一种基于同种属来源第一抗体的免疫荧光双重标记方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用同种属来源第一抗体进行免疫荧光双重标记的方法，按照如下步骤进行：（1）梯度稀释抗A蛋白抗体，利用间接免疫荧光染色法，确定抗A蛋白抗体检测待测A蛋白的最小工作浓度；（2）利用此浓度，采用SABC法（以荧光素标记链霉亲和素）对A蛋白进行显色；（3）施加抗B蛋白抗体，利用间接免疫荧光染色法，对B蛋白进行显色；（4）荧光显微镜镜检、拍照，得到待测A和B蛋白的镜检照片并进行叠加，分析两种蛋白的表达情况。本发明简便易行，操作简便，用较低的实验成本实现较高的研究要求，为临床免疫荧光组织化学研究提供广泛的应用范围。
【专利说明】一种基于同种属来源第一抗体的免疫荧光双重标记方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学及生物技术应用领域，具体为一种利用两种同一种属来源的第一抗体进行免疫荧光双重标记的方法。
【背景技术】
[0002]在生物与医学研究中，免疫荧光化学染色是最为常用的技术手段之一，其原理是利用抗原与抗体特异性结合的原理，结合标记在抗体上的荧光素，通过荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)从而使组织、细胞内多肽或蛋白质抗原的定位、定性、定量等信息在荧光显微镜下可视化。
[0003]在研究过程中，经常需要在同一细胞或组织标本中同时检测两种抗原/蛋白(例如A蛋白和B蛋白)，以明确它们的共定位或共表达情况，此时就需应用免疫荧光双重标记技术，它可分为直接法和间接法:(I)直接法是将两种特异性抗体(抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体)分别以发出不同颜色的荧光素进行标记，例如，抗A蛋白抗体用异硫氰酸荧光素(FITC)标记发出黄绿色荧光，抗B蛋白抗体用四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记发出橙红色荧光，将两将荧光抗体按适当比例混合后，孵育组织或细胞后形成抗原抗体复合物，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，发出黄绿色荧光的即抗A蛋白抗体结合部位，发出橙红色荧光的即抗B蛋白抗体结合的部位，这样就能显示出两种抗原/蛋白的位置，同时可通过分析荧光强度来对目标抗原/蛋白定量。直接法的优点是简便方便，但灵敏度较低、抗体需要量大；(2)间接法是用未标记荧光素的不同种属来源的第一抗体(如鼠源性抗A蛋白抗体和兔源性抗B蛋白抗体)孵育组织或细胞后，再加入标记有不同荧光素的第二抗体(如抗鼠IgG-FITC或抗兔IgG-TRITC)，从而对两种抗原/蛋白进行定位、定量。间接法因为通过第二抗体从而使标记的强度得到放大，所以效果灵敏、需要抗体较少，目前已基本取代了直接法，是免疫荧光标记和双重标记的主要方法。
[0004]近年发展出一种将SABC法和间接法相结合的免疫荧光双重标记方法。SABC即链霉亲和素-生物素-复合物(Strept-avidin biotin complex),生物素与亲和素具有天然的高亲和力。实验时，不同种属来源的第一抗体(如鼠源性抗A蛋白抗体和兔源性抗B蛋白抗体)分别与A和B抗原/蛋白结合后，利用生物素标记的第二抗体(如抗鼠IgG-biotin)孵育组织或细胞，之后加入荧光素Cy2标记的链霉亲和素(SA-Cy2)和抗兔IgG-TRITC，从而对两种抗原/蛋白进行显色。由于I个亲和素分子上有4个生物素结合位点，SABC法对荧光信号的放大效果是单纯间接法的5-10倍，因此具有更高的灵敏性。
[0005]在应用免疫突光双重标记技术时，必须注意的一点是:两种特异性第一抗体须来源于不同种属，即抗A蛋白抗体来源鼠，那么抗B蛋白抗体必须来源于鼠以外的其他种属，如兔、山羊或豚鼠等，这时使用与第一抗体种属相匹配的第二抗体才不会出现免疫交叉反应，从而保证结果的可靠性。然而在实际工作中，抗体的种属来源会受到诸多限制，特别是在研究一种新分子或因研究时间和经费限制，无法选择抗体的种属，必须要使用两种同种属来源的第一抗体时，目前的免疫突光双重标记方法就存在着一定的局限性。
【发明内容】
[0006]本发明为了解决现有免疫荧光双重标记技术必须使用两种不同种属来源第一抗体的问题，提供一种新的免疫荧光化学染色技术，利用有限的抗体种属来源和普通荧光显微镜实现同种属来源的第一抗体在同一标本中的双重标记。
[0007]本发明是采用如下技术方案实现的:
一种基于同种属来源第一抗体的免疫突光双重标记方法，其用两种同一种属来源的抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体对待检测标本中的A蛋白和B蛋白进行免疫荧光双重标记。
[0008]具体地说，是利用SABC免疫荧光法和间接免疫荧光法，在抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体为同一种属来源时对细胞或组织的A蛋白或B蛋白进行双重标记检测。
[0009]—种免疫突光双重标记技术化学技术，利用两种同种属来源的第一抗体:抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体，包括以下步骤:
(O确定抗A蛋白抗体最小应用浓度:
Ca)将待测组织切片或细胞爬片入0.01 mo I/L PBS清洗三次，每次5分钟；
(b)血清封闭；
(c)二倍梯度稀释A蛋白相应的第一抗体——抗A蛋白抗体，加入到待测组织切片或细胞爬片，4 °C孵育24-48小时；
(d)PBS清洗三次，每次5分钟后，加入针对第一抗体种属来源的荧光素标记第二抗体，室温孵育2小时；
(e)PBS清洗两次，80%甘油缓冲液封片，荧光显微镜镜检，找出刚好不能另A蛋白显色的第一抗体最小工作浓度；
(2)SABC法检测A蛋白:
Ca)将待测组织切片或细胞爬片入PBS清洗三次，每次5分钟；
(b)血清封闭；
(c)稀释抗A蛋白抗体到最小工作浓度，加入到组织切片或细胞爬片，4°C孵育24-48小
时；
(d)PBS清洗三次，每次5分钟后，加入针对抗A蛋白抗体种属来源的生物素标记的第二抗体，室温孵育3小时；
(e)PBS清洗三次,每次5分钟后,加入荧光素标记的链霉亲和素,室温孵育2小时；(f)PBS清洗两次，荧光显微镜镜检，观察染色结果；
(3)间接法检测B蛋白:
(a)PBS清洗A蛋白已显色的组织切片或细胞爬片，每次5分钟后，加入抗B蛋白抗体，4°C孵育24小时；
(b)PBS清洗三次,每次5分钟后,加入荧光素标记的第二抗体,室温孵育2小时；
(c)PBS清洗两次，80%甘油缓冲液封片，荧光显微镜镜检，观察染色结果；
(4)突光图片置加分析:
Ca)荧光显微镜拍照，获取待测蛋白A和B的镜检照片；
(b)利用软件对照片进行叠加，定性和定量分析两种蛋白的共表达和共定位情况。
[0010]本发明所述的免疫荧光双重标记技术:利用SABC法较间接法敏感的原理，在抗A蛋白抗体为最小工作浓度情况下(此浓度下不能为间接法显色)，可对A蛋白进行显色；在B蛋白显色时，由于利用间接法，只能对B蛋白但不能对A蛋白显色，因此避免了同种属来源抗体之间的交叉反应。该技术一方面可有效避免同种属来源第一抗体的免疫交叉反应，推进了免疫荧光双重标记技术；另一方面可解决抗体种属来源受限和因研究时间、经费紧张而无法选择第一抗体种属的难题。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1a为SABC法染色后A蛋白(TH)的镜检照片，图1b为间接法染色后B蛋白(P75)的镜检照片，图1c为A蛋白(TH)与B蛋白(P75)叠加后的镜检照片；
图2a为SABC法染色后A蛋白(Ki67)的镜检照片，图2b为间接法染色后B抗原(BrdU)的镜检照片，图2c为A蛋白(Ki67)与B抗原(BrdU)叠加后的镜检照片。
【具体实施方式】
[0012]通过以下具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0013]实施例1:新生小鼠中脑蓝斑核平面冰冻组织切片，采用本发明所述免疫荧光双重标记技术检测TH (A蛋白)和P75 (B蛋白)的共表达情况，使用的第一抗体均为兔源性，包括以下步骤:
(1)确定兔抗TH抗体最小工作浓度:
Ca)新生小鼠中脑蓝斑核平面冰冻组织切片，晾干后入0.01 mol/L PBS清洗三次，每次5分钟；
(b)加入正常山羊血清封闭液，37°C湿盒中孵育60分钟。注意保持样品湿润，一定要避免组织切片干燥，否则会产生较高的背景；
(c)按照兔抗TH抗体(Sigma公司，货号T-8700)说明书推荐浓度，用抗体稀释液(含1% BSA和0.3% Triton-XlOO) 二倍梯度稀释抗体，具体稀释倍数为1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000，加入到待测组织切片，4°C孵育24-48小时；
(d)PBS清洗三次，每次5分钟后，加入按适当比例用抗体稀释液稀释的抗兔IgG-TRITC，室温孵育2小时；
(e)PBS清洗两次，80%甘油缓冲液封片，荧光显微镜镜检，发现1:500和1:1000时兔抗TH抗体显色明显；1:2000时仍能显色,但已显著减弱；1:4000时抗体已不能显色，因此1:4000即为兔抗TH抗体的最小工作浓度；
(2)SABC法检测TH (A蛋白);
Ca)新生小鼠中脑蓝斑核平面冰冻组织切片，晾干后入0.01 mol/L PBS清洗三次，每次5分钟；
(b)加入正常山羊血清封闭液，37°C湿盒中孵育60分钟；
(c)用抗体稀释液按1:4000稀释兔抗TH抗体，加入到组织切片4°C孵育24-48小时；
(d)PBS清洗三次，每次5分钟后，加入按适当比例用抗体稀释液稀释的抗兔IgG-biotin，室温孵育3小时；
(e)PBS清洗三次,每次5分钟后,加入突光素标记的链霉亲和素(SA-Cy2),室温避光孵育2小时；(f)PBS清洗两次，荧光显微镜镜检，观察染色结果；
(3)间接法检测P75(B蛋白)；
(a)PBS清洗TH已显色的组织切片，每次5分钟，加入按适当比例用抗体稀释液稀释的兔抗P75抗体(Abeam公司，货号ab38335)，4°C孵育24小时；
(b)PBS清洗三次，每次5分钟后，加入用抗体稀释液稀释的抗兔IgG-TRITC，室温避光孵育2小时；
(c)PBS清洗两次，80%甘油缓冲液封片，荧光显微镜镜检；
(4)突光图片置加分析；
Ca)荧光显微镜拍照，获取兔抗TH抗体和兔抗P75抗体的染色照片；
(b)利用软件对照片进行叠加，结果如图1所示:图1a中绿色荧光代表目的A蛋白(TH)，图1b红色荧光代表目的B蛋白(P75)，图1c为二者的叠加图片，箭头所示的细胞共表达TH和P75，星号所示的细胞只表达P75。
[0014]实施例2:培养的神经干细胞爬片，采用本发明所述免疫荧光双重标记技术检测Κ?67 (A蛋白)和BrdU (B抗原)的共表达情况，使用的第一抗体均为小鼠源性，包括以下步骤:
(1)确定小鼠抗Ki67抗 (a)培养的神经干细胞爬片，在4%多聚甲醛中固定20分钟后，用0.01 mol/L PBS清洗三次，每次5分钟；
(b)加入正常山羊血清封闭液，37°C湿盒中孵育30分钟；
(c)按照小鼠抗Ki67抗体(Abeam公司，货号ab6526)说明书推荐浓度，用抗体稀释液二倍梯度稀释抗体，具体稀释倍数为1:200、1:400、1:800、1:1500、1:3000，加入到待测细胞爬片，4°C孵育24小时；
(d)PBS清洗三次，每次5分钟后，加入按适当比例用抗体稀释液稀释的抗鼠IgG-TRITC，室温孵育2小时；
(e)PBS清洗两次，80%甘油缓冲液封片，荧光显微镜镜检，发现1:200和1:400时小鼠抗Ki67抗体显色明显；1:800时仍能显色,但已显著减弱；1:1500时抗体已不能显色，因此1:1500即为小鼠抗Ki67抗体的最小工作浓度；
(2)SABC法检测Ki67 (A蛋白):
(a)培养的神经干细胞爬片，加入BrdU(终浓度为5 μ mol/L)37°C孵育4小时后，4%多聚甲醛中固定20分钟，用0.01 mol/L PBS清洗三次，每次5分钟；
(b)加入正常山羊血清封闭液，37°C湿盒中孵育30分钟；
(c)用抗体稀释液按1:1500稀释小鼠抗Ki67抗体，加入到细胞爬片，4°C孵育24小时；
(d)PBS清洗三次，每次5分钟后，加入按适当比例用抗体稀释液稀释的抗鼠IgG-biotin，室温孵育3小时；
(e)PBS清洗三次,每次5分钟后,加入突光素标记的链霉亲和素(SA-Cy2),室温避光孵育2小时；
(f)PBS清洗两次，荧光显微镜镜检，观察染色结果；
(3)间接法检测BrdU(B抗原):
(a)PBS清洗Ki67已显色的细胞爬片，每次5分钟，加入按适当比例用抗体稀释液稀释的小鼠抗BrdU抗体(Sigma公司，货号B-8434)，4°C孵育24小时；
(b)PBS清洗三次，每次5分钟后，加入用抗体稀释液稀释的抗小鼠IgG-TRITC，室温避光孵育2小时；
(c)PBS清洗两次，80%甘油缓冲液封片，荧光显微镜镜检； (4)突光图片置加分析:
Ca)荧光显微镜拍照，获取小鼠抗Ki67抗体和小鼠抗BrdU抗体的染色照片；
(b)利用软件对照片进行叠加，结果如图2所示:图2a中绿色荧光代表目的A蛋白(Κ?67),图2b红色荧光代表目的B抗原(BrdU)，图2c为二者的叠加图片，箭头所示的细胞共表达Ki67和BrdU，星号所示的细胞只表达Ki67。
【权利要求】
1.一种基于同种属来源第一抗体的免疫突光双重标记方法，其特征在于:用两种同一种属来源的抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体对待检测标本中的A蛋白和B蛋白进行免疫荧光双重标记。
2.根据权利要求1所述的一种免疫荧光双重标记方法，其特征在于:利用SABC免疫荧光法和间接免疫荧光法，在抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体为同一种属来源时对细胞或组织的A蛋白或B蛋白进行双重标记检测。
3.根据权利要求1所述的免疫荧光双重标记方法，其特征在于包括以下步骤: (1)确定抗A蛋白抗体最小工作浓度； (2)SABC法检测A蛋白； (3)间接法检测B蛋白； (4)突光图片叠加分析。
4.根据权利要求3所述的免疫荧光双重标记方法，其特征在于包括以下步骤: (O确定抗A蛋白抗体最小工作浓度 (a)制备待测组织切片或细胞爬片； (b)血清封闭； (c)孵育二倍梯度稀释抗A蛋白抗体； (d)孵育针对抗A蛋白抗体种属来源的荧光素标记第二抗体； Ce)荧光显微镜镜检，分析染色情况，找出抗A蛋白抗体刚好不能检测出待测A蛋白的最小工作浓度； (2)SABC法检测A蛋白 Ca)按照步骤(I)准备组织切片或细胞爬片； (b)血清封闭； (c)使用步骤(I)得到最小工作浓度孵育抗A蛋白抗体； Cd)孵育针对抗体A种属来源的生物素标记的第二抗体； Ce)孵育荧光素标记的链霉亲和素； Cf)荧光显微镜镜检，观察染色情况； (3)间接法检测B蛋白 Ca)利用步骤(2)已显色的组织切片或细胞爬片，孵育抗B蛋白抗体； (b)孵育荧光素标记第二抗体； (C)突光显微镜镜检,分析染色情况； (4)突光图片叠加分析 Ca)荧光显微镜镜检、拍照，获取待测A和B蛋白的镜检照片； (b)利用软件对照片进行叠加，分析两种蛋白的表达情况。
【文档编号】G01N1/30GK103994911SQ201410099873
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】史明, 杜芳 申请人:中国人民解放军第四军医大学