专利名称：丙型肝炎抗体确证试剂的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物应用技术领域，特别是一种丙型肝炎抗体确证试剂。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)是1989年由美国Choo等从受感染的黑猩猩血液标本中最初发现，主要由血液、体液传播，占输血后肝炎的70%。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3 %，估计约1.7亿人感染HCV。丙型肝炎慢性化率为50 % 85 %，其中又有20 %可发展为肝纤维化，危害十分严重。我国HCV的感染率和世界水平接近，HCV抗体携带者达4千万左右。到目前为止丙型肝炎既无有效疫苗，亦无有效的治疗方法，预防感染是唯一有效的方法。预防感染的主要措施是对HCV抗体进行有效的检测。1993年我国将HCV抗体检查列为我国法定的血源性筛查项目。ELISA法HCV抗体诊断是当前最为常用的HCV检查方法，采用HCV的C22-3、C33C、C100-3和NS5作为包被抗原，用间接法进行检测。免疫层析胶体金技术是新展起来的HCV抗体检测技术，与ELISA相比，具有检测方便、快速、适于现场检测，稳定性好等特点。但ELISA法和胶体金法都有一定的假阳性率，只能作为HCV抗体检测的初筛使用。HCV抗体检测公认的确证方法是重组免疫印迹(RIBA)试剂，只有ChironOrtho和MP等公司生产，但这些试剂存在操作复杂，反应时间长等问题。
发明内容本实用新型的目的是为了解决上述问题，设计了一种丙型肝炎抗体确证试剂。实现上述目的本实用新型的技术方案为，一种丙型肝炎抗体确证试剂，其特征在于，试剂包括HCV抗体试纸、洗涤液、显色系统、阳性对照品、阴性对照品；所述HCV抗体试纸上包被了 6条蛋白条带，分别是HCV重组抗原C100、C33C、C22、NS5和2条不同浓度的人IgG, C100、C33C、C22、NS5为基因工程表达纯化制成，或用氨基酸人工合成，不含hSOD等标签蛋白，抗人IgG采用免疫纯化制备；胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素组成显色系统,胶体金直径为20-100nm, SPA、亲和素为提取纯化或基因工程表达制成；HCV抗体试纸结构为NC膜，NC膜下方紧密连接的吸样垫，NC膜和吸样垫装载在塑料外壳中。所述HCV抗体试纸上包被有6条蛋白条带。所述HIV抗体试纸的结构为NC膜与吸样垫搭接在一起装入塑料壳构成的。所述蛋白条带都被包被在NC膜上。所述6条蛋白条带分别由高浓度人IgG、C100、C33C、C22、NS5和低浓度人IgG包被而成的。所述显色试剂是由胶体金标记的抗人IgG或SPA构成的。所述显色试剂还可由胶体金标记的亲和素与生物素标记的抗人IgG或SPA混合构成的。所述洗涤液是含有TWeen20的磷酸盐缓冲液。[0012]所述阳性对照品和阴性对照品都是通过人HIV抗体阳性血清处理后制得的。利用本实用新型的技术方案制作的丙型肝炎抗体确证试剂，HCV抗体试纸选用包被的C33C的NS5抗原为非HSOD融合抗原，所以与CHIRON产品相比，不需要设立HSOD条带，降低制造和判定复杂程度，但可确保判定结果；采用了胶体金显色试剂，与其它酶显色试剂相比，更为简单、直接、稳定；利用本试剂盒检测可明显缩短了检测时间，并且操作简单，本试剂盒在60min内可完成单个检测，30个检测所需时间不超过90min，而其它检测设备需时约6小时。
图1为本实用新型所述HCV抗体试纸的剖面结构示意具体实施方式
如图所示，所述HCV抗体试纸上包被有6条蛋白条带,所述6条蛋白条带分别由高浓度人IgG、C100、C33C、C22、NS5和低浓度人IgG包被而成的。其中，所述HCV抗体试纸制备过程为:1、包被NC膜:将蛋白用0.0lM的磷酸盐缓冲液稀释成0.001-2mg/ml,优选为，高浓度人IgG为0.05mg/ml,低浓度人IgG为0.005mg/ml,ClOO 为 0.2mg/ml, C33C 为 lmg/ml, C22 为 0.5mg/ml, NS5 为 0.8mg/ml。NC 膜选用 0.45um孔径的膜，宽度30mm，长度300mm，将稀释好的抗体装载在喷膜机上，按lul/cm划线，各线的间隔为2-5mm，优选为3mm，划线完成后，将NC膜置于30%以下的湿度干燥4小时以上；2、制备试纸:将NC膜横向切成3-8_的宽度，优选为5_，在NC膜下部垫上吸样垫，吸样垫为吸水材料，吸水能力不低于1.5ml，然后装入大小合适的塑料卡内，形成试纸。所述显色试剂可分为直接显色试剂和生物素-亲和素显色试剂两种，这两种试剂的制备过程分别为:1、直接显色试剂:(I)用还原法制备尝试为0.02%的20_100nm的胶体金，优选为40nm的胶体金；⑵用K2C03将胶体金pH调节成8.0，按IOug抗人IgG或SPA每ml胶体金将蛋白加入，混匀30min，离心弃上清，将溶液用1/10体积的磷酸盐缓冲液溶解，加入微量防腐剂，即成为显色试剂。2、生物素-亲和素显色试剂:⑴用还原法制备尝试为0.02%的20-100nm的胶体金，优选为40nm的胶体金；(2)用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-轻基琥拍酰亚胺酯溶液，用硼酸盐缓冲液(0.lmol/L, pH8.8)配制浓度为2mg/ml的抗人IgG或SPA溶液，按25ug/mg的比率将生物素酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4hr，将抗体溶液用PBS透析，以除去未结合的生物素，再稀释成合适的比例后，制成显色底物I ; (3)用K2C03将胶体金pH调节成8.0,按IOug亲和素每ml胶体金将蛋白加入,混勻30min,离心弃上清,将溶液用1/10体积的磷酸盐缓冲液溶解，加入微量防腐剂，为显色底物2 ； (4)显色底物I和2构成显色试剂。所述阳性对照品为人HCV抗体阳性血清，经处理后制成，基抗HCVC100、C33C、C22、NS5均为阳性；所述阴性对照品为人HCV抗体阳性血清，经处理后制成，基抗HCV C100、C33C、C22、NS5均为阴性；所述洗涤液为含0.5% Tween20的0.0lM的磷酸盐缓冲液。所述丙型肝炎抗体确证试剂，检测方法如下:[0022]1、将试剂和待检血清(浆)平衡到室温；2-8°C保存的试剂需20_30min平衡至室温;2、将HCV抗体试纸取出，平放，向试纸的NC膜上滴加80_120ul的待检血清(浆)样本，样本将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min ；3、向NC膜上滴加80_120ul洗涤液，等洗涤液渗入进膜后，再滴加80_120ul洗涤液，重复洗涤2次，此过程约5-8min ；4、若采用直接显色系统，向NC膜上滴加80_120ul胶体金标记的抗人IgG或SPA，胶体金将将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min ;若采用生物素-亲和素显色系统，向NC膜上滴加80-120ul生物素标记抗人IgG或SPA，待生物素缓慢渗入NC膜后，再滴加80-120ul洗涤液，参照步骤3，洗涤3次，此过程约5-8min，再加入80_120ul胶体金标记的亲和素，胶体金将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min ；5、向NC膜上滴加80_120ul洗涤液，等洗涤液渗入进膜后，再滴加80_120ul洗涤液，重复洗涤I次,此过程约4-6min ；6、此时NC膜上将出现胶体金显色的红色条带，用专用的检测仪器或肉眼判定检测结果。进行上述检测时需同时平行做阳性和阴性对照，即用阳性对照品和阴性对照品同时做一次检测。所述HCV抗体抗确证试剂，结果判定方法如下:1、条带阴、阳性的判定方法:仪器检测方法，用免疫层析结果判读仪检测:将反应后HCV抗体试纸放入仪器内，启动设定程序，仪器将自动显示出各条带的检测结果，给出定量的值。肉眼判读法:直接观察指定区域内是否有显色条带出现，有条带为阳性，反之为阴性。2、条带强度的判定方法:条带强度分为5级:-:条带强度不可见或低于低浓度IgG条带的强度；1+:条带强度类似于低浓度IgG条带的强度；2+:条带强度介于低浓度IgG和高浓度IgG条带强度之间；3+:条带强度类似于高浓度IgG条带的强度；4+:条带强度高于高浓度IgG条带的强度。检测系统有效的判定，需满足以下所有条件:1、阳性对照的所有条带需显示出肉眼可见的条带或仪器检测出有效值；2、阴性对照两条IgG线需显示出肉眼可见的条带或仪器检测出有效值，余下4条带检测均需为阴性；3、待检样本两条IgG线应显示出肉眼可见的条带或仪器检测出有效值；4、所有检测试纸中高浓度IgG条带的强度需高于低浓度IgG条带。否则检测无效，需重新检测。检测结果阴阳性的判定，需在检测系统有效的情况下判定:阴性:C100、C33C、C22、NS5条带显色强度均为阴性；不确定:C100、C33C、C22、NS5条带中有一条为阳性；[0048]阳性:C100、C33C、C22、NS5条带中有二条或以上为阳性；本专利和现有的产品或专利比较，有以下的不同:(I)选用的抗原部分不同，C33C和NS5抗原为非HSOD融合抗原，所以与CHIRON产品相比，不需要设立HSOD条带，降低制造和判定复杂程度，但不影响判定结果；(2)采用了胶体金显色方法，与其它酶显色法相比，更为简单、直接、稳定；(3)明显缩短了检测时间，并且操作简单，本试剂在60min内可完成单个检测，30个检测所需时间不超过90min，而其它检测需时约6小时；(4)结果可用专用的检测仪器判定，与肉眼判定相比，可以检测出更微弱的条带，并可避免肉眼主观判定时潜在的错误。综合以上特点，本试剂是一种新的HCV抗体确证试剂，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。实施例1:HCV抗体确证试剂盒的制造1、主要材料1.1HCV特异性抗原C100、C33C、C22、NS5:由北京京麦克莱金生物技术有限公司提供，为基因工程表达的HCV抗原，抗原不含HSOD蛋白标签；人IgG和鼠抗人IgG:由深圳菲鹏生物技术有限公司提供；NC膜:美国Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG) 20000、水解酪蛋白:美国Sigma公司产品；其它试剂为常规分析纯化学试剂。1.2检测仪器:免疫层析结果判读记录仪，型号:NS3001，天津中新科炬生物制药有限公司产品。1.3临床血清:由公司在相关医院获得，HCV抗体阳性样本20份，已由新加坡MP试剂检测确证；阴性样本20份，采自健康人，临床综合检测判定为阴性。2、主要方法2.1HCV抗体试纸的制备:将蛋白用0.0lM的磷酸盐缓冲液稀释成不同浓度，每个蛋白均设3个浓度:高浓度人IgG为0.02,0.05和0.lmg/ml，低浓度人IgG为0.002,0.005和 0.0lmg/ml，ClOO 为 0.2、0.4 和 0.6mg/ml，C33C 为 0.5、I 和 1.5mg/ml，C22 为 0.2、0.5 和
1.0mg/ml,NS5 为 0.4、0.8 和 1.5mg/ml ;NC膜选用 0.45um孔径的膜，宽度 30mm,长度 300mm,将稀释好的抗体装载在喷膜机上，按lul/cm划线，各线的间隔为3mm，划线完成后，将NC膜置于30%以下的湿度干燥4小时。干燥完成后用切条机将NC膜横向切成5_的宽度，在NC膜下部垫上吸水滤纸，吸水滤纸大小为15X30mm,6层吸水滤纸重叠摆放，吸水能力2_2.5ml,然后装入大小合适的塑料卡内，压紧，形成试纸。2.2显色系统的制备:用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K2C03将溶液调到pH7.0、pH8.0和pH9.0，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每IOOml溶液加入0.5mg、lmg、l.5mg鼠抗人IgG,将抗体滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0.1%的PEG2000和1%的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀，按原体积复溶至原体积1/10的胶体金工作液(硼酸盐缓冲液，pH8.0，含BSA、羊血清，蔗糖、表面活性剂和防腐剂)中。2.3洗涤液的制备:为0.0lM pH7.4的磷酸缓冲液，含0.9 % NaCl, 0.05 %Tween20,以20倍浓缩形式保存，使用前用纯化水稀释至工作浓度。2.4对照品:用临床血清制成。阳性对照品:选用HCV抗体阳性血清，数份血清混合，经适当稀释，并灭活制成，用MP试剂盒检测，C100、C33C、C22、NS5均为阳性；阳性对照品:用数份健康人血清混合制成，用MP试剂盒验证为HCV抗体阴性。2.5检测方法:对不同浓度包被的HCV抗体试纸和不同pH标记的显色系统进行逐一配对，分别用阳性对照品和阴性对照品进行检测，检测方法如说明书所述，检测结果放入免疫层析结果判读记录仪中，设定参数，读取各反应线的GOD值，确定产品的最佳参数。2.6结果判定方法:如说明书所述方法进行判定。3、结果检测3.1包被抗原浓度的确定采用不同浓度的蛋白抗原包被后，用pH8.0标记的显色系统测试，阴性对照品测试均符合标标准，阳性对照品检测结果如下:表1:不同包被蛋白浓度的检测值(GOD)
权利要求1.一种丙型肝炎抗体确证试剂，其特征在于:试剂包括HCV抗体试纸、洗涤液、显色系统、阳性对照品、阴性对照品；所述HCV抗体试纸上包被了 6条蛋白条带，分别是HCV重组抗原C100、C33C、C22、NS5和2条不同浓度的人IgG ;胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素组成显色系统。
2.根据权利要求1所述的丙型肝炎抗体确证试剂，其特征在于:HCV抗体试纸结构为NC膜、NC膜下方紧密连接的吸样垫和装载NC膜及吸样垫的塑料外壳；NC膜从一端开始，依次包被的6条蛋白条带为高浓度人IgG、HCV重组抗原C100、C33C、C22、NS5和低浓度人IgG0
3.根据权利要求1所述的丙型肝炎抗体确证试剂，其特征在于:胶体金直径为20_100nm。
专利摘要一种丙型肝炎抗体确证试剂，试剂包括体试纸、洗涤液、显色系统、阳性对照品及阴性对照品；所述HCV抗体试纸上包被了6条蛋白条带，分别是HCV重组抗原C100、C33C、C22、NS5和2条不同浓度的人IgG；胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素显色系统；用免疫层析结果判读仪或肉眼判定条带显色情况判定检测结果，进行HCV抗体的确证，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/576GK203164190SQ20122017089
公开日2013年8月28日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者齐明山, 吴澜 申请人:齐明山, 吴澜