专利名称：一种检测乳品中氟喹诺酮类药物的免疫胶体金试剂板的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测乳品中氟喹诺酮类药物的免疫胶体金试剂板，具体涉及一种检测乳品中氟喹诺酮类药物的免疫胶体金快速检测试剂板。
背景技术：
牛奶及其制品是人尤其是婴幼儿的主要营养食品，但残留抗生素的牛奶会严重危害饮用者的身体健康。近年来，由于经济利益的驱动，不合理地使用和滥用饲料添加剂的情况经常发生，造成抗生素在动物组织中的残留，并通过食物链进入人体，已经对人类的健康构成了严重的威胁。牛奶中的抗生素残留会导致人体内产生耐药性菌株，造成人体内的菌群失调，使人的免疫力降低，严重时可危及病人生命。另外，残留抗生素会影响奶制品品质，降低产量和质量，给生产者造成巨大的经济损失。氟喹诺酮类(FQNs)又称吡啶酮酸类药物，是一类人工合成的广谱抗菌药，是近20·年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素。FQNs药物具有抗菌谱广、抗菌作用强、体内分布广泛、组织药物浓度高、蛋白结合率低、使用方便、不良反应小及价格低廉等特点，已成为兽医临诊中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促生长。由于潜在耐药性和致癌性，其残留问题已引起世界各国的广泛关注。美国禁止在食用动物养殖中使用氟喹诺酮类药物；我国以及世界卫生组织、欧盟、日本等国家和组织都将氟喹诺酮类药物列入限制使用的兽药名单中，并制订出相应的最高残留限量，牛奶中氟喹诺酮类药物的最高残留限量在20 100μ g/L之间。因此，开展对牛奶中氟喹诺酮类药物残留的检测方法研究，实施对氟喹诺酮类药物残留的监控，已是当务之急。目前国内外有关氟喹诺酮类药物的检测方法，主要有微生物法、色谱法、免疫分析法等。但色谱法，如高效液相色谱法(HPLC)，需要昂贵、复杂的仪器设备，且操作过程繁琐，不符合市场监控、快速、简便、价廉的要求。免疫分析法是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种简便、快速、敏感的分析方法，一般不需要昂贵的仪器、前处理简化、灵敏、特异性强、快速，越来越多地被用于食品中药物等残留的检测。目前，应用广泛的免疫分析方法主要是酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法。酶联免疫吸附法是应用抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用来测定药物含量的免疫分析方法，具有特异性强、灵敏度高、快速、简便等优点。但是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，由此易造成测定结果重复性较差。而且需要用到昂贵的特殊仪器设备，具有一定的局限性。胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术。该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟，测试结果以肉眼可见的显色条带来判断。具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。
实用新型内容本实用新型针对检测需求，研制开发一种检测限符合要求，重现性好，检测时间短，适合现场快速检测，技术产品或仪器设备成本较低，运行费用低的快速检测试剂。本实用新型试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测牛奶中的氟喹诺酮类药物残留水平。如果样品溶液中含有氟喹诺酮类药物残留，氟喹诺酮类药物先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的氟喹诺酮类药物药物占据而无法与检测线上氟喹诺酮类药物特异性抗原结合；当样品中的氟喹诺酮类药物含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色比控制线浅或无显色，判定为阳性。反之，当样品中氟喹诺酮类药物含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色比控制线深或一样深，判定为阴性。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品 垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有1-2_的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。胶体金结合垫上包被有抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线。偶联氟喹诺酮类药物的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血监蛋白等。本实用新型试剂板的各部分组成成分和功能如下塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。本实用新型试剂板具有如下有益效果(I)特异性好。本实用新型试剂板对氟喹诺酮类药物的交叉反应率为100%，对氯霉素、链霉素、四环素、磺胺类抗生素药物的交叉反应率均低于I %。可见，本实用新型试剂板对氟喹诺酮类药物反应具有高度专一性。(2)灵敏度高。本实用新型试剂板对牛奶中单种氟喹诺酮类药物的最低检出限为30μ g/L，在实际检测中，可以检测出多种氟喹诺酮类药物，其检测药物及检测限见表I。完全可以满足市场的检测需求，试剂板适用于各类企业及检测机构。表I牛奶中部分氟喹诺酮类药物检测限(μ g/L)药物名称I环丙沙星诺氟沙星欢氟沙星麻保沙星洛美沙星沙拉沙星~
检狈!!限303040306060
药物名称左氧氟沙星氟罗沙星氧氟沙星单诺沙星伊诺沙星
检狈!!限60100100303050
药物名称恩诺沙星培氟沙星氨氟沙星加替沙星萘啶酮酸~
检狈!!限5060100100100100(3)操作简单快捷。本实用新型试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后5-10分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。 (4)成本低，易推广。本实用新型试剂板生产工艺简单,流程成熟。生产成本低廉，投资少，收效快。
图I为氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板背衬结构示意图，其中I为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC底板。图2为氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。图3为氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。具体实施方法本实用新型试剂板的制备包括载体蛋白偶联物的制备，抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备和氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板的组装。I.半抗原与载体蛋白的偶联采用改进的碳二亚胺法将8mg的牛血清蛋白(BSA)溶解在4mLPBS(0. 01mol/L,pH5. O)中，分别加入240mg乙基碳二亚胺(EDC)和20mg环丙沙星(CIP)，在室温中反应2h静置，装入透析袋中，在PBS(0. 01mol/L，pH5. O)中透析2天，期间每天换液一次。偶联物冷冻干燥后，_20°C下冻存备用，此为CIP-BSA偶联物。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备CIP半抗原-卵清蛋白偶联物。2.抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备(I)FNQs半抗原的制备取吡哌酸(8-乙基-5-氧代-5，8- 二氢_2_ (I-哌嗪基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸)500mg溶于30mL水中，加入EDC 200mg室温反应lh，再加入对氨基苯乙酸150mg反应过夜。然后经酸洗提取出FNQs半抗原。⑵FNQs半抗原与载体蛋白偶联物的合成先称取70mg BSA 溶解于 25mLPBS(0. 05mol/L,pH7. 4)中，再加入 25mL 的二甲基甲酰胺(DMF);然后，称取7. 8mgFNQs半抗原，溶于2mLDMF中，向FNQs半抗原溶液中加入三丁胺6. O μ L，混匀后加入氯甲酸异丁酯3. 8 μ L，于4°C下磁力搅拌25min。磁力搅拌下，将BSA溶液加入到FNQs半抗原溶液中反应，用lmol/L的NaOH调节反应液pH值至9. O。于4°C磁力搅拌下反应4h，将最终反应液用装入透析袋中，在PBS(0.01mol/L，pH7.4)中透析。偶联物冷冻干燥后，_20°C下冻存备用，此为FNQs半抗原-BSA偶联物。(3) FNQs单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的FNQs半抗原-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫I次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫I次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进 行将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按I : 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C，5% CO2培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择lOmg/LFNQs半抗原-BSA包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，oro显色。筛选出的阳性孔再用卵清蛋白偶联物包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X 10_3mol/L氟喹诺酮类药物溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS (O. 01mol/L、pH7. 4)替代氟喹诺酮类药物溶液作对照，其余步骤同上。若氟喹诺酮类药物阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X 105/mL时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株IO7个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1%柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备取已制备好的IOOmL胶体金溶液，用O. lmol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入I. 5mg抗氟喹诺酮类药物单抗,搅拌20min,再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，搅拌 15min。20，OOOrpm 离心 15min,弃上清液，加入 IOmL pH 7. 4PBS 缓冲液(含O. 4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶解,用O. 22 μ m无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。5.氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板的组装参照图1，用点膜机把适当浓度的CIP-BSA偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记氟喹诺酮类药物单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。6.氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法6. I样品制备取400 μ L FQNs专用PBST缓冲液加入洁净的I. 5mL刻度冷冻管中；用滴管吸取3滴(约ΙΟΟμ 原奶加入到刻度冷冻管中，混合均匀；吸取混合溶液待检。6. 2检测步骤从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100 μ L滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3 5min读取，其他时间判读无效。观察时，试剂板水平放置于观察者正面。6. 3结果判读读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。阴性(-):T线显色比C线深或一样深，表示样品中氟喹诺酮类药物残留含量低于检测限或不含氟喹诺酮类药物残留。如图3. a所示。阳性⑴T线线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中氟喹诺酮类药物残留含量等于或高于检测限。如图3. b所示。无效未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。如图3. c所示。
权利要求1.一种检测乳品中氟喹诺酮类药物的免疫胶体金试剂板，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，试剂板背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻各部分间有l-2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。
2.如权利要求I所说的试剂板，其特征在于试剂板的 硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
3.如权利要求I所说的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为30nm。
4.如权利要求I所说的试剂板，其特征在于，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。
专利摘要本实用新型涉及一种检测乳品中氟喹诺酮类药物的免疫胶体金试剂板，试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。本实用新型提供的试剂板可用于检测牛奶中氟喹诺酮类药物残留。本实用新型提供了一种应用试剂板检测牛奶中氟喹诺酮类药物的快速检测方法，整个操作过程只需5min左右，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合工商部门、检验检疫机构、奶站以及乳制品生产加工企业对原料及产品进行大规模快速筛选。
文档编号G01N33/577GK202710557SQ20122034049
公开日2013年1月30日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者李云, 王新, 王振国, 邵伟 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司, 石家庄市畜产品质量监测中心