该方法具有良好的重复性，显著降低了操作的复杂程度，减少造成人为失误的概率，并能准确检测人蛋白C的活性，有效确保了检测结果的真实性和准确性。
发明内容
本发明提供了一种减少操作步骤、确保检测准确性的发色底物法用于检测人蛋白C的活性。该方法能显著减少操作步骤，减少检测所需时间，降低造成的人为失误，并能有效地检测出人蛋白C的活性。本发明所述的用于检测人蛋白C的发色底物的方法，包括
(I)激活和显色
将用样品稀释液稀释后的样品10-50 μ L加入96孔板中，然后依次加入约3倍体积的人蛋白C的特异性的激活剂(商业化产品，一种提取自蝮蛇蛇毒中的蛋白质)和活化的人血浆蛋白C的特异性的显色底物(商业化产品，一种连接对硝基苯胺显色基团的三肽化合物)，然后在37 °C水浴孵育8-20分钟。⑵终止
加入约3倍待测样品体积的酸性终止液，终止反应。(3)读数
在405nm波长读取吸光值。本发明在“激活和显色”过程中，所用的样品稀释液为pH 7. 2-8. 4的20_50mM的Tris缓冲液或!fepes缓冲液，从而使稀释后的样品pH在7-8之间，与生理情况下血浆的pH相近，进而保证检测的准确性。加入的人蛋白C激活剂的浓度为O. 05-0. 4 IU/ml，显色底物的浓度为O. 05-2 mg/ml，保证人蛋白C能完全反应。在“终止”过程中加入的酸性终止液中为体积百分浓度为20-50%的醋酸。
Tris :是Tris (Hydroxymethyl) aminomethane的常用缩写；中文品名三轻甲基氨
基甲烧。Hepes :4_(2-Hydroxyethyl)-l-piperazineethanesulfonic acid 的常用缩写；中文品名4_羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸。IU :是International unit的常用缩写,是用生物活性来表示某些蛋白质、抗生素、激素、维生素及抗毒素量的药学单位。IU/ml :是单位体积(ml)中所含的生物活性量。本发明的有益效果是，将传统的检测人蛋白C的发色底物法过程中的两个单独的“激活”和“显色”过程合并为一个“激活和显色”步骤，大大简化了操作步骤，使操作时间降为传统的1/2-2/3，减少造成人为失误的可能性，检测准确性与灵敏度与传统方法相似。
图1传统方法和新方法的标准曲线
在图1中，横坐标(X axis)是检测到的吸光值的对数值,纵坐标(Y axis)是蛋白C的活性的对数值。两条曲线分别是以人蛋白C活性为150%、100%、50%、25%和12. 5%五个梯度，用传统方法和该发明的新方法做的标准曲线。传统方法(籲)标准曲线的方程式为Log(y)=0. 0407+1. 05*Log(x)，相关系数R2=O. 997 ;新方法(▲)标准曲线的方程式为Log (y)= -O. 143+1. 06礼og(x)，相关系数 R2=O. 997。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步说明本发明，但并不是将本发明的保护范围限定为所列举的实施例。实施例1 :
Cl)激活和显色
用pH 7. 2的20mM Tris缓冲液将标准血浆稀释成3/8、1/4、1/8、1/16和1/32五个浓度梯度；待测样品稀释为1/4，取25 μ L分别加入96孔板中，然后依次加入75 μ L O. 32 IU/ml的激活剂protac (法国Hyphen BioMed公司)和1. 6 mg/ml的作用底物S2366 (p-谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-P-硝基苯胺盐酸盐，法国Hyphen BioMed公司)，振荡混匀后在37°C水浴孵育14分钟。(2)终止
加入75 μ L体积百分比为50%的醋酸终止液，静置I分钟。(3)读数
使用美国Molecular Devices公司的SpectraMax M2e酶标仪在405nm波长处读取吸光值。所得实验数据用SoftMax软件中的Log-Log数据处理模式处理后，以人蛋白C的吸光值的对数值为横轴、人蛋白C活性的对数值为纵轴分别制作出传统方法和本发明新方法的标准曲线(如图1所示)，计算出待测样品中人蛋白C的活性，结果如下表所示
权利要求
1.一种检测人蛋白C活性的方法，其特征是用于检测人蛋白C的发色底物的方法，包括①激活和显色将用样品稀释液稀释后的样品10-50 μ L加入96孔板中，然后依次加入约3倍体积的人蛋白C的特异性的激活剂——一种提取自蝮蛇蛇毒中的蛋白质和活化的人蛋白C的特异性的显色底物——一种连接对硝基苯胺显色基团的三肽化合物，然后在 37°C水浴孵育8-20分钟；②终止加入约3倍待测样品体积的酸性终止液，终止反应；在 “终止”过程中加入的酸性终止液的体积百分浓度为20-50%的醋酸；③读数在405nm波长读取吸光值。
2.根据权利要求1所述的一种检测人蛋白C活性的方法，其特征是在“激活和显色”过程中，所用的样品稀释液为pH 7. 2-8. 4的20-50mM的Tris缓冲液或Ifepes缓冲液，从而使稀释后的样品PH在7-8之间，与生理情况下血浆的pH相近，进而保证检测的准确性；加入的人蛋白C激活剂的浓度为O. 05-0. 4IU/ml，显色底物的浓度为O. 05_2mg/ml，保证人蛋白 C能完全反应。
全文摘要
本发明公开了一种检测人蛋白C活性的方法，用于检测人蛋白Ｃ活性的发色底物的方法，包括激活和显色:同时进行，所用的样品稀释液为pH7.2-8.4的20-50mM的Tris缓冲液或Hepes缓冲液，从而使稀释后的样品pH在7-8之间，与生理情况下血浆的pH相近，进而保证检测的准确性；加入的人蛋白Ｃ激活剂的浓度为0.05-0.4IU/ml，显色底物的浓度为0.05-2mg/ml，保证人蛋白Ｃ能完全反应；本发明的有益效果是，将传统的检测人血浆PC的发色底物法过程中的两个单独的“激活”和“显色”过程合并为一个“激活和显色”步骤，大大简化了操作步骤，使操作时间降为传统的1/2～2/3,减少造成人为失误的可能性，检测准确性与灵敏度达到传统检测方法要求。
文档编号G01N21/31GK103018188SQ20121058458
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者王宗奎, 杜晞, 李长清, 王玉梅, 袁靖, 陈云华, 刘欣晏, 杨刚 申请人:中国医学科学院输血研究所, 贵州泰邦生物制品有限公司