一种用于天然蛋白分子分离鉴定的梯度电泳方法
【专利摘要】一种用于天然蛋白分子分离鉴定的梯度电泳方法，包括配置梯度胶、制备凝胶板、上样、电泳、凝胶经染色、脱色及成像等步骤，本发明建立的Native-Gradient-PAGE蛋白电泳法，具有如下优点：所需试剂都是常规试剂，且使用常规SDS-PAGE电泳仪器就可以进行操作；电泳分离效果明显，灵敏度高，电泳结束后，不同蛋白分子因泳动速率不同，颗粒尺寸大小不一，则处于不同的泳道位置；通过此蛋白电泳，易于将天然蛋白各组分分离。
【专利说明】—种用于天然蛋白分子分离鉴定的梯度电泳方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种通过电泳分离天然蛋白中不同分子量相差较小的方法。
【背景技术】
[0002]天然蛋白质是生物体内一种极重要的高分子有机物，主要有氨基酸组成，因氨基酸的组合排列不同，导致蛋白质种类繁多，性质、功能各异。因此，对不同功能特性的蛋白质进行分离鉴定，可以有选择的加以利用，这在医学、食品行业中的应用开发研究中具有深远的意义。
[0003]现有的天然蛋白分离的方法有色谱技术和电泳技术。色谱技术主要有离子交换色谱、分子排阻色谱、反相色谱、疏水作用色谱等方法，色谱技术主要根据蛋白分子的理化特性来实现分离效果的。电泳技术是Native-PAGE和非还原性Native-PAGE。电泳技术中，由于分离蛋白分子有不同的形状、尺寸及所带电荷，根据它们的电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，在保持天然状态条件下达到分离的目的。但是，这些方法只对于被分离蛋白质分子的等电点、分子量大小差异较大的灵敏度高，而对于等电点、分子量大小相近等复杂的蛋白样品的分离不适合，分辨率不高。另外，这些方法都有成本高、耗时长、污染环境等缺点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提出一种用于天然蛋白分子分离鉴定的梯度电泳方法。
[0005]本发明是通过以 下步骤来实现。
[0006]( I)配置梯度胶、堆积胶及缓冲液。
[0007]a) 8^15%梯度胶溶液:40%的储液，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺(Acr):N, N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)= 29:1，1.5M的pH=8.8的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸以及10%的过硫酸铵(AP)、超纯水、四甲基乙二胺(TEMED)。
[0008]b)堆积胶溶液:40%的储液，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺(Acr):N, N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) =29:1,0.5M的pH=6.8的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸(HCl)以及10%的过硫酸铵(AP)、超纯水、四甲基乙二胺(TEMED)。
[0009]c)上样缓冲液:0.5M的pH=6.8的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸、0.5%的3，3，，5，5，-四溴苯酚磺酰酞(BPB)、丙三醇、超纯水。
[0010]d)电极缓冲液:0.025M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.192M的甘氨酸(Gly)。
[0011](2)上样:采用凝胶电泳系统，凝胶板长度为74mm。样品与等体积2X的上样缓冲液混合均匀，离心lmin。取10 μ I加入上样孔中。
[0012](3)电泳:电泳条件堆积胶为电压60 V，时间30分钟；梯度胶为电压80V，时间120分钟；电泳时采用常规方法冷却，电泳温度控制在15°C以下。
[0013](4)混合物中不同组分蛋白质分离的判定:电泳后凝胶经染色，脱色后成像，分析蛋白分离情况。经参考纯蛋白的对照，根据每个泳道里的分离的条带，分别判定混合物中不同组分的蛋白，也可通过Quality One软件定量出不同组分蛋白的纯度。
[0014]本发明建立了 一种天然蛋白分离鉴定的电泳方法，即Native-Gradient-PAGE蛋白电泳法，实现相近的分子量和等电点的天然蛋白分子的分离，在Native-PAGE中不能很好的分离蛋白混合物，利用本发明可以高分辨率的分离各种组分。
[0015]本发明所述的Native-Gradient-PAGE蛋白电泳法是基于Native-PAGE电泳，但是，Native-PAGE电泳只有一种浓度的分离胶，而Native-Gradient-PAGE是配制不同浓度梯度的分离胶，因此在凝胶中可以形成不同尺寸大小的网状结构，根据分离蛋白本身的尺寸、形状及所带电荷量达到高分辨率的分离效果。
[0016]本发明使用常规的蛋白电泳系统，凝胶中不含有巯基乙醇，确保混合物各蛋白组分的天然状态；另外，整个电泳都不能加SDS，因为SDS带大量的负电荷，会影响天然蛋白带电荷量；并通过控制蛋白泳动速率、电泳的时间及电压等因素，将蛋白混合物的各种天然蛋白分子进行分离。
[0017]本发明建立的Native-Gradient-PAGE蛋白电泳法,具有如下优点:所需试剂都是常规试剂，且使用常规SDS-PAGE电泳仪器就可以进行操作；电泳分离效果明显，灵敏度高，电泳结束后，不同蛋白分子因泳动速率不同，颗粒尺寸大小不一，则处于不同的泳道位置；通过此蛋白电泳，还可以分析出天然蛋白各组分的纯度。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]附图1为本发明Native-Gradient-PAGE电泳分析β _乳球蛋白中的两个亚型β -1g-A和β _lg_B。泳道1:标准蛋白β -1g-A,泳道2:标准蛋白β -1g-B,泳道3: β -乳球蛋白混合样，每孔上样量均为1.5μ g。
[0019]附图2为本发明Native-Gradient-PAGE电泳分析牛乳酪蛋白中主要两种蛋白形态a S-酪蛋白(a s-casein)、β -酪蛋白(β -casein)。泳道I ;Marker标准蛋白，泳道2 ；酪蛋白全蛋白，泳道3 ;酪蛋白全蛋白，每孔上样量均为15 μ g。
【具体实施方式】
[0020]本发明通过以下实施例作进一步说明，但本发明并不受其限制。
[0021]实施例1。
[0022]β -乳球蛋白A ( β -1g-A)和β -乳球蛋白B ( β -1g-B)的分离。
[0023]采用Native-Gradient-PAGE蛋白电泳分离β_乳球蛋白突变体A ( β _lg_A)和β-乳球蛋白突变体B ( β-1g-B), β-1g-A的分子量约为18.3KDa，等电点(pi)为5.26，β-1g-B的分子量约为18.2 KDa，等电点(pi)为5.34。由于在电泳体系里，β-lg-A所带负电荷量多，泳动速率大，则β _ Ig-A是下面的一条带,上面的一条带则是β-1g-B。利用Quality One软件分析其不同突变体的纯度为β-1g-A为62.5%，β-1g-B为37.5%。
[0024]具体实施过程包括如下步骤。
[0025]1、配置凝胶及缓冲液。
[0026]8?15%梯度胶溶液中，含有40%的丙烯酰胺(Acr:Bis = 29:1),1.5M的Tris-盐酸(pH8.8)以及10%AP、超纯水、纯TEMED ;堆积胶溶液中含40%的丙烯酰胺(Acr:Bis =29:1)，0.5M 的 Tris-盐酸(pH6.8)、10%AP、超纯水及纯 TEMED。
[0027]蛋白溶液与上样缓冲液等体积混合，上样缓冲液中含0.5M的Tris-盐酸(pH6.8)、
0.5%的BPB、丙三醇、超纯水。
[0028]电极缓冲液中含0.025M Tris、0.192M甘氨酸。
[0029]2、上样及电泳:采用 Electrophoresis Power Supply (EPS 601)凝胶电泳系统，凝胶板厚度为74_。样品与等体积2X的样品缓冲液混合后离心lmin，加入上样孔中。电泳条件分两步设置，第一步电压60 V，时间0.5h ;第二步电压80V，时间2h。总计电泳时间2.5h。电泳时配备循环冷却水，将电泳温度控制在15°C以下。
[0030]3、蛋白质的分离及纯度分析。
[0031]电泳结束后,将凝胶放在培养皿中,加入染色液,摇床振荡染色15min，然后用脱色液脱色至蛋白质区条带清晰为止。最后将凝胶置于凝胶成像系统中成像，根据电泳图分析电泳结果。通过Quality One软件定量出两个亚型的纯度。
泳道1-3的电泳图片如附图所不。由图中可以看出，β-1g-A和β-1g-B泳动速率不同，β -1g-A比β -1g-B的泳动速率快,泳道3清晰地出现两个条带。根据β -乳球蛋白的A和B两个异构体标准品的停留的位置，可说明该方法可有效分离出天然蛋白样品中两个异构体。
[0032]实施例2。
[0033]牛乳酪蛋白(casein)的分离。
[0034]牛乳中酪蛋白(casein)不是单一的蛋白质，有许多类型蛋白构成，但目前主要分为as-、β-、κ-三种类型，每类又有多种遗传变异体。其中as-、β-含量最大，a S-中a Sl-，a S2-两种酪蛋白形态属于钙敏感蛋白，易形成聚合物，一般情况分子量范围是29-33KDa ； β -酪蛋白(β -casein)成分性质相对稳定,低温下，常以单体存在，分子量24.0KDa0故如图中所示，A图SDS-PAGE中泳道I是标准蛋白Marker，依据分子量的范围，可判定泳道2两条纯度高的蛋白分别是a s-casein、β-casein ;参照A图，在B图Na'ive-Gradient-PAGE泳道3中可清楚地看到a s-casein、β -casein在梯度分离胶中停留位置相距很远，因此也就可以清晰地辨别α s-casein、β -casein,。因此，通过该方法可以高分辨率地鉴定a s-casein、β-casein。
[0035]具体实施过程包括如下步骤。
[0036]1、配置凝胶及缓冲液。
[0037]8?15%梯度胶溶液中，含有40%的丙烯酰胺(Acr:Bis = 29:1),1.5M的Tris-盐酸(PH8.8)以及10%过硫酸铵、超纯水、纯TEMED ;堆积胶溶液中含40%的丙烯酰胺(Acr:Bis =29:1),0.5M的Tris-盐酸(pH6.8)、10%过硫酸铵、超纯水及纯TEMED。
[0038]蛋白溶液与上样缓冲液等体积混合，上样缓冲液中含0.5M的Tris-盐酸(pH6.8)、
0.5%的BPB、丙三醇、超纯水。
[0039]电极缓冲液中含0.025M Tris、0.192M甘氨酸。
[0040]2、上样及电泳:采用 Electrophoresis Power Supply (EPS 601)凝胶电泳系统，凝胶板厚度为74_。样品与等体积2X的样品缓冲液混合后离心lmin，加入上样孔中。电泳条件分两步设置，第一步电压60 V，时间0.5h ;第二步电压80V，时间2h。总计电泳时间2.5h。电泳时配备循环冷却水，将电泳温度控制在15°C以下。[0041]3、蛋白质的分离
电泳结束后,将凝胶放在培养皿中,加入染色液,摇床振荡染色15min，然后用脱色液脱色至蛋白质区条带清晰为止。最后将凝胶置于凝胶成像系统中成像，根据电泳图分析电泳结果。
【权利要求】
1.一种用于天然蛋白分子分离鉴定的梯度电泳方法，其特征是按以下步骤: (1)配置梯度胶、堆积胶及缓冲液: a)8?15%梯度胶溶液:40%的储液，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺:N，N-甲叉双丙烯酰胺=.29:1，1.5M的pH=8.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸以及10%的过硫酸铵、超纯水、四甲基乙二胺； b)堆积胶溶液:40%的储液，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺:N，N-甲叉双丙烯酰胺=29:1，.0.5M的pH=6.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸以及10%的过硫酸铵、超纯水、四甲基乙二胺； c)上样缓冲液:0.5M的pH=6.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、0.5%的3，3’，5，5’ -四溴苯酚磺酰酞、丙三醇、超纯水； d)电极缓冲液:0.025M三羟甲基氨基甲烷、0.192M的甘氨酸； (2)上样:采用凝胶电泳系统，凝胶板长度为74mm;样品与等体积2X的上样缓冲液混合均匀，离心Imin ;取10μ I加入上样孔中； (3)电泳:电泳条件堆积胶为电压60V，时间30分钟；梯度胶为电压80V，时间120分钟；电泳时采用常规方法冷却，电泳温度控制在15°C以下； (4)混合物中不同组分蛋白质分离的判定:电泳后凝胶经染色，脱色后成像，分析蛋白分离情况；经参考纯蛋白的对照，根据每个泳道里的分离的条带，分别判定混合物中不同组分的蛋白，并通过Quality One软件定量出不同组分蛋白的纯度。
【文档编号】G01N27/447GK103675072SQ201310613929
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】李欣, 陈红兵, 周建文, 高金燕, 谢秀玲, 吴志华, 杨安树, 佟平 申请人:南昌大学