专利名称：一种实时荧光lamp法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种实时荧光LAMP法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法。
背景技术：
肉类及其制品是人类消费的主要食品之一。肉类能提供人体所需要的蛋白质、月旨肪、无机盐和维生素等，并且含有充足的人体必需氨基酸。肉类营养成分因动物种类、年龄、部位以及肥瘦程度有很大差异。尽管在肉类食品中，由于价格、宗教、健康等原因，许多国家制定法规要求食品标签真实明确地标出肉类来源，禁止掺假行为，以保护消费者的利益，但是市场上混淆肉类品种的现象仍旧非常普遍，主要是价格高的肉类中掺杂低价肉类，如牛肉、羊肉中参杂猪肉、鸭肉等。2013年I月，瑞典、英国和法国部分牛肉制品中发现了马肉，德国也宣布发现疑似此类“挂牛头卖马肉”情况，引发消费者强烈反感，欧盟要求所有成员国对加工牛肉开展脱氧核糖核酸(DNA)抽检，以消除“马肉风波”忧虑，恢复消费者信心。肉类品种的鉴定方法主要有两种，蛋白质鉴定(等电聚焦电泳、酶联免疫吸附试验、色谱等)和分子生物学鉴定(DNA分子杂交、PCR方法等)。蛋白质鉴定技术已成功用于鉴别生鲜肉类的品种，但当食品中的肉类经过切碎、混合、蒸煮、熏烤等加工烹调过程后，失去了原有的形态学特征和质地，加工 处理也会改变肉类蛋白质的结构和稳定性，从而破坏物种特有的蛋白质或抗原决定部位。所以，蛋白质鉴定技术鉴定肉类品种的稳定性和可靠性较差，已不能满足现代肉类安全检测的要求。随着生物技术的发展，以物种间基因差异为基础的分子学鉴定方法成为研究的热点，主要原因是:①DNA比蛋白质的耐热性强，高温处理过的食品中仍能提取出小片段的DNA 分子学鉴定方法不依赖于组织和细胞的类型；③不同的基因片段进化效率不同，可以根据实验目的选择不同的目的基因进行研究；④DNA比蛋白质具有更高的种间多态性，有利于品种鉴定。由于分子生物学鉴定中的DNA杂交法费时、昂贵且复杂，而PCR方法反应时间短，具有较高灵敏性特异性和可鉴别性，已成为肉制品品种鉴别最常用的方法。普通PCR法扩增后需要凝胶电泳进行结果分析，所用染液EB为强致癌物质，且存在非特异性扩增导致的假阳性问题，因此，需要研发一种简单快速、特异性强、安全可靠的检测方法。环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,以下简称LAMP法)是由日本学者Notomi研发的基因诊断技术，该方法针对目的基因的6个区段设计引物，提高了检测的特异性，同时该方法的扩增效率较普通PCR高，很大程度地提升了灵敏度。将该方法与实时荧光技术相结合，可实时监测目的基因扩增情况，无需像普通LAMP —样反应完成后加染液观察结果，避免了开盖导致的气溶胶污染。通过检索发现，目前国内外还没有文献报道利用环介导恒温扩增技术结合实时荧光的方法检测牛肉、羊肉中猪特异性细胞色素b基因，从而肉制品品种的快速鉴别。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种实时荧光LAMP法快速检测牛肉、羊肉中猪源性成分的方法。为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得了如下技术方案:一种实时荧光LAMP法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法，该方法利用环介导恒温扩增技术结合实时荧光的方法检测牛肉、羊肉中猪特异性细胞色素b基因，操作步骤为:(I)待检样品基因组DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA ；(2)配制反应液，构建成检测体系；所述的反应液包括ddH20、引物工作液、荧光指示剂SYBR GREEN 1、Buffer、Bst DNA聚合酶大片段和样品DNA ;所述的引物工作液中包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的内引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3的环引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的外引物，且反应体系中内引物/环引物/外引物浓度为1.2 μ Μ/0.2 μ M/0.2 μ M ;(3)恒温扩增反应:将所述反应液离心混匀，并于60-65°C反应45_60min ;设置阴性对照，样品为灭菌超纯水，其余同所述反应液；(4)扩增反应之后进行酶灭活处理，灭活温度为80°C，时间为5_15min ；(5)结果判断:根据实时荧光图来判断扩增结果。上述的实时荧光LAMP法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法，其中所述的检测体系为25 μ L，其中荧光指示剂SYBR GREEN 10.5 μ L，8U/ μ L Bst DNA聚合酶大片段I μ L。上述的实时荧光LAMP法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法，其中所述的Buffer中含有10mMdNTP、10XThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8: 5: 2。本发明所采用的CTAB法提取纯化样品DNA的方法包括如下步骤:(l)500mg肉组织用液氮研磨成粉，加入880yL细胞裂解液(50mM Tris-HCl,ρΗ8.0),100μ L20% SDS (SDS 终浓度为 2% )，10 μ L蛋白酶K(20mg/mL)，10 μ L RNase (lOmg/mL)；(2)样品55 °C恒温过夜；(3) 12000g离心5min，转移上清至一新离心管中；(4)加入等体积Tris饱和酹混勻轻摇IOmin, 12000g离心IOmin,转移上层水相至
一新离心管中；(5)再加入1/2体积Tris饱和酚萃取一次，12000g离心lOmin，转移上层水相至一
新离心管中；(6)加入等体积氯仿，充分混匀，12000g离心15min，转移上层水相至一新离心管中；(7)重复步骤(6)；(8)加入1/10体积3M醋酸钠(ρΗ5.5)和等体积异丙醇，于_20°C放置1_3小时，12000g离心15min,弃上清；(9)加入500 μ L70%乙醇溶液，缓慢旋转离心管清洗，12000g离心5min，弃上清，
重复一次；
(10)干燥DNA沉淀，加100-200 μ L灭菌超纯水或TE缓冲液(10Μ Tris-HCl, ImMEDTA，ρΗ8.0)溶解。与现有技术相比，本发明具有高灵敏度、高特异性、简单快速、安全可靠等有益效果，具体表现在:(I)高灵敏度:最低检测限可达0.0lng,比普通PCR法高两个数量级；(2)高特异性:本发明针对猪特异性细胞色素b基因的6个区段设计引物，比普通PCR法2个引物，Taqman探针法3个引物的特异性均要高；(3)简单快速:将LAMP法与实时荧光技术相结合，可实时监测扩增结果，整个过程只需 60-80min ；(4)安全可靠:结果不需进行 凝胶电泳，避免使用EB等强致癌染料。
图1:实施例1中普通PCR灵敏度结果(M是50bp Marker, 1-9分别是阴性对照，IOOng,IOng,Ing,0.1ng,0.0lng,0.005ng,0.0Olng,0.0005ng)。图2:实施例1中LAMP反应灵敏度结果(1-9分别是lOOng，10ng，lng，0.lng，
0.01ng，0.005ng，0.001ng，0.0005ng,阴性对照)。图3:实施例2中LAMP反应特异性试验结果(1-4分别是猪DNA，牛DNA，羊DNA，阴性对照)。
具体实施例方式实施例1:普通PCR反应与本发明检测方法灵敏度比较(I)待检样品基因组DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA ；(2)配制反应体系:所述的反应体系中包括:荧光指示剂SYBR GREEN 1:0.5 μ L ;Buffer: 12.5 μ L ；Bst DNA 聚合酶大片段 8U:1 μ L。内引物/环引物/外引物比例为6: I: 1，引物/环引物/外引物浓度为
1.2 μ Μ/0.2 μ Μ/0.2 μ Mo所述引物核苷酸序列为:内引物FIP:5' -TGAAGGCTGTTGCTATAACGGTTTTTCCTATTCATCCACGTAGGC-3'内引物BIP:5' -CCTGCCCTGAGGACAAATATCATTTTCTCAGATTCATTCTACGAGGT C-3/外引物F3:5' -ACGGATGAGTTATTCGCTATC-3'外引物B3:5' -GGTAATGATGAATGGCAGGATA-3'环引物LB:5' -TTCTGAGGAGCTACGGTCA-3'。DNA为分离纯化的猪肉基因组，模板量为lOOng, 10ng, lng, 0.1ng, 0.0lng,0.005ng，0.0Olng, 0.0005ng ；ddH20补充至总体积25 μ L ;
(3)恒温扩增反应:将上述反应体系混匀后离心，并于63°C反应45min ;设置阴性对照，模板为灭菌超纯水，其余同样品体系；(4)扩增反应之后进行酶灭活处理，灭活温度为80°C，时间为IOmin ；(5)结果判断:根据实时荧光图2(横坐标为反应时间min，纵坐标为荧光强度)来判断扩增结果，检测限为0.0lng,比普通PCR(见图1)的检测限高100倍。实施例2:特异性试验(I)待检样品基因组DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA ；(2)配制反应体系:所述的反应体系中包括:荧光指示剂SYBR GREEN 1:0.5 μ L ;Buffer: 12.5 μ L ；Bst DNA 聚合酶大片段 8U:1 μ L ;内引物/环引物/外引物比例为6: I: 1，引物/环引物/外引物浓度为
1.2 μ Μ/0.2 μ Μ/0.2 μ Μ,所述引物核苷酸序列同实施例1。DNA为分离纯化的牛肉、羊肉、猪肉基因组，模板量为IOng ；ddH20补充至总体 积25 μ L ;(3)恒温扩增反应:将上述反应体系混匀后离心，并于63°C反应45min ;设置阴性对照，模板为灭菌超纯水，其余同样品体系；(4)扩增反应之后进行酶灭活处理，灭活温度为80°C，时间为IOmin ；(5)结果判断:根据实时荧光图3(横坐标为反应时间min，纵坐标为荧光强度)来判断扩增结果，仅猪肉基因组有扩增曲线。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
权利要求
1.一种实时荧光LAMP法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法，其特征在于:该方法利用环介导恒温扩增技术结合实时荧光的方法检测牛肉、羊肉中猪特异性细胞色素b基因，操作步骤为: (1)待检样品基因组DNA的提取:采用CTAB法提取纯化样品DNA； (2)配制反应液，构建成检测 体系；所述的反应液包括ddH20、引物工作液、荧光指示剂SYBR GREEN 1、Buffer、Bst DNA 聚合酶大片段和样品 DNA ; 所述的引物工作液中包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的内引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3的环引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的外引物，且反应体系中内引物/环引物/外引物浓度为1.2 μ Μ/0.2 μ M/0.2 μ M ; (3)恒温扩增反应:将所述反应液离心混匀，并于60-65°C反应45-60min;设置阴性对照，样品为灭菌超纯水，其余同所述反应液； (4)扩增反应之后进行酶灭活处理，灭活温度为80°C，时间为5-15min； (5)结果判断:根据实时荧光图来判断扩增结果。
2.根据权利要求1所述的实时荧光LAMP法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法，其特征在于:所述的检测体系为25 μ L，其中荧光指示剂SYBR GREEN 10.5 μ L，8U/ μ LBst DNA聚合酶大片段I μ L0
3.根据权利要求2所述的实时荧光LAMP法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法，其特征在于:所述的Buffer中含有IOmM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8: 5: 2。
全文摘要
本发明公开了一种实时荧光LAMP法快速检测牛羊肉中猪源性成分的方法，该方法采用环介导恒温扩增技术(LAMP)结合实时荧光的方法检测牛肉、羊肉中猪特异性细胞色素b基因。其检测方法是通过提取待检肉类的基因组DNA，采用6条特异性引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶大片段，于60-65℃扩增45-60分钟，反应体系中加入SYBR GREEN I，可实时检测样品模版的扩增情况，从而判断牛肉、羊肉样品中是否含有猪源性成分。本发明具有高灵敏度、高特异性、简单、快速、结果不需要凝胶电泳等优点。
文档编号G01N21/64GK103243165SQ20131017396
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者杨丽霞, 付淑君, 彭新凯, 周明, 刘佩, 曾林, 李乐 申请人:长沙市食品质量安全监督检测中心, 湖南省食品安全生产工程技术研究中心