抗FcRn抗体的制作方法

抗FcRn抗体的制作方法
【专利摘要】本公开内容涉及特异于FcRn的抗体、包含所述抗体的制剂、所述抗体和制剂用于治疗的用途、用于表达和任选地配制所述抗体的方法、编码所述抗体的DNA和包含所述DNA的宿主。
【专利说明】抗FcRn抗体
[0001] 本公开内容涉及特异于FcRn的抗体、包含所述抗体的制剂、所述抗体和制剂在治 疗中的用途、用于表达和任选地配制所述抗体的方法、编码所述抗体的DNA和包含所述DNA 的宿主。
[0002]FcRn是膜蛋白FcRnα链和β2微球蛋白（β2M)的非共价复合物。在成年哺乳动 物中，FcRn通过作为结合和再利用IgG同种型抗体的受体而在维持血清抗体水平中起着关 键性的作用。IgG分子被内皮细胞吞噬，而如果它们与FcRn结合，则被转胞吞至例如循环系 统而再利用。相反，不与FcRn结合的IgG分子进入细胞并被靶向至溶酶体途径，在那里它 们被降解。其中His435被突变成丙氨酸的变体IgGl导致FcRn结合的选择性丢失和显著 减小的血清半衰期（Firan等人，2001，InternationalImmunology13:993)。
[0003] 假设FcRn是用于某些至少部分由自身抗体导致的自身免疫性疾病的潜在治疗 靶。目前用于某些这样的病症的治疗包括血浆去除术。有时将血浆去除术与免疫抑制疗法 一起使用以长期处理疾病。血浆交换为除去有害的自身抗体提供了最快的短期解决方案。 然而，仍然期望抑制免疫系统的自身抗体产生，例如通过使用药物例如泼尼松、环磷酰胺、 环孢菌素、吗替麦考酚酯、利妥昔单抗或其混合物。
[0004] 可用血浆去除术治疗的疾病的实例包括：格-巴二氏综合征；慢性炎症性脱髓 鞘性多发性神经病；肺出血肾炎综合征；高粘稠度综合征；冷球蛋白血症；副蛋白血症； WaMenstrdm巨球蛋白血症；重症肌无力；血栓性血小板减少性紫癜（TTP)/溶血性尿 毒症综合征；韦格纳氏肉芽肿；朗-伊二氏综合征；抗磷脂抗体综合征（APS或APLS);显微 镜下多血管炎；移植的肾中复发性的局灶性和节段性肾小球硬化症；HELLP综合征；PANDAS 综合征；雷夫叙姆病；贝赫切特综合征；HIV相关神经病；婴儿和新生儿中的格雷夫斯病； 寻常天疱疮；多发性硬化；横纹肌溶解和同种免疫疾病。
[0005] 血浆去除术有时作为救援疗法用于含Fc治疗剂的去除，例如在紧急情况下用以 减少严重副作用。
[0006] 尽管血浆去除术在某些医疗条件下是有用的，但是存在与治疗相关的潜在风险和 并发症。相当大的静脉内导管的插入可导致出血、肺穿孔（取决于导管插入的位置），并且 如果导管留置太久，其可导致感染和/或静脉损伤从而为重复该程序提供有限的机会。
[0007] 该程序还具有与其相关的并发症，例如当患者的血液在体外经过血浆去除术仪器 时，血液具有凝块的趋向。为了减小该趋向，在一个通用的方案中，在血液流经回路时注入 柠檬酸盐。柠檬酸盐与血液中的钙结合，而钙对于血液凝结是必需的。柠檬酸盐在防止血 液凝结上非常有效；然而，其使用可导致威胁生命的低钙水平。这可通过使用沃斯特克征或 特鲁索氏征来检测。为了预防该并发症，在患者经历血浆去除术时将钙静脉内注入；此外， 还可提供经口的钙补充。
[0008] 该程序的其它并发症包括：低血压；潜在的暴露于血液制品；具有输血反应或输 血传播疾病的风险；患者免疫系统的抑制和来自针头位直的出血或血肿。
[0009] 此外，提供血浆去除术的设备有限并且该程序非常昂贵。
[0010] 可替代血浆去除术的是静脉滴注免疫球蛋白（IVIG)，其为包含从超过一千名血液 供体的血浆提取的汇合的多克隆IgG的血液制品。治疗是静脉内施用的并且持续2周至3 个月。
[0011]IVIG治疗的并发症包括头痛、皮炎、来自治疗产品的污染的病毒感染例如HIV或 肝炎、肺水肿、过敏反应、急性肾衰竭、静脉血栓形成和无菌性脑膜炎。
[0012] 因此，对于具有较低侵袭性并且使患者暴露于较少的医学并发症的用于自身免疫 性疾病的疗法，存在重要的未满足的需求。
[0013] 因此，对于具有较低侵袭性并且使患者暴露于较少的医学并发症的用于免疫疾病 和/或自身免疫性疾病的疗法，存在重要的未满足的需求。
[0014] 因此，阻断或减少IgG与FcRn的结合的试剂可用于这样的自身免疫性和炎症性疾 病的治疗或预防。此前已在W02009/131702、W02007/087289和W02006/118772中描述了 抗-FcRn抗体。
[0015] 然而，仍然存在对改进的抗-FcRn抗体的需求。
[0016] 发明概述
[0017]因此在一个方面，提供了抗-FcRn抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段包 含具有可变区的重链或重链片段，其中所述可变区包含独立地选自SEQIDN0:1、SEQID NO: 2和SEQIDNO: 3的一个、两个或三个CDR，例如其中CDRHl是SEQIDNO: 1，CDRH2是 SEQIDNO:2 以及CDRH3 是SEQIDNO:3。
[0018] 在另一个方面，提供了包含如上文定义的序列或序列的组合例如同源配对可变区 的抗体或片段。
[0019] 本公开内容的抗体阻断IgG与FcRn的结合，并被认为可用于减弱FcRn的一个或 多个生物学功能，包括减小循环抗体的半衰期。这可以是有利的，因为其使得患者更快速地 清除抗体例如自身抗体。
[0020] 重要地，本发明的抗体能够在pH6和pH7. 4下以相当的和高的结合亲和力结合人 FcRn。因此有利地，即使在内涵体内抗体也能够持续结合FcRn，从而最大化地阻断FcRn与 IgG的结合，参见图10对机制的举例说明。
[0021] 在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或结合片段包含具有可变区的轻链或 轻链片段，所述可变区例如包含独立地选自SEQIDN0:4、SEQIDN0:5和SEQIDN0:6的一 个、两个或三个⑶R，特别地其中⑶RLI是SEQIDNO:4,⑶RL2是SEQIDNO:5以及⑶R L3 是SEQIDNO:6。
[0022] 在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或结合片段包含SEQIDN0:1至6 的CDR序列，例如其中CDRHl是SEQIDNO: 1，CDRH2 是SEQIDNO: 2,CDRH3 是SEQID NO:3,CDRLl是SEQIDNO:4,CDRL2 是SEQIDNO:5 以及CDRL3 是SEQIDNO:6。
[0023] 本公开内容还扩展至编码如本文中公开的抗体或片段的多核苷酸例如DNA。
[0024] 还提供了包含所述多核苷酸的宿主细胞。
[0025] 在本文中将表达抗体或片段的方法提供为将抗体或片段偶联至聚合物例如PEG 的方法。
[0026] 本公开内容还涉及包含所述抗体和片段的药物组合物。
[0027] 在一个实施方案中，提供了治疗方法，包括施用治疗有效量的如本文中描述的抗 体、片段或组合物。
[0028] 本公开内容还延伸至用于治疗，特别地用于免疫和/或自身免疫性疾病的治疗的 根据本公开内容的抗体、片段或组合物。
[0029] 因此，本公开内容提供了用于去除病原性IgG的抗体、其片段和方法，所述去除通 过加速机体分解代谢IgG的天然机制来实现。
[0030] 本质上，根据本公开内容的抗体和片段阻断在机体内再利用IgG的系统。
[0031] 本疗法可能为其中使用血浆去除术疗法或IVIg疗法的某些疾病提供替换或补 充，这对于患者来说是有利的。
[0032] 附图概述
[0033] 图1显示某些氨基酸和多核苷酸序列。
[0034] 图2显示某些序列的比对。
[0035] 图3显示根据本公开内容的Fab'片段及其PEG化形式在人MDCKII上的结合的 比较。
[0036] 图4显示根据本公开内容的Fab'片段及其PEG化形式抑制MDCKII细胞上的IgG 再利用。
[0037] 图5显示根据本公开内容的PEG化Fab'片段抑制MDCKII细胞中顶端至基底外 侧的IgG转胞吞作用。
[0038] 图6显示根据本公开内容的Fab'片段及其PEG化形式的食蟹猴MDCKII结合的 比较。
[0039] 图7显示根据本公开内容的PEG化Fab'片段抑制MDCKII细胞（其人和食蟹猴 形式）上的IgG再利用。
[0040] 图8显示根据本公开内容的PEG化Fab'分子的单次剂量在食蟹猴中对血浆IgG 水平的作用。
[0041] 图9显示根据本公开内容的PEG化Fab'分子的四次每周剂量对血浆IgG水平的 作用。
[0042] 图10显示被阻断蛋白抑制的FcRn的抗体再利用功能的图示。
[0043] 图11显示使用纯化的YIIgG抗体的基于流式细胞术的人IgG阻断测定。
[0044] 图12显示20mg/Kg的Fab'PEG单次/周期性IV剂量在正常食蟹猴中第1天和 67天的IgG药效学。
[0045] 图13显示Fab'PEG:4x20或100mg/Kg/周的重复IV剂量在正常食蟹猴中的IgG 药效学。
[0046] 图14显示20mg/Kg和100mg/Kg的Fab'PEG单次/周期性IV剂量在正常食蟹猴 中第1天和67天的IgG药效学。
[0047] 图15显示在2次IV剂量的20mg/Kg的1519.g57Fab'PEG后在4只食蟹猴中的 血浆IgG水平。
[0048] 图16显示在接受10次IV剂量的20mg/Kg的1519.g57Fab'PEG(每3天1次） 的4只食蟹猴中的血浆IgG水平。
[0049] 图17显示2次30mg/KgIV剂量的1519.g57IgG4P在食蟹猴中对内源血浆IgG 的作用。
[0050] 图18显示30mg/Kg和随后41次每日剂量的5mg/Kg1519.g57IgG4P在食蟹猴中 对血浆IgG的作用。
[0051] 图19显示用媒介物每日给药在食蟹猴中对血浆IgG的结果。
[0052] 图20显示用CA170_01519. g57 Fab'PEG或PBS IV处理的hFcRn转基因小鼠的血 浆中IV hlgG的增加的清除率。
[0053] 图21显示用CA170_01519. g57 IgGl或IgG4或PBS IV处理的hFcRn转基因小鼠 的血浆中IV hlgG的增加的清除率。
[0054] 图22显示用CA170_01519. g57 Fab'-人血清白蛋白或PBS IV处理的hFcRn转基 因小鼠的血浆中IV hlgG的增加的清除率。
[0055] 图23显示用CA170_01519. g57 FabFv或PBS IV处理的hFcRn转基因小鼠的血浆 中IV hlgG的增加的清除率。
[0056]图24显示用CA170_01519. g57 Fab或Fab'PEG或PBS IV处理的hFcRn转基因小 鼠的血浆中IV hlgG的增加的清除率。
[0057] 图25显示本发明的双特异性抗体融合蛋白，其被称为Fab-dsFv。
[0058] 发明详述
[0059] 如本文中所用，FcRn意指人IgG受体α链与β2微球蛋白（β2M)之间的非共价 复合物，也称为新生儿Fc受体，其氨基酸序列见UniProt号Ρ55899,β2Μ的氨基酸序列见 UniProt号Ρ61769。
[0060] 如本文中所用，抗体分子意指抗体或其结合片段。
[0061] 如本文中所用，术语'抗体'通常涉及完整的（全）抗体，即包含两条重链和两条 轻链的元件。抗体还可包含另外的结合结构域例如根据WO 2007/024715中公开的分子 DVD-Ig或W02011/030107中描述的所谓（FabFv)2Fct5因此如本文中所用的抗体包括二价、 三价或四价的全长抗体。
[0062]抗体的结合片段包括单链抗体（即全长重链和轻链）；Fab、修饰的Fab、Fab'、修 饰的Fab'、F(ab，）2、Fv、Fab-Fv、Fab_dsFv、单结构域抗体（例如VH或VL或VHH)、scFv、二 价、三价或四价抗体、Bis_scFv、diabody、tribody、triabody、tetrabody和上述任意一种的 表位结合片段（参见例如Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9) :1126-1136; Adair and Lawson，2005, Drug Design Reviews-Online 2 (3) ,209-217)。产生和制 备这些抗体片段的方法在本领域是公知的（参见例如Verma等人，1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。Fab-Fv形式首先公开于W02009/040562,其二硫 键稳定化形式Fab-dsFv首先公开于W02010/035012,也参见本文中图25。用于本发明的其 它抗体片段包括描述于国际专利申请W02005/003169、W02005/003170和W02005/003171中 的Fab和Fab'片段。多价抗体可包含多特异性例如双特异性或可以是单特异性的（参见 例如WO 92/22583和W005/113605)。后者的一个这样的实例是描述于WO 92/22583中的 Tri-Fab(或TFM)。
[0063] 典型的Fab'分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区Vh、恒定结构域ChI和 天然的或修饰的铰链区，轻链包含可变区' 和恒定结构域Q。
[0064] 在一个实施方案中，提供了根据本公开内容的Fab'的二聚体以产生F(ab'）2，例 如二聚化可通过铰链来实现。
[0065] 在一个实施方案中，抗体或其结合片段包含结合结构域。结合结构域通常将包含 6个CDR，3个来自重链以及3个来自轻链。在一个实施方案中，CDR在框架中并且一起形成 可变区。因此在一个实施方案中，抗体或结合片段包含特异于抗原的结合结构域，所述结合 结构域包含轻链可变区和重链可变区。
[0066] 将理解可对CDR或其它由本发明提供的序列（例如可变结构域）进行一个或多 个（例如1、2、3或4个）氨基酸置换、添加和/或缺失而不显著地改变抗体结合FcRn的能 力。任何氨基酸置换、添加和/或缺失的效果可由本领域技术人员例如通过使用本文中，特 别地实施例中描述的方法容易地测试以测定FcRn。
[0067] 可对本发明提供的抗体或片段中使用的框架区进行一个或多个（例如1、2、3或4 个）氨基酸置换、添加和/或缺失，并且其中对FcRn的结合亲和力得到保持或增加。
[0068] 根据Kabat等人设计的系统对抗体可变结构域中的残基进行常规地编号。该 系统不于Kabat等人，1987,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,US DepartmentofHealthandHumanServices,NIH,USA(在下文称为"Kabat等人（同上）"） 中。将该编号系统用于本说明书中，除非另有指明。
[0069]Kabat残基命名并不总是直接对应于氨基酸残基的线性编号。实际的线性氨基酸 序列可包含比严格Kabat编号中更少的或额外的氨基酸，对应于基本可变结构域结构的结 构组件（无论是构架区还是互补决定区（CDR))的缩短或至其中的插入。可通过将抗体序 列中具有同源性的残基与"标准"Kabat编号的序列进行比对来确定给定抗体的残基的正确 Kabat编号。
[0070] 重链可变结构域的⑶R位于根据Kabat编号系统的残基31-35(⑶R-Hl)、残基 50-65 (CDR-H2)和残基 95-102 (CDR-H3)。然而，根据〇1〇也1&(〇1〇也1&，(：.&11(11^81^八· M.J.Mol.Biol.，196, 901-917(1987))，相当于CDR-Hl的环从残基26延伸至残基32。因此除 非另有指明，本文中使用的'⑶R-ΗΓ意指残基26至35,如通过Kabat编号系统和Chothia 拓扑环定义的组合所描述的。
[0071] 轻链可变结构域的⑶R位于根据Kabat编号系统的残基24-34(⑶R-Ll)、残基 50-56 (CDR-L2)和残基 89-97 (CDR-L3)。
[0072] 本公开内容的抗体和片段阻断FcRn从而可阻止其在IgG的再利用中发挥功能。本 文中所使用的"阻断"意指物理阻断例如封闭受体，但也包含其中抗体或片段结合表位从而 导致例如构象变化，该构象变化意味着受体的天然配体不再结合。本发明的抗体分子结合 FcRn从而减少或阻止（例如抑制）FcRn与IgG恒定区结合。
[0073] 在一个实施方案中，抗体或其片段相对于IgG竞争性结合FcRn。
[0074] 在一个实施方案中，抗体或其结合片段用作人FcRn对人IgG的结合的竞争性抑制 齐U。在一个实例中，抗体或其结合片段结合FcRn上的IgG结合位点。在一个实例中，抗体 或其结合片段不结合β2M。
[0075] 用于本公开内容的抗体可通过使用本领域中已知的任何适当的方法来获得。可 将FcRn多肽/蛋白包括融合蛋白、（重组地或天然地）表达多肽的细胞（例如激活的T细 胞）用于产生特异性识别FcRn的抗体。多肽可以是'成熟的'多肽或其生物活性片段或衍 生物。人蛋白在号Ρ55899下登记于Swiss-Prot。人FcRna链的胞外结构域提供于SEQID Ν0:94。β2Μ的序列提供于SEQIDN0:95。
[0076] 在一个实施方案中，抗原是FcRn的突变体形式，该突变体形式经工程化将FcRn呈 递在细胞表面，以便存在很少的或不存在将FcRn内化至细胞内的动态加工，例如这可通过 在FcRnα链的胞质尾区中产生突变来实现，其中二一亮氨酸被突变成二一丙氨酸，如Ober 等人，2001Int.Immunol.公，1551 - 1559 中所描述的。
[0077] 用于免疫宿主的多肽可通过本领域中公知的方法从经遗传工程化的包含表达系 统的宿主细胞制备，或者它们可从天然生物源回收而来。在本申请中，术语'多肽'包括肽、 多肽和蛋白质。这些被可互换地使用，除非另有指明。在一些情况下，FcRn多肽可以是较 大蛋白例如融合蛋白的部分例如融合至亲和标记物或类似的。
[0078] 可通过使用公知的和常规的方案将多肽施用至动物，优选非人动物来获 得针对FcRn多肽产生的抗体（其中动物的免疫是必需的），参见例如Handbook ofExperimentalImmunology,D.M.ffeir(ed.),Vol4,BlackwellScientific Publishers,Oxford,England, 1986)。可免疫多种温血动物例如兔、小鼠、大鼠、羊、母牛、胳 驼或猪。然而小鼠、兔、猪和大鼠通常是最适合的。
[0079] 可通过本领域中已知的任何方法例如杂交瘤技术（Kohler&Milstein,Nature, 1 975, 256, 495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术（Kozbor等人，Immunology Today, 1983, 4:72)和EBV-杂交瘤技术（Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancer Therapy,ρρ· 77-96,AlanR.Liss,Inc. , 1985)来制备单克隆抗体。
[0080] 用于本发明的抗体还可使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达从单个淋巴细胞 产生的免疫球蛋白可变区cDNA来产生，通过例如由Babcook,J.等人，1996，？1'〇(：.似1:1· Acad.Sci.USA93(15) :7843-78481、WO92/02551、W02004/051268 和国际专利申请号 W02004/106377描述的方法来选择产生特定抗体的单个淋巴细胞。
[0081] 可使用测量对人FcRn的结合的测定和/或测量阻断IgG与受体的结合的能力的 测定来进行抗体的筛选。结合测定的实例是ELISA，特别地使用固定于平板上的人FcRn和 人Fc的融合蛋白和使用第二抗体来检测结合于融合蛋白的抗-FcRn抗体。适当的拮抗和 阻断测定的实例描述于本文的实施例中。
[0082] 人源化抗体（包括⑶R移植抗体）是具有一个或多个来自非人物种的互补决 定区（CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子（参见例如，US5, 585, 089 ; W091/09967)。将理解可只需要转移⑶R的特异性决定残基而不是整个⑶R(参加例如， Kashmiri等人，2005,Methods, 36, 25-34)。人源化抗体可任选地还包括一个或多个来源于 非人物种（CDR来源于该物种）的框架残基。后者通常被称为供体残基。
[0083] 如本文中所用，"特异的"意指抗体仅识别其特异于的抗原或相较于对其非特异于 的抗原的结合，抗体对其特异于的抗原具有显著更高的结合亲和力，例如至少5、6、7、8、9、 10倍更高的结合亲和力。结合亲和力可通过技术例如下文中描述的BIAcore来测量。在一 个实例中，本发明的抗体不结合β2微球蛋白（β2M)。在一个实例中，本发明的抗体结合食 蟹猴FcRn。在一个实例中，本发明的抗体不结合大鼠或小鼠FcRn。
[0084] 根据本公开内容的某些抗体的氨基酸序列和多核苷酸序列提供于附图中。
[0085] 在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段是人源化的。
[0086] 如本文中所用，术语'人源化抗体分子'意指这样的抗体分子：其中重链和/或轻 链包含一个或多个被移植入受体抗体（例如人抗体）的重链和/或轻链可变区框架的来 自供体抗体（例如非人抗体例如鼠单克隆抗体）的CDR(若需要，包括一个或多个修饰的 CDR)。对于综述，参见Vaughan等人，NatureBiotechnology, 16, 535-539, 1998。在一个实 施方案中，只将来自上文中描述的任一个CDR的特异性决定残基的一个或多个，而不是将 整个CDR转移至人抗体框架（参见例如，Kashmiri等人，2005,Methods, 36, 25-34)。在一 个实施方案中，只将来自上文中描述的一个或多个CDR的特异性决定残基转移至人抗体框 架。在另一个实施方案中，只将来自上文中描述的每一个CDR的特异性决定残基转移至人 抗体框架。
[0087] 当移植CDR或特异性决定残基时，可根据CDR来源于的供体抗体的种类/类型使 用任何合适的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类和人框架区。
[0088] 适当地，根据本发明的人源化抗体具有包含人受体框架区以及一个或多个本文中 特别提供的CDR的可变结构域。因此，在一个实施方案中，提供了结合人FcRn的阻断性人 源化抗体，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体CDR。
[0089] 可用于本发明的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和P0M(Kabat 等人，同上）。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链，EU、LAY和POM可用于重链 和轻链。或者，可使用人种系序列:这些可在http://vbase.mrc-cpe.cam,ac.uk/上获得。
[0090] 在本发明的人源化抗体中，受体重链和轻链不一定需要来源于相同的抗体，并且 若需要，可包含具有来源于不同链的框架区的复合链。
[0091] 本发明的人源化抗体的重链的一个这样的适当的框架区来源于人亚组VH3序列 1-33-07 连同JH4(SEQIDN0:56)。
[0092] 因此，在一个实例中，提供了包含SEQIDNO: 1所示的CDR-Hl的序列、SEQIDN0:2 所示的⑶R-H2的序列和SEQIDNO: 3所示的⑶RH3的序列的人源化抗体，其中重链框架区 来源于人亚组VH3序列1-33-07连同JH4。
[0093]人JH4 的序列是（YFDY)WGQGTLVTVS(SeqIDNo: 70)。YFDY基序是CDR-H3 的部分 而不是框架 4 的部分（Ravetch，JV.等人，1981，Cell, 27, 583-591)。
[0094] 在一个实例中，抗体的重链可变结构域包含SEQIDN0:29中所示的序列。
[0095] 本发明的人源化抗体的轻链的适当的框架区来源于人种系亚组VKl序列2-1-(1) A30 连同JK2(SEQIDN0:54)。
[0096] 因此，在一个实例中，提供了包含SEQIDN0:4所示的CDR-Ll的序列、SEQIDN0:5 所示的⑶R-L2的序列和SEQIDN0:6所示的⑶RL3的序列的人源化抗体，其中轻链框架区 来源于人亚组VKl序列2-1-(1)Α30连同JK2。
[0097]JK2 序列是（YT)FGQGTKLEIK(SeqIDNo:71)。YT基序是CDR-L3 的部分而不是框 架 4 的部分（Hieter,PA.等人，1982,Biol.Chem.，257, 1516-1522)。
[0098] 在一个实例中，抗体的轻链可变结构域包含SEQIDNO: 15中所示的序列。
[0099] 在本发明的人源化抗体中，框架区不需要具有与受体抗体的框架区完全相同的序 列。例如，可将对于该受体链种类或类型不常见的残基改变成更常出现的残基。或者，可改 变受体框架区中经选择的残基以便它们对应于在供体抗体中相同位置处发现的残基（参 见Reichmann等人，1998,Nature, 332, 323-324)。应当将这样的改变保持在恢复供体抗 体的亲和力所需要的最小程度。在受体框架区中选择可能需要被改变的残基的方案示于 W091/09967 中。
[0100] 因此，在一个实施方案中，框架中的1、2、3、4或5个残基被替代性氨基酸残基置 换。
[0101]因此，在一个实例中，提供了人源化抗体，其中至少在重链的可变结构域的位置3、 24、76、93和94(Kabat编号）的每一个上的残基是供体残基，参见例如SEQIDNO:29中所 示的序列。
[0102] 在一个实施方案中，重链可变结构域的残基3被替代性氨基酸例如谷氨酰胺置 换。
[0103]在一个实施方案中，重链可变结构域的残基24被替代性氨基酸例如丙氨酸置换。
[0104]在一个实施方案中，重链可变结构域的残基76被替代性氨基酸例如天冬酰胺置 换。
[0105]在一个实施方案中，重链的残基93被替代性氨基酸例如丙氨酸置换。
[0106] 在一个实施方案中，重链的残基94被替代性氨基酸例如精氨酸置换。
[0107]在一个实施方案中，在根据本公开内容的人源化重链可变区中，残基3是谷氨酰 胺，残基24是丙氨酸，残基76是天冬酰胺，残基93是丙氨酸，残基94是精氨酸。
[0108] 因此，在一个实施方案中，提供了人源化抗体，其中至少在轻链的可变结构域的位 置36、37和58 (Kabat编号）的每一个上的残基是供体残基，参见例如SEQIDNO: 15中所 示的序列。
[0109]在一个实施方案中，轻链可变结构域的残基36被替代性氨基酸例如酪氨酸置换。 [0110] 在一个实施方案中，轻链可变结构域的残基37被替代性氨基酸例如谷氨酰胺置 换。
[0111] 在一个实施方案中，轻链可变结构域的残基58被替代性氨基酸例如缬氨酸置换。
[0112] 在一个实施方案中，在根据本公开内容的人源化轻链可变区中，残基36是酪氨 酸，残基37是谷氨酰胺，以及残基58是缬氨酸。
[0113]在一个实施方案中，本公开内容提供了在相关序列的部分或全部上与本文中公开 的序列具有80%例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的 相似性或同一性的抗体序列，所述相关序列的部分或全部可以是例如可变结构域序列、CDR 序列或除CDR以外的可变结构域序列。在一个实施方案中，相关序列是SEQIDNO: 15。在 一个实施方案中，相关序列是SEQIDNO:29。
[0114]在一个实施方案中，本发明提供结合人FcRn的包含重链的抗体分子，其中重链 的可变结构域包含与SEQIDN0:29中所示的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或相似性的序列。
[0115]在一个实施方案中，本发明提供结合人FcRn的包含轻链的抗体分子，其中轻链 的可变结构域包含与SEQIDN0:15中所示的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或相似性的序列。
[0116]在一个实施方案中，本发明提供结合人FcRn的抗体分子，其中所述抗体具有与SEQIDN0:29 中所示的序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的相似性或同一性的重链可变结构域，但是其中所述抗体分子具有SEQIDNO: 1所 示的⑶R-Hl的序列、SEQIDNO:2所示的⑶R-H2的序列和SEQIDNO:3所示的⑶R-H3的 序列。
[0117]在一个实施方案中，本发明提供结合人FcRn的抗体分子，其中所述抗体具有与 SEQIDN0:15 中所示的序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的相似性或同一性的轻链可变结构域，但是其中所述抗体分子具有SEQIDN0:4所 示的CDR-Ll的序列、SEQIDNO:5所示的CDR-L2的序列和SEQIDNO:6所示的CDR-L3的 序列。
[0118] 在一个实施方案中，本发明提供结合人FcRn的抗体分子，其中所述抗体具有与 SEQIDN0:29 中所示的序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的相似性或同一性的重链可变结构域，和与SEQIDNO: 15中所示的序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相似性或同一性的轻链可变 结构域，但是其中所述抗体分子具有SEQIDNO: 1所示的⑶R-Hl的序列、SEQIDNO:2所 示的CDR-H2的序列、SEQIDNO: 3所示的CDR-H3的序列、SEQIDNO:4所示的CDR-Ll的序 列、SEQIDN0:5所示的CDR-L2的序列和SEQIDN0:6所示的CDR-L3的序列。
[0119] 如本文中所用，"同一性"是指在比对的序列中的任何特定位置，氨基酸残基在序 列之间是相同的。如本文中所用，"相似性"是指在比对的序列中的任何特定位置，氨基酸残 基在序列之间具有相似的类型。例如，可用亮氨酸替换异亮氨酸或缬氨酸。可常常被用来 彼此替换的其它氨基酸包括但不限于：
[0120] 一苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸（具有芳香族侧链的氨基酸）；
[0121] 一赖氨酸、精氨酸和组氨酸（具有碱性侧链的氨基酸）；
[0122] 一天冬氨酸和谷氨酸（具有酸性侧链的氨基酸）；
[0123] 一天冬酰胺和谷氨酰胺（具有酰胺侧链的氨基酸）；和
[0124] 一半胱氨酸和甲硫氨酸（具有含硫侧链的氨基酸）。可容易地计算同一性和相 似性的程度（ComputationalMolecularBiology，Lesk，A.M.，ed.,OxfordUniversity Press,NewYork, 1988 ；Biocomputing.InformaticsandGenomeProjects,Smith,D. W. ,ed. ,AcademicPress,NewYork, 1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part I,Griffin,A.M. ,andGriffin,H.G. ,eds. ,HumanaPress,NewJersey, 1994；Sequence AnalysisinMolecularBiology,vonHeinjejG. ,AcademicPress，1987,Sequence AnalysisPrimer,GribskovjM.andDevereuxjJ.,eds. ,MStocktonPress,New ￥〇4，1991，81^3了1￥软件可从【81获得以1七8(*111，31.等人，1990， <1.]?〇1· Biol. 215 :403-410 ；Gish,W. &States,D.J. 1993,NatureGenet. 3: 266-272.Madden,T. L.等人，1996,Meth.Enzymol. 266:131-141 ;Altschul，S.F.等人，1997,NucleicAcids Res. 25:3389-3402 ；Zhang,J.Madden,T.L. 1997,GenomeRes. 7:649-656) 〇
[0125] 本发明的抗体分子可包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，并且可 以是但不限于Fab、修饰的Fab、Fab'、修饰的Fab'、F(ab'）2、Fv、单结构域抗体（例如VH或 VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、Bis-scFv、diabodies、triabodies、tetrabodies 和上述任意一种的表位结合片段（参见例如HolligerandHudson，2005,Nature Biotech. 23 (9):1126-1136；AdairandLawson,2005,DrugDesignReviews-Online 2 (3)，209-217)。产生和制备这些抗体片段的方法在本领域是公知的（参见例如Verma等 人，1998,JournalofImmunologicalMethods，216, 165-181)。用于本发明的其它抗体片 段包括描述于国际专利申请W02005/003169、W02005/003170和W02005/003171中的Fab和 Fab'片段。多价抗体可包含多特异性例如双特异性或可以是单特异性的（参见例如WO92 /22853,W005/113605,W02009/040562 和W02010/035012)。
[0126] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是抗体Fab'片段，其包含SEQID NO: 15和29中所示（例如分别对于轻链和重链）的可变区。在一个实施方案中，抗体分子 具有包含SEQIDN0:22中所示的序列的轻链和包含SEQIDN0:36中所示的序列的重链。
[0127] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgGl抗体，其包含SEQID NO: 15和29中所示（例如分别对于轻链和重链）的可变区。在一个实施方案中，抗体分子 具有包含SEQIDN0:22中所示的序列的轻链和包含SEQIDN0:72中所示的序列的重链。
[0128] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgG4形式，其包含SEQID NO: 15和29中所示（例如分别对于轻链和重链）的可变区。在一个实施方案中，抗体分子 具有包含SEQIDN0:22中所示的序列的轻链和包含SEQIDN0:87中所示的序列的重链。
[0129] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体分子是全长IgG4P形式，其包含SEQID NO: 15和29中所示（例如分别对于轻链和重链）的可变区。在一个实施方案中，抗体分子 具有包含SEQIDN0:22中所示的序列的轻链和包含SEQIDN0:43中所示的序列的重链。
[0130] 如本文中所用，IgG4P是野生型IgG4同种型的突变，其中氨基酸241被脯氨酸置 换，参见例如Angal等人，MolecularImmunology, 1993, 30 (1)，105-108 中描述的位置 241 上的丝氨酸被改变成脯氨酸。
[0131] 在一个实施方案中，将根据本公开内容的抗体提供为FcRn结合抗体融合蛋白，其 包含免疫球蛋白部分例如Fab或Fab'片段，和与其直接或间接连接的一个或两个单结构 域抗体（dAb)，例如如W02009/040562,W02010035012,W02011/030107,W02011/061492 和 W02011/086091中所描述的，将这些资料通过引用并入本文。
[0132] 在一个实施方案中，融合蛋白包含两个结构域抗体例如作为可变重链（VH)和可 变轻链（VL)配对，任选地通过二硫键连接。
[0133] 在一个实施方案中，融合蛋白的Fab或Fab'元件具有与单结构域抗体相同或相似 的特异性。在一个实施方案中，Fab或Fab'具有与单结构域抗体不同的特异性，即融合蛋 白是多价的。在一个实施方案中，根据本发明的多价融合蛋白具有白蛋白结合位点，例如其 中VH/VL对提供白蛋白结合位点。在一个这样的实施方案中，重链包含SEQIDN0:50中所 示的序列，轻链包含SEQIDN0:46或SEQIDN0:78中所示的序列。在本文的图25中举例 说明了该Fab-dsFv形式。
[0134] 在一个实施方案中，根据本公开内容的Fab或Fab'与PEG分子或人血清白蛋白缀 合。
[0135]CA170_01519g57和1519以及1519.g57在本文中互换使用，并用于指可以以多种 不同形式使用的抗体可变区的特定配对。这些可变区是SEQIDN0:29中所示的重链序列 和SEQIDNO: 15中所示的轻链序列（图1)。
[0136] 本发明的抗体分子的恒定区结构域，若存在时，可以根据抗体分子的期望功能， 特别地可能期望的效应子功能来选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG 或IgM结构域。特别地，可使用人IgG恒定区结构域，特别地当期望抗体分子用于治疗性 用途并且期望抗体效应子功能时可使用IgGl和IgG3同种型的恒定区结构域。或者，当 期望抗体分子用于治疗性目的并且不期望抗体效应子功能时可使用IgG2和IgG4同种 型。将理解还可使用这些恒定区结构域的序列变体。例如可使用Angal等人，Molecular Immunology, 1993, 30 (I)，105-108中描述的IgG4分子，其中已将位置241上的丝氨酸改 变为脯氨酸。本领域技术人员还将理解抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和 程度通常取决于用来表达抗体的宿主细胞系和培养条件。这样的修饰可包括糖基化、甲硫 氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺作用中的变化。常用的修饰 是由于羧肽酶的作用而导致的羧基-末端碱性残基（例如赖氨酸或精氨酸）的缺失（如 Harris,RJ.JournalofChromatography705:129-134, 1995 中描述的）。因此，抗体重链 的C-末端赖氨酸可以缺失。
[0137] 在一个实施方案中，抗体重链包含CHl结构域，并且抗体轻链包含κ或者λCL结 构域。
[0138] 在一个实施方案中，轻链具有SEQIDNO:22所示的序列，并且重链具有SEQID NO:43所示的序列。
[0139] 在一个实施方案中，轻链具有SEQIDNO:22所示的序列，并且重链具有SEQID NO:72所示的序列。
[0140] 在一个实施方案中，抗体分子的C-末端氨基酸在翻译后修饰过程中被切割。
[0141] 在一个实施方案中，抗体分子的N-末端氨基酸在翻译后修饰过程中被切割。
[0142] 本发明还提供了人FcRn的特定区域或表位，其被本发明提供的抗体，特别地包含 重链序列gH20(SEQIDN0:29)和/或轻链序列gL20(SEQIDN0:15)的抗体结合。
[0143] 可通过本领域中已知的任何适当的表位作图技术结合本发明提供的任一种抗体 来鉴定人FcRn多肽的该特定区域或表位。这样的方法的实例包括筛选来源于FcRn的具有 不同长度的肽对本发明的抗体的结合，可特异性结合抗体的最小片段包含被该抗体识别的 表位序列。可合成地产生FcRn肽或通过FcRn多肽的蛋白水解消化来产生。可通过例如质 谱分析来鉴定结合抗体的肽。在另一个实例中，可使用NMR光谱分析或X射线晶体学来鉴 定被本发明的抗体结合的表位。经鉴定后，若需要，可将结合本发明的抗体的表位片段用作 免疫原以获得结合所述表位的额外抗体。
[0144] 在一个实施方案中，本公开内容的抗体结合如下所示的人FcRna链胞外序列：
[0145]AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFffVSGffLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGA WVffENQVSffYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGP?TLQGLLGCELGPDNTSVPTAKF AT,NGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEAII,ATSQRffQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRCNLEWKEPP SMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQ⑶FGPNSDGSFHASSSLTVKS⑶EHHY CCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSS(SEQIDN0：94).
[0146] 加以下划线的残基是已知对于人FcRn与人IgG的Fe区的相互作用至关重要的那 些残基，粗体显示的那些残基是参与FcRn与本公开内容的1519抗体的相互作用的那些残 基，所述1519抗体包含重链序列gH20(SEQIDN0:29)和轻链序列gL20(SEQIDN0:15)。
[0147] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含至少一个选自SEQIDN0:94中的V105、P106、T107、A108和K109的氨基酸，和至少一个 例如至少 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 个选自SEQIDN0:94 中的P100、E115、E116、F117、M118、 N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128、G129、D130、W131、P132 和E133 的残基。
[0148] 在一个实例中，使用与β2Μ复合的FcRna链胞外序列（SEQIDNO: 94)通过X射 线晶体学来测定抗体分子的表位。
[0149] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含至少一个选自SEQIDN0:94中的V105、P106、T107、A108和K109的氨基酸，和至少一个 例如至少 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 个选自SEQIDN0:94 中的E115、E116、F117、M118、N119、 F120、D121、L122、K123 和Q124 的残基。
[0150] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含至少两个、三个、四个或五个选自SEQIDN0:94中的￥105、？106、1107、4108和1(109的氨 基酸，和至少一个选自SEQIDN0:94 中的E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、 K123和Q124的残基。
[0151] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含至少一个选自SEQIDN0:94中的V105、P106、T107、A108和K109的氨基酸，和至少一个 选自SEQIDN0:94 中的P100、E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、 G128、G129、D130、W131、P132 和E133 的残基。
[0152] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含至少一个选自SEQIDN0:94中的V105、P106、T107、A108和K109的氨基酸，和至少一个 选自SEQIDN0:94 中的P100、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124 和G128 的残基。
[0153] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含SEQIDN0:94 中的残基V105、P106、T107、A108和K109，和至少一个选自SEQIDN0:94 中的P100、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124 和G128 的残基。
[0154] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含SEQIDN0:94 中的残基V105、P106、T107、A108 和K109,和至少一个选自SEQIDN0:94 中的P100、E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128、G129、D130、 W131、P132 和E133 的残基。
[0155] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含SEQIDN0:94中的残基P100、V105、P106、T107、A108和K109，和至少一个选自SEQID N0:94 中的E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128、G129、D130、 W131、P132 和E133 的残基。
[0156]在一个实例中，'至少一个残基'可以是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或16个残基。
[0157] 在一个实例中，本发明提供结合人FcRn的表位的抗-FcRn抗体分子，所述表位包 含SEQIDN0:94中的残基100、105至109、115至124和129至133或由所述残基组成。
[0158] 交叉阻断根据本发明的抗体分子，特别地包含SEQIDN0:29所示的重链序列和 SEQIDNO: 15所示的轻链序列的抗体分子的结合的抗体可类似地用于阻断FcRn活性。因 此，本发明还提供抗-FcRn抗体分子，其交叉阻断上文中描述的任一种抗体分子与人FcRn 的结合和/或被这些抗体的任一种交叉阻断而不能结合人FcRn。在一个实施方案中，这样 的抗体结合至与上文中描述的抗体相同的表位。在另一个实施方案中，交叉阻断中和抗体 结合至与上文中描述的抗体所结合的表位相邻和/或重叠的表位。
[0159] 可使用本领域中任何适合的方法来鉴定交叉阻断抗体，例如通过使用竞争ELISA 或BIAcore测定，其中交叉阻断抗体与人FcRn的结合阻止本发明的抗体的结合，或反之亦 然。这样的交叉阻断测定可使用分离的天然或重组FcRn或适当的融合蛋白/多肽。在一 个实例中，使用重组人FcRn胞外结构域（SEQIDN0:94)来测量结合和交叉阻断。在一个 实例中，将重组人FcRna链胞外结构域用在与β2微球蛋白（i3 2M)(SEQIDN0:95)的复 合物中。
[0160] 在一个实施方案中，提供了抗-FcRn抗体分子，其阻断FcRn与IgG的结合，并且交 叉阻断其重链包含SEQIDNO: 29所示的序列和其轻链包含SEQIDNO: 15所示的序列的抗 体与人FcRn的结合。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体将包含SEQIDNO: 29 所示的重链序列和SEQIDNO: 15所示的轻链序列的抗体的结合抑制超过80%,例如超过 85 %，例如超过90 %，特别地超过95 %。
[0161] 可选择地或另外的，根据本发明的该方面的抗-FcRn抗体可以被包含SEQID NO: 29所示的重链序列和SEQIDNO: 15所示的轻链序列的抗体交叉阻断而不能与人FcRn 结合。因此还提供了抗-FcRn抗体分子，其阻断FcRn与IgG的结合，并且被包含SEQID NO: 29所示的重链序列和SEQIDNO: 15所示的轻链序列的抗体交叉阻断而不能与人FcRn 结合。在一个实施方案中，包含SEQIDNO:29所示的重链序列和SEQIDNO: 15所示的轻 链序列的抗体将本发明的该方面提供的抗-FcRn抗体与人FcRn的结合抑制超过80 %，例如 超过85 %，例如超过90 %，特别地超过95 %。
[0162] 在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体是完全人的。在一个实施方案中， 本发明提供的交叉阻断抗体是人源化的。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体 对人FcRn的亲和力为IOOpM或更少。在一个实施方案中，本发明提供的交叉阻断抗体对人 FcRn的亲和力为50pM或更少。可使用下文中描述的方法来测量亲和力。
[0163] 生物分子例如抗体或片段，包含酸性和/或碱性的功能基团，从而使得该分子带 净的正电荷或负电荷。总共的"被观察到的"电荷量将取决于实体的绝对氨基酸序列、带电 基团在3D结构中的局部环境和分子的环境条件。等电点（pi)是特定分子或其溶剂可及表 面不带净电荷时的pH。在一个实例中，可将本发明的FcRn抗体和片段工程化以具有合适的 等电点。这可导致抗体和/或片段具有更稳定的性质，特别地合适的溶解度和/或稳定性 特征谱和/或改善的纯化特征。
[0164] 因此在一个方面，本发明提供了人源化FcRn抗体，其经工程化而具有与原始鉴定 的抗体的等电点不同的等电点。可以例如通过置换氨基酸残基，例如用一种或多种碱性氨 基酸残基置换酸性氨基酸残基来工程化抗体。或者，可引入碱性氨基酸残基或可去除酸性 氨基酸残基。或者，如果分子具有不可接受的高Pi值，则可按需引入酸性残基以降低pi。 重要的是当操纵Pi时，必须小心操作以保持抗体或片段的期望活性。因此在一个实施方案 中，经工程化的抗体或片段具有与"未修饰的"抗体或片段相同的或大体上相同的活性。
[0165] 可使用程序例如**ExPASY http://www. expasy. ch/tools/pi tool, html,和
[0166]http://www. iut-arles. up. univ-mrs· fr/w3bb/d abim/compo-D. html,来予页测丨抗 体或片段的等电点。
[0167] 本发明的抗体分子适当地具有高的结合亲和力，特别地在纳摩尔范围内的亲和 力。可以使用本领域中已知的任何适当的方法包括如本文的实施例中描述的BIAcore，利用 分离的天然或重组FcRn或适当的融合蛋白/多肽来测量亲和力。在一个实例中，使用如本 文的实施例中描述的重组人FcRn胞外结构域（SEQIDN0:94)来测量亲和力。在一个实例 中，使用与β2微球蛋白（β2Μ)(SEQIDNO:95)缔合的重组人FcRna链胞外结构域（SEQ IDN0:94)来测量亲和力。适当地，本发明的抗体分子对分离的人FcRn的结合亲和力为约InM或更少。在一个实施方案中，本发明的抗体分子的结合亲和力为约500pM或更少（即 更高的亲和性）。在一个实施方案中，本发明的抗体分子的结合亲和力为约250pM或更少。 在一个实施方案中，本发明的抗体分子的结合亲和力为约200pM或更少。在一个实施方案 中，本发明提供结合亲和力为约IOOpM或更少的抗-FcRn抗体。在一个实施方案中，本发明 提供结合亲和力为约IOOpM或更少的人源化抗-FcRn抗体。在一个实施方案中，本发明提 供结合亲和力为50pM或更少的抗-FcRn抗体。
[0168] 重要地，本发明的抗体能够在pH6和pH7. 4下以相当的结合亲和力结合人FcRn。 从而有利地，即使在内涵体内抗体也能够持续结合FcRn，从而最大化地阻断FcRn与IgG的 结合，参见图10对机制的举例说明。
[0169] 在一个实施方案中，本发明提供在pH6和pH7. 4下测量时具有IOOpM或更少的结 合亲和力的抗-FcRn抗体。
[0170] 可由本领域技术人员使用常规技术例如Scatchard等人描述的那些（Ann. KY.Acad.Sci. 51:660-672(1949))，或者通过表面等离子体共振技术（SPR)使用例如 BIAcore的系统来测定本发明的抗体或结合片段的亲和力以及结合剂（例如抗体）抑制结 合的程度。对于表面等离子体共振技术，将靶分子固定于固相上并暴露于沿着流动池流动 的流动相中的配体。如果发生对固定靶的配体结合，那么局部折射率发生变化，从而导致 SPR角的变化，这可通过检测折射光强度的变化来实时监测。可分析SPR信号的变化率以 给出结合反应的缔合相和解离相的表观速率常数。这些值的比率给出表观平衡常数（亲和 力）（参见例如，Wolff等人，CancerRes. 53:2560-65(1993))。
[0171] 在本发明中，通常如下所述地使用SPR测定测试抗体分子的亲和力。将测试抗体 分子捕获在固相上，将与β2Μ非共价复合的人FcRna链胞外结构域在流动相中于被捕获 的抗体上方流过并测定测试抗体分子对人FcRn的亲和力。可以使用任何适当的方法例如 使用抗-Fc或抗Fab'特异性捕获剂将测试抗体分子捕获在固相芯片表面。在一个实例中， 在PH6下测定亲和力。在一个实例中，在ρΗ7· 4下测定亲和力。
[0172] 将理解可以使用本领域中已知的任何适当的方法来改变本发明提供的抗 体的亲和力。本发明从而还涉及本发明的抗体分子的变体，所述变体具有改善的对 于FcRn的亲和力。可通过许多亲和力成熟方案包括突变⑶R(Yang等人，J.Mol. Biol. . 254. 392-403, 1995)、链改组（Marks等人，Bio/Technology，l^，779-783, 1992)、 使用大肠杆菌（E.coli)的增变株（Low等人，J.Mol.Biol.，250, 359-368, 1996)、 DNA改组（Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol·, §,724-733, 1997)、噬菌体展不 (Thompson等人，J.Mol.Biol. , 256, 77-88, 1996)和有性PCR(sexualPCR)(Crameri等 人，Nature, 391, 288-291, 1998)来获得这样的变体。Vaughan等人（同上）讨论了这些亲 和力成熟的方法。
[0173] 在一个实施方案中，本发明的抗体分子阻断人FcRn活性。适合用于确定抗体阻 断FcRn的能力的测定描述于本文的实施例中。适当的用于确定抗体是否阻断FcRn与循环 的IgG分子的相互作用的测定描述于本文的实施例中。适合用于确定抗体分子在体外阻断 IgG再利用的能力的测定描述于下文中。
[0174] 若需要，可将用于本发明的抗体缀合于一个或多个效应分子。将理解，效应分子 可包含单个效应分子或两个或更多个这样的分子（如此连接以形成可连接于本发明的抗 体的单个部分）。当期望获得连接于效应分子的抗体片段时，这可通过标准化学或重组 DNA法（其中将抗体片段直接或通过偶联剂连接于效应分子）来制备。用于将这样的效 应分子缀合于抗体的技术在本领域是公知的（参见，Hellstrom等人，ControlledDrug Delivery, 2ndEd.，Robinson等人，eds.，1987,ρρ· 623-53;Thorpe等人，1982,Tmmunol. Rev.，62:119-58 和Dubowchik等人，1999,PharmacologyandTherapeutics, 83, 67-123)。 具体化学方法包括例如WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476 和 W003031581中描述的方法。或者，当效应分子是蛋白质或多肽时，连接可使用重组DNA法， 例如WO86/01533和EP0392745中描述的方法来实现。
[0175] 如本文中所用，术语效应分子包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白例如 酶、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其片 段、放射性核素，特别地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团例如 荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱分析检测的化合物。
[0176] 效应分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害（例如杀死）的 任何试剂。实例包括考布他汀（combrestatin)、多拉司他汀、埃博霉素、星形孢菌素、美登 素类化合物（maytansinoid)、海绵毒素（spongistatin)、根霉素、软海绵素、杆孢菌素、哈 米特林（hemiasterlins)、泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙陡、依米丁（emetine)、丝裂 霉素、依托泊苷、鬼白噻吩式（tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉 素、二轻基炭疽菌素二酮（dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、 1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或 同源物。
[0177] 效应分子还包括但不限于抗代谢药（例如甲氨蝶呤、6-巯嘌呤，6-硫鸟 嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺），烷化剂（例如氮芥、噻替哌苯丁酸氮芥 (thioepachlorambucil)、美法仑、卡莫司汀（BSNU)和洛莫司汀（CCNU)、环磷酰胺 (cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C，和顺-二氯二氨钼（II) (DDP)顺钼）、蒽环类（例如柔红霉素（以前称为道诺霉素）和多柔比星）、抗生素（例如 更生霉素（以前称为放线菌素）、博来霉素、光辉霉素、氨茴霉素（AMC)、卡奇霉素或多卡米 星）和抗有丝分裂剂（例如长春新碱和长春碱）。
[0178] 其它效应分子可包括螯合放射性核素例如111In和9°Y、Lu1'铋213、锎252、铱192和 钨187铼188;或药物例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和舒拉明。
[0179] 其它效应分子包括蛋白质、肽和酶。目标酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂 解酶、异构酶、转移酶。目标蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素例如相思豆毒 蛋白、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干 扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织型纤溶酶原激活物、血栓形成 剂或抗血管生成剂例如血管他丁或内皮他丁，或生物反应修饰剂例如淋巴因子、白细胞介 素-I(IL-I)、白细胞介素-2 (IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、粒细胞集落 刺激因子（G-CSF)、神经生长因子（NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。
[0180] 其它效应分子可包括用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种 酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属（用于正电子 发射断层摄影术）和非放射性顺磁性金属离子。关于可缀合于抗体以用作诊断剂的金属离 子，通常参见美国专利No. 4, 741，900。适当的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素； 适当的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯 和藻红蛋白；适当的发光材料包括鲁米诺；适当的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和 水母发光蛋白；以及适当的放射性核素包括 125I、131I、mIn和"Tc。
[0181] 在另一个实例中，效应分子可增加抗体的体内半衰期和/或减小抗体的免疫原性 和/或增强抗体穿过上皮屏障至免疫系统的递送。该类型的适当效应分子的实例包括聚合 物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物例如WO05/117984中描述的那些蛋白质 或化合物。
[0182] 在一个实施方案中，效应分子提供的不依赖于FcRn的半衰期是有利的。
[0183] 当效应分子是聚合物时，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选地取 代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化亚烷基聚合物或分支多糖或未分支多糖，例 如同聚或异聚多糖。
[0184] 可存在于上述合成聚合物上的具体的任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲 氧基。
[0185] 合成聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚（乙二醇）、聚（丙二 醇）、聚（乙烯醇）或其衍生物，特别地任选地取代的聚（乙二醇）例如甲氧基聚（乙二醇） 或其衍生物。
[0186] 具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
[0187] 在一个实施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。
[0188] 本文中使用的"衍生物"意欲包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应基团例如马 来酰亚胺类等。反应基团可直接或通过接头片段连接于聚合物。将理解，这样的基团的残 基在一些情况下将形成产物的部分作为抗体片段与聚合物之间的连接基团。
[0189] 可按需要改变聚合物的尺寸，但聚合物的尺寸通常在500Da至50000Da，例如5000 至40000Da、例如20000至40000Da的平均分子量范围内。可特别地基于产物的期望用途例 如定位至某些组织例如肿瘤的能力或延长循环半衰期的能力来选择聚合物尺寸（关于综 述，参见Chapman, 2002,AdvancedDrugDeliveryReviews, 54, 531-545)。因此，例如，当意 欲产物离开循环和渗入组织，例如用于治疗肿瘤时，可有利地使用小分子量（例如具有约 5000Da的分子量）聚合物。对于其中产物保留在循环中的应用，可有利地使用具有更高分 子量的聚合物，例如具有在20000Da至40000Da的范围内的分子量。
[0190] 适当的聚合物包括聚亚烷基聚合物，例如聚（乙二醇）或，特别地甲氧基聚（乙二 醇）或其衍生物，并且特别地具有在约15000Da至约40000Da的范围内的分子量。
[0191] 在一个实例中，将用于本发明的抗体连接于聚（乙二醇）（PEG)部分。在一个特 定实例中，抗体是抗体片段，并且可通过任何可获得的位于抗体片段中的氨基酸侧链或末 端氨基酸官能团（例如任何游离氨基、亚胺基、巯基、羟基或羧基）来连接PEG分子。这 样的氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组DNA法工程化入片段（参见例如US 5, 219, 996;US5, 667, 425;TO98/25971、TO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体 分子是修饰的Fab片段，其中修饰是将一个或多个氨基酸添加至其重链的C末端以允许效 应分子附着。适当地，添加的氨基酸形成效应分子可附着的包含一个或多个半胱氨酸残基 的修饰的铰链区。多个位点可用于连接两个或更多个PEG分子。
[0192] 适当地通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接PEG分子。 每一个连接于修饰抗体片段的聚合物分子可共价地连接于位于片段中的半胱氨酸残基的 硫原子。共价连接通常为二硫键或特别地硫-碳键。当巯基用作连接点时适当地可使用激 活的效应分子，例如巯基选择性衍生物例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。激活的聚合物 可在上述聚合物-修饰抗体片段的制备中用作起始材料。激活的聚合物可以是包含巯基反 应基团例如α-卤代羧酸或酯例如碘乙酰胺、酰亚胺例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化 物的任何聚合物。这样的起始材料可商购获得（例如来自Nektar,先前称为Shearwater PolymersInc. ,Huntsville,AL,USA)或可使用常规化学法从商购可得的起始材料制备。 具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺（获自Nektar,先前称为Shearwater;Rapp Polymere;和SunBio)和M-PEG-SPA(获自Nektar,先前称为Shearwater)。
[0193] 在一个实施方案中，抗体是修饰的Fab片段、Fab'片段或diFab，其是 PEG化的，即具有例如根据EP0948544或EP1090037中公开的方法共价连接至其 的PEG(聚（乙二醇））（也参见〃Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical andBiomedicalApplications"，1992,J.MiltonHarris(ed),PlenumPress,New York, ^Poly(ethyleneglycol)ChemistryandBiologicalApplications^, 1997,J. MiltonHarrisandS.Zalipsky(eds),AmericanChemicalSociety,Washington DCancT'BioconjugationProteinCouplingTechniquesfortheBiomedical Sciences^, 1998,M.AslamandA.Dent,GrovePublishers,NewYork; Chapman,A. 2002,AdvancedDrugDeliveryReviews2002, 54:531-545)。在一个实例中， 将PEG连接于铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接于 修饰的铰链区中的单个巯基的马来酰亚胺基团。可将赖氨酸残基共价连接于马来酰亚胺基 团，并且可将具有约20000Da的分子量的甲氧基聚（乙二醇）聚合物连接于赖氨酸残基上 的每一个氨基。连接于Fab片段的PEG的总分子量从而可以是约40000Da。
[0194] 特定的PEG分子包括Ν，Ν' -二（甲氧基聚（乙二醇））（MW20000)修饰的赖氨酸 的2-[3-(Ν-马来酰亚胺）丙酰胺基]乙酰胺，也称为PEG2MAL40K(可获自Nektar，先前称 为Shearwater)〇
[0195] 备选的PEG接头的来源包括N0F，其提供GL2-400MA3 (其中下面的结构中的m为 5)和GL2-400MA(其中m为2)以及η为约450 :
[0196]
【权利要求】
1. 抗-FcRn抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段包含具有可变区的重链或重链 片段，其中所述可变区包含独立地选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的一个、 两个或三个⑶R。
2. 权利要求1的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中⑶R HI具有SEQ ID NO: 1所示的序 列。
3. 权利要求1或2的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中⑶R H2具有SEQ ID NO: 2所示 的序列。
4. 权利要求1-3任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中⑶R H3具有SEQ ID NO: 3 所示的序列。
5. 权利要求1-4任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段还包 含具有可变区的轻链或其片段，其中所述可变区包含独立地选自SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和SEQ ID NO:6的一个、两个或三个CDR。
6. 权利要求5的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中⑶R LI具有SEQ ID NO: 4所示的序 列。
7. 权利要求5或6的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中⑶R L2具有SEQ ID NO: 5所示 的序列。
8. 权利要求5-7任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中⑶R L3具有SEQ ID NO:6 所示的序列。
9. 权利要求1-8任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体是人源化的。
10. 权利要求1-9任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段具有包 含SEQ ID NO:29所示的序列的重链和包含SEQ ID NO: 15所示的序列的轻链。
11. 与人FcRn结合的抗-FcRn抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段包含重链和 轻链，其中所述重链的可变结构域包含与SEQ ID N0:29所示的序列具有至少80%同一性或 相似性的序列，并且其中轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO: 15所示的序列具有至少80% 同一性或相似性的序列。
12. 权利要求1-11任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体是scFv、Fv、 Fab或Fab'片段。
13. 权利要求12的抗-FcRn抗体Fab'片段，其具有包含SEQ ID NO:36所示的序列的 重链和包含SEQ ID NO:22所示的序列的轻链。
14. 权利要求1-13任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体或结合片段缀 合于聚合物例如选自淀粉、白蛋白和聚乙二醇的聚合物。
15. 权利要求14的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述聚合物是PEG，例如具有 5-50kDa的分子量的PEG。
16. 权利要求1-11任一项的抗-FcRn抗体，其中所述抗体是全长抗体。
17. 权利要求16的抗-FcRn抗体，其中所述全长抗体选自IgGl、IgG4和IgG4P。
18. 权利要求16或17的抗-FcRn抗体，其具有包含SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 87或 SEQ ID N0:43所示的序列的重链和包含SEQ ID N0:22所示的序列的轻链。
19. 权利要求1-11任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述抗体或其结合片段 是Fab-dsFv，其具有包含SEQ ID N0:50所示的序列的重链和包含SEQ ID N0:46或SEQ ID NO:78所示的序列的轻链。
20. 抗-FcRn抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段对人FcRn的结合亲和力为 100pM或更少。
21. 权利要求20的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中在pH6和pH7. 4测量时，对人FcRn 的结合亲和力为l〇〇pM或更少。
22. 抗-FcRn抗体或其结合片段，其结合与权利要求10的抗体相同的人FcRn表位。
23. 结合人FcRn表位的抗-FcRn抗体或其结合片段，其中所述表位包含至少一个选自 SEQ ID N0:94中的残基￥105、？106、1107、4108和1(109的氨基酸，和至少一个选自5￡〇10 N0:94 中的 P100、E115、E116、F117、M118、N119、F120、D121、L122、K123、Q124、G128、G129、 D130、W131、P132 和 E133 的残基。
24. 抗-FcRn抗体或其结合片段，其交叉阻断权利要求10的抗体与人FcRn的结合或被 权利要求10的抗体交叉阻断与人FcRn的结合。
25. 权利要求20-24任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其是人源化或完全人的。
26. 权利要求22-25任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其对人FcRn的结合亲和力 为100pM或更少。
27. 权利要求1-26任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其与人FcRn结合。
28. 权利要求1-27任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其阻断人IgG与人FcRn的结 合。
29. 权利要求1-28任一项的抗-FcRn抗体或其结合片段，其不结合0 2微球蛋白。
30. 用于检测测试分子例如抗体分子阻断人FcRn活性的能力，特别是人FcRn再利用 IgG的能力的测定，其中方法包括步骤： a) 将重组地表达人FcRn a链和人￠2微球蛋白（P2M)的非人哺乳动物细胞涂覆在表 面上， b) 在温和的酸性条件下例如约pH5. 9将细胞与测试抗体分子和待被细胞再利用的IgG 接触充足的时间以允许测试抗体分子和IgG与FcRn结合， c) 用微酸性的缓冲液洗涤，和 d) 检测被细胞内化和/或再利用的IgG的量。
31. 权利要求30的测定，其中将测试抗体分子先于待被再利用的IgG添加，并温育充足 的时间以允许在添加待被再利用的IgG之前测试抗体分子与FcRn的结合。
32. 分离的DNA序列，其编码权利要求1-29任一项的抗体的重链和/或轻链。
33. 包含一种或多种权利要求32的DNA序列的克隆或表达载体。
34. 权利要求33的载体，其中所述载体包含i )SEQ ID NO:37所示的序列和SEQ ID N0:23所示的序列或ii)SEQ ID N0:80所示的序列和SEQ ID N0:79所示的序列或iii)SEQ ID NO:93所示的序列和SEQ ID NO:91所示的序列。
35. 宿主细胞，其包含一种或多种权利要求33或权利要求34的克隆或表达载体。
36. 用于产生对人FcRn具有结合特异性的抗体的方法，其包括培养权利要求35的宿主 细胞和分离抗体。
37. 药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的权 利要求1-29任一项中定义的抗-FcRn抗体或其结合片段。
38. 权利要求37的药物组合物，其另外地包含其它活性成分。
39. 权利要求1-29任一项中定义的抗体或其结合片段或权利要求37或38中定义的组 合物，其用于治疗用途。
40. 权利要求1-29任一项中定义的抗体或其结合片段或权利要求37或38中定义的组 合物，其用于治疗自身免疫性疾病，例如重症肌无力、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、格-巴二 氏综合征、狼疮和血栓性血小板减少性紫癜。
41. 治疗患者的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1-29任一项中定义的抗体或其 结合片段或权利要求37或38中定义的组合物。
42. 权利要求41的方法，其中所述治疗用于自身免疫性疾病，例如重症肌无力、寻常天 疱疮、视神经脊髓炎、格-巴二氏综合征、狼疮和血栓性血小板减少性紫癜。
【文档编号】G01N33/53GK104364265SQ201380025216
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2012年5月14日
【发明者】H·M·芬尼, A·D·G·劳森, S·G·绍尔, B·J·史密斯, K·L·泰森, L·科夫凯恩, C·梅尔, K·萨卡尔, P·A·阿瑟罗夫德 申请人:Ucb医药有限公司