一种胆酸钠含量的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种胆酸钠含量的测定方法，包括：（1）配制待测胆酸钠溶液；（2）分别配制猪去氧胆酸标准溶液和鹅去氧胆酸标准溶液；（3）用高效液相色谱法测定待测胆酸钠溶液中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量。本发明具有简便易行、结果精准、测定时间短、可推广性强的特点，可以广泛应用于成分检测【技术领域】。
【专利说明】一种胆酸钠含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种成分检测方法，特别是涉及一种胆酸钠含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]胆酸钠是从猪胆汁中提取的胆汁酸盐混合物，临床上是用于治疗胆囊炎、胆汁缺乏等疾患的利胆药。猪胆汁除含大量水分外，主要含有胆盐、胆色素、胆固醇、脂肪酸、卵磷脂以及一些无机盐，而胆盐为各种胆酸与甘氨酸或牛磺酸结合而成的胆汁酸的钾盐或者钠盐形态。经过提取和纯化后，胆酸钠中的主要成分为胆汁酸钠盐，是由甘氨酸和牛磺酸与各种胆酸类的结合胆酸的钠盐等物质组成的混合物。
[0003]《名医别录》记载:胆汁中主要的化学成分为胆汁酸类、胆色素、粘蛋白、脂类及无机物等。胆汁酸中有鹅脱氧胆酸、3 α -羟基-6-氧-5 α -胆烷酸和石胆酸，它们几乎完全与甘氨酸结合而存在。另含猪胆酸和猪去氧胆酸。猪胆性味苦，寒。入肝、胆、肺、大肠经。功效主治清热、润燥、解毒。治热病里热燥渴、便秘，黄疸、百日咳、哮喘、泄泻、痢疾、目赤、喉痹、聍耳、痈肿疔疮。具有镇咳、平喘、消炎、抗过敏、抑菌作用。《随息居饮食谱》记载:补胆、清热、治热痢、通热秘。《纲目》记载:通小便、敷恶疮、杀疳匿、治日赤、目翳、明日、清心脏、凉肝脾。
[0004]近年来，随着我国人民生活水平的提高，进食高热量食品的人数逐渐增多，这使胆囊炎的发病率也明显增加。目前，我国胆囊炎和胆结石的发病率以每年80万新患者的速度增加。终其原因是经常吃一些大鱼大肉、油腻食品、高糖、高胆固醇的东西(比如松花蛋、无鳞鱼等)，这都是含胆固醇比较高的食品，胆汁中胆固醇浓度增加或过饱和状态使胆固醇易于析出并形成结石。所以胆结石症的多发主要还是和生活中饮食不合理有关。这才导致了胆石症发生的上升趋势，从而引起胆囊炎，两者互为因果。发病后，患者一般表现为反复发作的右上腹或心窝部饱胀、疼痛，甚者有胆绞痛，痛引右肩背部，并发感染急性发作时可有恶寒、发热，或寒热往来。平素只感到右肋部胀痛，或心窝部饱胀、嗳气多、厌食、恶心，或见胃脘部灼热，食油腻之物即感上腹部作胀，严重时大便泄泻，以高脂餐后即发作为典型表现。如同时并发有结石者则常有反复发作的胆绞痛病史，给病人带来了及大的痛苦。为了减轻受患者的症状，临床上迫切需要更加方便、更有效的、患者自己能使用的药物，从而使以胆酸钠为主要原料的胆酸钠片成为了治疗胆囊炎的首选药物。
[0005]另外一个以胆酸钠为主要原料的药物复方胆氨片则主要用于支气管炎，支气管哮喘急性发作以及肺气肿及早期肺心病。支气管炎，支气管哮喘急性发作以及肺气肿及早期肺心病在我国是一个发病率很高的疾病。70年代的全国性普查平均患病率就支气管炎4% ；而且年龄愈大，患病率愈高，50岁以上的人可达13%。引起支气管炎发病的原因比较复杂，且常常是多种因素长期相互作用的结果。这些因素包括感染、理化因素、过敏、气候变化等，而吸烟则被国内外一致公认与支气管炎的发病有密切关系，吸烟时间愈长，吸烟量愈多，患病率也愈高。在我国嗜好吸烟且成瘾的人极为普遍，这是导致支气管炎患病率增高的一个主要原因。另外近年由于工业化污染加重，环境中的粉尘和有害气体也使支气管炎的发病率不断上升。
[0006]现有的胆酸钠检测方法，只能大致测定胆酸钠所包含的物质成分，难以将其具体成分和含量量化，因此，急需一种新的测定方法对胆酸钠进行精准测定。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是为了克服上述【背景技术】的不足，提供一种胆酸钠含量的测定方法，使其具有简便易行、结果精准、测定时间短、可推广性强的特点。
[0008]本发明提供的一种胆酸钠含量的测定方法，包括:(1)配制待测胆酸钠溶液；(2)分别配制猪去氧胆酸标准溶液和鹅去氧胆酸标准溶液；(3)用高效液相色谱法测定待测胆酸钠溶液中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量。
[0009]在上述技术方案中，所述步骤(3)中，所述高效液相色谱法步骤如下:以0.125%乙酸为流动相A，乙腈为流动相B，线性梯度洗脱:0?18min，60%A ； 18?22min，60%A — 40%A ；22 ?23min，40%A — 20%A ；23 ?33min，20%A ；33 ?35min，20%A — 60%A ；35 ?40min，60%A ；流速为lml/min ;采集时间40分钟，最后，根据猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的标准样品溶液测得的标准曲线，以胆酸钠样品溶液峰面积的大小来确定胆酸钠样品中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量。
[0010]在上述技术方案中，所述步骤(I)中，配制待测胆酸钠溶液包括如下步骤:(1.0称定待测胆酸钠样品置于烧瓶中，加入氢氧化钠溶液和乙醇加热至沸腾，并通过冷凝管回流至烧瓶中；(1.2)向烧瓶中的回流液滴加硫酸调节PH值，放冷；(1.3)通过分液漏斗用乙酸乙酯振摇提取烧瓶中的回流液并过滤形成乙酸乙酯提取液；(1.4)除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并干燥至恒重；(1.5)将干燥物加甲醇溶解并稀释至容量瓶刻度，将稀释液过滤后再次稀释至容量瓶刻度，得到待检测胆酸钠溶液。
[0011]在上述技术方案中，所述步骤(1.1)中，回流液回流至烧瓶后，用水冲洗冷凝管，过滤，并将洗液置于分液漏斗中，用热水分别洗涤烧瓶和分液漏斗并合并至烧瓶。
[0012]在上述技术方案中，所述步骤(1.1)中，称定待测胆酸钠样品0.5g，加15%氢氧化钠溶液30ml与乙醇5ml，加热回流6小时，用30ml水冲洗冷凝管，过滤，并将洗液置于分液漏斗中，5ml热水洗涤烧瓶和分液漏斗各2次，并将洗液和热水合并至烧瓶。
[0013]在上述技术方案中，所述步骤(1.2)中，向回流液滴加硫酸使其PH值为2?3。
[0014]在上述技术方案中，所述步骤(1.3)中，形成乙酸乙酯提取液后，用水冲洗分液漏斗，用乙酸乙酯振摇提取冲洗液，过滤后与前述乙酸乙酯提取液合并。
[0015]在上述技术方案中，所述步骤(1.3)中，烧瓶中的回流液用乙酸乙酯振摇提取4次，依次为60ml、40ml、40ml、30ml，过滤后合并形成乙酸乙酯提取液，随后用水冲洗分液漏斗2次，每次10ml，用15ml乙酸乙酯振摇提取，过滤后与前述乙酸乙酯提取液合并。
[0016]在上述技术方案中，所述步骤(1.4)中，通过蒸发方式除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并在105°C通过蒸发干燥至恒重。
[0017]在上述技术方案中，所述步骤(1.5)中，用30ml甲醇溶解干燥物，接着用2ml甲醇冲洗，合并至50ml容量瓶，将甲醇稀释至刻度，将稀释液过滤，取50ml容量瓶，再加甲醇稀释至刻度，得到待检测胆酸钠溶液。
[0018]本发明胆酸钠含量的测定方法，具有以下有益效果:不仅简便易行，测定所需时间短，并且能对胆酸钠所含物质进行精确地定量分析，结果非常精准；同时，由于高效液相色谱技术应用非常广泛，技术相对成熟，符合药品含量测定技术发展的趋势，在行业内具有很强的推广性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明胆酸钠含量的测定方法中猪去氧胆酸标准溶液样品I的高效液相的检测色谱图；
[0020]图2为本发明胆酸钠含量的测定方法中猪去氧胆酸标准溶液样品2的高效液相的检测色谱图；
[0021]图3为本发明胆酸钠含量的测定方法中猪去氧胆酸标准溶液样品3的高效液相的检测色谱图；
[0022]图4为本发明胆酸钠含量的测定方法中鹅去氧胆酸标准溶液样品I的高效液相的检测色谱图；
[0023]图5为本发明胆酸钠含量的测定方法中鹅去氧胆酸标准溶液样品2的高效液相的检测色谱图；
[0024]图6为本发明胆酸钠含量的测定方法中鹅去氧胆酸标准溶液样品3的高效液相的检测色谱图；
[0025]图7为待测胆酸钠溶液高效液相的检测色谱图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图及实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应理解为对本发明的限制。
[0027]一种胆酸钠含量的测定方法，包括如下步骤:
[0028](I)配制待测胆酸钠溶液:(1.1)取武汉生物化学制药有限公司生产的胆酸钠0.5g，精密称定并置于烧瓶中，加15%氢氧化钠溶液30ml与乙醇5ml，加热至沸腾后通过冷凝管回流6小时，用30ml水冲洗冷凝管，过滤，并将洗液置于分液漏斗中，用5ml热水洗涤烧瓶与分液漏斗各2次，洗液合并至烧瓶中。
[0029](1.2)向回流液滴加硫酸使pH值为2.7，放冷。
[0030](1.3)烧瓶中的回流液用乙酸乙酯振摇提取4次，依次60ml、40ml、40ml、30ml，过滤后合并形成乙酸乙酯提取液，随后用水冲洗分液漏斗2次，每次10ml，冲洗液用15ml乙酸乙酯振摇提取，过滤后，与前述乙酸乙酯提取液合并。
[0031](1.4)通过蒸发方式除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并在105°C通过蒸发干燥至恒重。
[0032](1.5)加甲醇30ml溶解干燥物，接着用2ml甲醇冲洗，合并至50ml容量瓶，将甲醇稀释至刻度，将稀释液过滤，取50ml容量瓶，再加甲醇稀释至刻度，得到待检测胆酸钠溶液。
[0033](2)分别配制猪去氧胆酸标准溶液和鹅去氧胆酸标准溶液:精密称取购于中国药品生物制品检定所的猪去氧胆酸适量，加甲醇制成每Iml中分别含猪去氧胆酸0.1mg,0.2mg、0.5mg的I--3号猪去氧胆酸溶液样品；精密称取购自中国药品生物制品检定所的鹅去氧胆酸适量，加甲醇制成每Iml中分别含鹅去氧胆酸0.lmg、0.2mg、0.5mg的I?3
号鹅去氧胆酸溶液样品。
[0034](3)用高效液相色谱法测定待测胆酸钠溶液中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量:高效液相色谱(HPLC)仪器采用Waters公司出品的e2695Separat1ns Module,检测器型号为2424ELS Detector,色谱柱型号为C18，以0.125%乙酸为流动相A，乙腈为流动相B，线性梯度洗脱:0 ?18min，60%A ；18 ?22min，60%A — 40%A ；22 ?23min，40%A — 20%A ；23 ?33min, 20%A ；33 ?35min，20%A — 60%A ；35 ?40min，60%A ;流速为 lml/min ;采集时间 40 分钟。
[0035]由于在蒸发光散射检测器下，猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量和HPLC中相应峰面积的对数是成正比的。因此根据猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的标准样品溶液测得的标准曲线，以胆酸钠样品溶液峰面积的大小来确定胆酸钠样品中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量。猪去氧胆酸标准溶液的进样量为10μ 1，通过HPLC仪器测得的色谱图如图1?3所示。鹅去氧胆酸标准溶液的进样量为10 μ 1，通过HPLC仪器测得的色谱图如图4?6所示。
[0036]待测样品进样量为10μ 1，通过HPLC仪器测得的色谱图如7所示，通过与标准样品的保留时间对比，可以找到峰I保留时间为15.647分钟，与标准样品I?3里猪去养胆酸的保留时间15.686分钟、15.584分钟和15.588分钟相近，应该对应猪去氧胆酸。而峰2的保留时间为25.852分钟，与标准样品I?3里鹅去氧胆酸的保留时间25.846分钟、25.847分钟和25.876分钟相近，应该对应鹅去氧胆酸。由于在蒸发光散射的检测条件下，猪去养胆酸和鹅去氧胆酸的含量和HPLC中相应峰面积的对数是成正比的。因此待测样品溶液中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量分别为12.2%和13.4%。
[0037]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
[0038]本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
【权利要求】
1.一种胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:包括: (1)配制待测胆酸钠溶液； (2)分别配制猪去氧胆酸标准溶液和鹅去氧胆酸标准溶液； (3)用高效液相色谱法测定待测胆酸钠溶液中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量。
2.根据权利要求1所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述高效液相色谱法步骤如下:以0.125%乙酸为流动相A，乙腈为流动相B，线性梯度洗脱:0?18min, 60%A ； 18 ?22min，60%A — 40%A ；22 ?23min，40%A — 20%A ；23 ?33min，20%A ；33 ?35min, 20%A — 60%A ；35?40min，60%A ;流速为lml/min ;采集时间40分钟，最后，根据猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的标准样品溶液测得的标准曲线，以胆酸钠样品溶液峰面积的大小来确定胆酸钠样品中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量。
3.根据权利要求1或2所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(1)中，配制待测胆酸钠溶液包括如下步骤: (1.1)称定待测胆酸钠样品置于烧瓶中，加入氢氧化钠溶液和乙醇加热至沸腾，并通过冷凝管回流至烧瓶中； (1.2)向烧瓶中的回流液滴加硫酸调节PH值，放冷； (1.3)通过分液漏斗用乙酸乙酯振摇提取烧瓶中的回流液并过滤形成乙酸乙酯提取液； (1.4)除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并干燥至恒重； (1.5)将干燥物加甲醇溶解并稀释至容量瓶刻度，将稀释液过滤后再次稀释至容量瓶刻度，得到待检测胆酸钠溶液。
4.根据权利要求3所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(1.1)中，回流液回流至烧瓶后，用水冲洗冷凝管，过滤，并将洗液置于分液漏斗中，用热水分别洗涤烧瓶和分液漏斗并合并至烧瓶。
5.根据权利要求4所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(1.1)中，称定待测胆酸钠样品0.5g，加15%氢氧化钠溶液30ml与乙醇5ml，加热回流6小时，用30ml水冲洗冷凝管，过滤，并将洗液置于分液漏斗中，5ml热水洗涤烧瓶和分液漏斗各2次，并将洗液和热水合并至烧瓶。
6.根据权利要求3所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(1.2)中，向回流液滴加硫酸使其PH值为2?3。
7.根据权利要求3所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(1.3)中，形成乙酸乙酯提取液后，用水冲洗分液漏斗，用乙酸乙酯振摇提取冲洗液，过滤后与前述乙酸乙酯提取液合并。
8.根据权利要求7所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(1.3)中，烧瓶中的回流液用乙酸乙酯振摇提取4次,依次为60ml、40ml、40ml、30ml,过滤后合并形成乙酸乙酯提取液，随后用水冲洗分液漏斗2次，每次10ml，用15ml乙酸乙酯振摇提取，过滤后与前述乙酸乙酯提取液合并。
9.根据权利要求3所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(1.4)中，通过蒸发方式除去乙酸乙酯提取液中的乙酸乙酯，并在105°C通过蒸发干燥至恒重。
10.根据权利要求3所述的胆酸钠含量的测定方法，其特征在于:所述步骤(1.5)中，用30ml甲醇溶解干燥物，接着用2ml甲醇冲洗，合并至50ml容量瓶，将甲醇稀释至刻度，将稀释液过滤，取50ml容量瓶，再加甲醇稀释至刻度，得到待检测胆酸钠溶液。
【文档编号】G01N30/02GK104458930SQ201310441950
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】邵群梅, 胡文杰, 孙强 申请人:武汉生物化学制药有限公司