高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法，其测定步骤为：（1）γ-氨基丁酸的提取：将称取的红曲样品加到水中，超声提取，离心收集上清液；（2）醇沉：在上清液中加入乙醇和盐溶液进行醇沉处理，离心收集醇沉上清液；（3）酶处理：醇沉上清液脱除溶剂，然后加入复合酶制剂进行酶处理；（4）脱色素处理：将酶处理后的浓缩液上柱吸附，树脂吸附、氨水洗脱；洗脱液用微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；（5）所述待检测液经柱前衍生化处理，即可采用液相色谱法测定。本方法采用醇沉、酶处理、脱色素处理，有效去除γ-氨基丁酸中的杂质含量，降低检测过程中的干扰，有效的提升检测准确性，检测结果可靠稳定。
【专利说明】高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种红曲成分的测定方法，尤其是一种高效液相色谱法测定红曲中Y -氨基丁酸含量的方法。
【背景技术】
[0002]Y -氨基丁酸(Y-aminobuyric acid, GABA)是广泛存在于动植物体内的一种具有生理活性的非蛋白质氨基酸，具有调节心血管活动和心律失常以及营养神经细胞等多种生理功能。随着研究的深入，GABA已经发展成为一种新型的功能性因子，并逐渐应用于医药、食品和饲料工业中。红曲菌(Monascus sp.)是我国传统的食品发酵微生物，能产生丰富的酶类、色素以及多种生理活性物质，在食品着色、酿造、医疗保健等方面得到较广泛应用。动物和临床试验表明，红曲菌的发酵产物红曲具有很强的降血压作用，GABA被认为是其降压的主要成分。
[0003]目前常用的GABA检测方法有薄层色谱、纸层析法、比色法、氨基酸分析仪测定、毛细管电泳-电化学检测、高效液相色谱法。各种方法均有其优缺点，其中薄层层析方法灵敏度高、检测方便，但是检测耗时比较长；纸电泳法成本较低，无需昂贵的试剂以及仪器，缺点是需要控制温度、PH以及滤纸本身性质等的影响，操作过程繁琐；纸层析法简单有效费用低廉，缺点是精密度不高，检测时间较长；氨基酸分析仪检测准确、简便省时、稳定性好，缺点是设备昂贵、对样品的纯度要求很高，测定条件需要严格控制；毛细管电泳法灵敏度高、成本低、试剂用量少，但是操作过程过于复杂；高效液相色谱法精确度和灵敏度均很高，可满足大部分科研和生产过程中检测的需要。
[0004]高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography, HPLC)检测 GABA需要使用衍生化试剂处理，所使用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛(0PA)、2，4-二硝基氟苯(FDNB)、异硫氰酸苯酯(PITC)以及6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)等，其中使用OPA衍生GABA，操作简单，反应迅速抗干扰能力强，且毒性较小，是比较理想的衍生化试剂。但由于红曲产品中成分复杂、杂质较多，干扰检测效果的因素较多，因造成检测结果准确性较低、偏差较大，不太稳定可靠。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种可有效减少杂质对检测的干扰，增加检测准确性的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采取的测定步骤为:(1) Y-氨基丁酸的提取:将称取的红曲样品加到水中，超声提取，离心分离收集上清液；
(2)醇沉:在上清液中加入乙醇和无机盐溶液进行醇沉处理，离心分离得到醇沉上清
液；
(3)酶处理:醇沉上清液脱除溶剂，然后加入复合酶制剂进行酶处理；
(4)脱色素处理:将酶处理后的浓缩液上柱吸附，树脂吸附、氨水洗脱；洗脱液用微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；
(5)所述待检测液经柱前衍生化处理，即可采用液相色谱法测定。
[0007]本发明所述步骤(1)中，红曲样品加到10~30倍体积超纯水中，超声提取I~4h ；所述提取和分离步骤重复2~5次，合并上清液。
[0008]本发明所述步骤(2)中，上清液加入I~2倍体积的乙醇和1/5~1/10体积的5wt%~10wt%无机盐溶液，在-10°C~4°C静置处理10~30min。所述无机盐为醋酸钾、醋酸铵或硫酸铵。
[0009]本发明所述步骤(3)中，复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物；酶处理温度为25~55°C，pH为3.5~9.0，静置处理30~60min。
[0010]本发明所述步骤(4)中，层析柱的柱床高为15~20cm，采用0.2~2mol/L的氨水洗脱。
[0011]本发明所述步骤(5)中，采用邻苯二甲醛和β-巯基乙醇为衍生化试剂进行柱前衍生。所述待检测液中加入I~8倍体积衍生化试剂，避光混合I~5min进行衍生，然后微孔滤膜过滤。
[0012]本发明所述步骤(5)中液相色谱法的测定步骤为:首先采用液相色谱检测一系列具有梯度浓度的Y-氨基丁酸标准溶液，绘制峰面积-浓度标准曲线；再将经柱前衍生化处理的检测液用液相色谱检测，根据峰面积-浓度标准曲线，即可得到红曲样品的Y-氨基丁
酸含量。
[0013]所述液相色谱法的测定条件为:色谱柱为反相C18柱；检测波长为338nm ;色谱柱温度为室温；流动相A和流动相B`按比例混合均匀，其中流动相A所占比例为30~70%，使用前经微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；流动相流速为0.5~1.5mL/min ;进样量10~20 μ I。
[0014]采用上述技术方案所产生的有益效果在于:本发明采用醇沉、酶处理、脱色素处理，有效的去除从红曲所提取的Y-氨基丁酸中的杂质含量，降低检测过程中的干扰，有效的提升检测准确性，检测结果可靠稳定。
[0015]本发明使用高效液相色谱、柱前衍生化法检测红曲产品中的Y-氨基丁酸，该方法操作简单，省时省力，使用的试剂毒性较小，衍生化之前使用的纯化方法回收率高，杂质干扰小，同时也可以减少样品对色谱柱的损伤，延长液相色谱柱的适用寿命。
[0016]本发明检测红曲中的Y-氨基丁酸，线性范围在10-3~2mg/mL之间，检出限为
0.01mg/mL,回收率大于90%,相对标准偏差小于5%。本发明提供了一种可靠稳定的检测红曲中降血压成分的检测方法，可以满足一般生产和科研的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0018]图1是本发明中Y -氨基丁酸标准样品高效液相色谱图；
图2是本发明样品中的Y-氨基丁酸高效液相色谱图；
图3是本发明中Y-氨基丁酸标准曲线图。
【具体实施方式】[0019]实施例1:本高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法采用下述原料、仪器和工艺步骤。
[0020]一、实验仪器与试剂如下
I)仪器:安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦)；色谱柱为Diamonsil C18 250 x
4.6 mm, 5 μ m (迪马科技);针筒式微孔滤膜；0.22 μ m有机系滤膜；旋转蒸发仪(上海申科)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；高速离心机(湘仪集团)；超声仪。
[0021]2)实验试剂:Y-氨基丁酸标准品、甲醇、乙腈、甲酸、四氢呋喃、超纯水。
[0022]二、实验如下:
I)使用Y -氨基定酸标准品实验并确定最佳的色谱条件。
[0023]2)用已经确定的方法检测待测样品，确定其中是否含有Y-氨基丁酸。
[0024]3)向待测样品中添加Y-氨基丁酸标准品，测定方法的回收率、精密度以及检出限。
[0025]三、具体实验方法:
(一)样品处理:
(1)红曲样品中Y-氨基丁酸的提取:准确称取样品红曲2.0g，放于50mL离心管中；按照1:20的质量体积比加入超纯水40ml,超声提取60分钟，8000rmp离心IOmin,收集上清液；重复上述步骤2次，将上清液合并；加入2倍上清液体积无水乙醇和1/8上清液体积的10wt%醋酸铵溶液，-1(TC沉淀30min ；
(2)8000rmp离心IOmin,弃`去沉淀,常温减压浓缩脱去溶剂,然后加入复合酶制剂,调节pH=5.0，常温处理60min ;所述复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物；
(3)脱色素处理:将树脂装入1.6X30cm层析柱，柱床高20cm，将浓缩液上柱吸附，用2mol/L的氨水洗脱，洗脱液用孔径0.22 μ m的微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；
(4)取400μ L样品中加入2倍体积衍生化试剂，避光混合Imin ;微孔滤膜过滤后检测。
[0026](二)、所使用的试剂的配制:
(1)0.05mol/L (19.07g/L)硼酸溶液:取硼砂1.907g溶于100ml超纯水。
[0027](2) 0.2mol/L NaOH 溶液:取 0.8gNaOH 溶于 100ml 超纯水。
[0028](3) 0.4mol/L 硼酸缓冲液(pH 9.6):取 0.05mol/L 硼酸溶液 25ml, 0.2mol/L NaOH溶液11.5ml，定溶至100ml，调节ρΗ=10.4。
[0029](4)衍生化试剂配制:将OPA (邻苯二甲醒)50mg, β -MCE (β_巯基乙醇)40 μ L溶于5.0ml甲醇中，加入0.4mol/L硼酸缓冲液(pH=9.6) 10ml。
[0030](5)流动相A:10ml冰醋酸，15g醋酸钠，50ml四氢呋喃，超纯水定容至1000ml，调节pH至4.7。
[0031](6)流动相B:乙腈。
[0032](三)、液相色谱条件:
所用的仪器为安捷伦1260 ；
色谱柱为 Diamonsil C18 250 x 4.6 mm, 5 μ m ；
检测波长:338nm ；
色谱柱温度为室温；流动相A:流动相B=1: 1，使用前经0.22 μ m微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；
流动相流速为1.0mL/min ；
进样量20 μ I。
[0033](四)、实验结果:
I)标准曲线绘制:
用超纯水配制 0.001mg/mL>0.01mg/mL、0.05mg/mL>0.1 mg/mL、0.5mg/mL> 1.0mg/mL、
1.5mg/mL、2.0mg/mL>3.0mg/mL的Y -氨基丁酸标准溶液,在上述液相色谱条件下检测，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线；Y-氨基丁酸标准样品高效液相色谱图如图1所示，标准曲线如图3所示；
根据其保留时间对应的峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程:y=15590893.2165χ-131880.5121，R2=0.9999，Y -氨基丁酸在 0.0Ol ~3.0mg/mL 范围内呈线性。
[0034]2)检测结果:上述红曲中提取的待检测液在上述液相色谱条件下检测，红曲样品中Y-氨基丁酸高效液相色谱图如图2所示，根据线性方程即可得到红曲样品中Y-氨基丁酸含量；检测结果见表1。
[0035]表1:红曲样品中Y-氨基丁酸含量
【权利要求】
1.一种高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于，其测定步骤为:(1) Y-氨基丁酸的提取:将称取的红曲样品加到水中，超声提取，离心分离收集上清液； (2)醇沉:在上清液中加入乙醇和无机盐溶液进行醇沉处理，离心分离得到醇沉上清液； (3)酶处理:醇沉上清液脱除溶剂，然后加入复合酶制剂进行酶处理； (4)脱色素处理:将酶处理后的浓缩液上柱吸附，树脂吸附、氨水洗脱；洗脱液用微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液； (5)所述待检测液经柱前衍生化处理，即可采用液相色谱法测定。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:所述步骤(I)中，红曲样品加到10?30倍体积超纯水中，超声提取I?4h ;所述提取和分离步骤重复2?5次，合并上清液。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，上清液加入I?2倍体积的乙醇和1/5?1/10体积的5wt%?10wt%无机盐溶液，在-10°C?4°C静置处理10?30min。
4.根据权利要求3所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:所述无机盐为醋酸钾、醋酸铵或硫酸铵。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物；酶处理温度为25?55°C，pH为3.5?9.0，静置处理30?60min。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:所述步骤(4)中,层析柱的柱床高为15?20cm,采用0.2?2mol/L的氨水洗脱。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:所述步骤(5)中，采用邻苯二甲醛和巯基乙醇为衍生化试剂进行柱前衍生。
8.根据权利要求7所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于:所述待检测液中加入I?8倍体积衍生化试剂，避光混合I?5min进行衍生，然后微孔滤膜过滤。
9.根据权利要求1一 8任意一项所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于，所述步骤(5)中液相色谱法的测定步骤为:首先采用液相色谱检测一系列具有梯度浓度的Y-氨基丁酸标准溶液，绘制峰面积-浓度标准曲线；再将经柱前衍生化处理的检测液用液相色谱检测，根据峰面积-浓度标准曲线，即可得到红曲样品的Y -氨基丁酸含量。
10.根据权利要求9所述的高效液相色谱法测定红曲中Y-氨基丁酸含量的方法，其特征在于，所述液相色谱法的测定条件为:色谱柱为反相C18柱；检测波长为338nm ;色谱柱温度为室温；流动相A和流动相B按比例混合均匀，其中流动相A所占比例为30?70%，使用前经微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；流动相流速为0.5?1.5mL/min ;进样量10?20μ l。
【文档编号】G01N30/88GK103713077SQ201310730192
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】王轩, 武亚明, 李静静 申请人:晨光生物科技集团股份有限公司