专利名称：一种利用超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱法检测多组分微囊藻毒素的方法
技术领域：
本发明属于水质检测领域，更具体地说，涉及一种利用超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱法检测多组分微囊藻毒素(以LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY为代表)的方法。
背景技术：
随着环境污染和富营养化程度加剧，淡水流域中有害藻类水华尤其是蓝藻水华频繁发生，现已成为国内外普遍关注的环境问题。许多蓝藻能产生以微囊藻毒素(microcystin MC)为代表的毒素，目前已发现60多种异构体，它是一类具有强烈促癌作用的肝毒素。MC是一类单环七肽物质，一般结构为环D-丙氨酸-L-X-赤-8-甲基-D异天冬氨酸-L-Y-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸。其中Adda为一种特殊的氨基酸，结构为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯-4，6-二烯酸，它是MCs生物活性表达所必需的，研究发现去除Adda后藻毒素的毒性降低。X、Y为两个可变的氨基酸残基，这两个可变的L 一氨基酸的更替及其它氨基酸的去甲基化，衍生出众多的毒素类型，至今已发现MCs有60多种异构体，其中存在最普遍也是含量较多的是LR、RR、YR，其中L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸。由于环状结构和间隔双键，微囊藻毒素具有相当的稳定性，加热到300°C很长时间仍未能使之分解，而且尽管它们是多肽类物质，但普通的蛋白质水解酶对它们不起作用。微囊藻毒素在阳光下也较稳定，但在蓝藻色素存在的条件下或在微生物的作用下，光降解速度加快(《HJ478-2009水质多环芳烃的测定高效液相色谱法》)。MCs极易溶于水，不易沉淀或被吸附于沉淀物和悬浮颗粒物中，可溶于甲醇或丙酮(《GB/T13198-1991水质六种特定多环芳烃的测定高效液相色谱法》)，现行自来水处理工艺的混凝、沉淀、过滤、加氯均不能有效去除微囊藻。我国已有许多饮用水源发生蓝藻水华并监测出微囊藻毒素，尤其是出现了太湖大面积爆发蓝藻水华引起某城市饮用水污染的严重事故，因此加强水质的微囊藻毒素监测就显得尤为迫切，在美国微囊藻毒素已被列为微生物和有机污染物的检测项目。目前微囊藻毒素的检测技术主要有生物分析法、细胞毒性检测法、酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱/质谱法(LC/MS)等，而且陆续有新方法、新技术出现。这些方法技术由于原理不同而各有所长。国内对微囊藻毒素有一定的研究，而且是一两种单一组份，没有多组份残留分析。尤其对环境中的地表水中的多组份的残留分析研究还没有开展。因此建立环境中微囊藻毒素监测的方法很有必要。高效液相色谱法(HPLC)是WHO、美英等发达国家和我国权威机构推荐的MC检测方法。该方法具有准确、灵敏、重现性好，能同时分析出不同的MC异构体等优点。但HPLC监测技术往往需要标准毒素，而目前只发现60多种MC，多数缺乏标准毒素，这限制了 HPLC的进一步应用。LC/MS技术很好地解决了这一问题，即使没有标准毒素，只要知道这种毒素的分子量，就可对其进行定性，而且LC/MS技术亦可对毒素进行精确定量。
发明内容
1.要解决的技术问题针对现有技术中多组分微囊藻毒素的检测方法中存在的只能检测一两种单一组分且检测精度不高的问题，本发明提供了一种利用超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱法检测多组分微囊藻毒素的方法,它以多组分微囊藻毒素中的组分LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY为代表，同时分析水体中的该7种毒素，分析效率高且检测结果准确。2.技术方案本发明的目的通过以下技术方案实现。本发明的一种利用超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱法检测多组分微囊藻毒素的方法，其步骤为:(I)标准曲线绘制(i )微囊藻毒素标准储备液的配制:精确称量MC-LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY标准品中各IOOiI g，加入Iml甲醇，制成浓度均为100mg/L的标准溶液储备液，_80°C保存；(ii)将微囊藻毒素标准储备液用甲醇稀释，配制浓度依次为0.1,1.0,2.0,5.0、10.0 u g/L的系列标准溶液，绘制标准曲线；(2)微囊藻毒素样品的采集及前处理(i)采集一定体积的水样，4°C冷藏保存；(ii)将上述水样经0.45 u m滤膜减压过滤；(iii)滤液的pH值调节至4.0，过C18反相固相萃取柱，该C18反相固相萃取柱在使用前进行活化，活化剂为甲醇:三蒸水以1:1的体积比配制；将水样以5 lOmL/min的流速流过固相萃取柱进行富集浓缩；(iv)上样完毕后，用体积百分比为20%甲醇水溶液淋洗样品，用氮气吹干固相萃取柱后，以lmL/min，用体积为步骤(i )中的样品体积的5%的甲醇将固相萃取柱中的微囊藻毒素洗脱，洗脱液收集于浓缩瓶内，氮吹浓缩至步骤(i )中的样品体积的0.5%定容，并经针头过滤器过滤保存，待检测用；(3)在以下条件下进行检测分析(i)离子源参数电喷雾:正离子毛细管电压:2.50kV锥孔电压:V (不同物质该最优值不同)萃取电压:3V离子源温度:150°C脱溶剂气温度:350°C脱溶剂气流量:900L/hr锥孔反吹气流量:20L/hr(ii)质量分析器参数低端分辨率LF Lensl: 13.0V高端分辨率HM Lensl: 13.0V ；离子能量1:1.0V
入口透镜电压:-2V碰撞梯度:V (不同母离子和子离子不同)出口电压:1.0V ;低端分辨率LF Lens2: 13.0V高端分辨率HM Lens2: 13.0V离子能量2:1.0V增益:1.0OV碰撞气流量:0.13ml/min采用的多反应监测(MRM)模式，参数设定如下:表IMC MRM方法参数
权利要求
1.一种利用超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱法检测多组分微囊藻毒素的方法，其步骤为: (1)标准曲线绘制 G )微囊藻毒素标准储备液的配制:精确称量MC-LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY标准品中各100呢，加入Iml甲醇，制成浓度均为100mg/L的标准溶液储备液，_80°C保存； (ii)将微囊藻毒素标准储备液用甲醇稀释，配制浓度依次为0.1、1.0、2.0、5.0、10.0 u g/L的系列标准溶液，绘制标准曲线； (2)微囊藻毒素样品的采集及前处理 G )采集一定体积的水样，4°C冷藏保存； Gi)将上述水样经0.45 u m滤膜减压过滤； (in )滤液的pH值调节至4.0,过C18反相固相萃取柱,该C18反相固相萃取柱在使用前进行活化，活化剂为甲醇:三蒸水以1:1的体积比配制；将水样以5 10 mL /min的流速流过固相萃取柱进行富集浓缩； Gt )上样完毕后，用体积百分比为20%甲醇 水溶液淋洗样品，用氮气吹干C18反相固相萃取柱后，以ImL /min，用体积为步骤C )中的样品体积的5%的甲醇将固相萃取柱中的微囊藻毒素洗脱，洗脱液收集于浓缩瓶内 ，氮吹浓缩至步骤G )中的样品体积的0.5%定容，并经针头过滤器过滤保存，待检测用； (3)在以下条件下进行检测分析 ()离子源参数 电喷雾:正离子 毛细管电压:2.50kV 锥孔电压:V 萃取电压:3V 离子源温度:150°C 脱溶剂气温度:350°C 脱溶剂气流量:900L/hr 锥孔反吹气流量:20 L/hr (H)质量分析器参数 低端分辨率LF Lensl: 13.0V 高端分辨率HM Lensl: 13.0V 离子能量1:1.0V 入口透镜电压:-2V 碰撞梯度:V 出口电压:1.0V; 低端分辨率LF Lens2: 13.0V 高端分辨率HM Lens2: 13.0V 离子能量2:1.0V增益:1.0OV 碰撞气流量:0.13ml/min 釆用的多反应监测(MRM)模式，参数设定如下: 表I MC MRM方法参数
2.根据权利要求1所述的一种利用超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱法检测多组分微囊藻毒素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的C18反相固相萃取柱采用的是BondElut C18反相固相萃取柱。
全文摘要
本发明公开了一种利用超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱法检测多组分微囊藻毒素的方法，属于水质检测领域。其步骤为(1)标准曲线绘制；(2)微囊藻毒素样品的采集及前处理；(3)在以下条件下进行检测分析。本发明提供了一种利用超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱法检测多组分微囊藻毒素的方法，它以多组分微囊藻毒素中的组分LR、RR、YR、LW、LF、LA、LY为代表，同时分析水体中的该7种毒素，分析效率高且检测结果准确。
文档编号G01N30/88GK103076420SQ20121058966
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者赵永刚, 唐松林, 张蓓蓓, 章勇 申请人:江苏省环境监测中心