一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法，将具有两个或两个以上抗原决定簇的抗原免疫动物，利用杂交瘤单克隆技术制备抗原特异性单克隆抗体，将阳性克隆细胞株进行体外细胞培养获得含有抗原特异性单克隆抗体的细胞培养上清液，以两两组合的方式将杂交瘤细胞培养上清液加入到共价交联有蛋白A或G的胶乳颗粒的溶液中，孵育后加入抗原，光吸收度增加的单克隆抗体组即为具有不同抗原结合位点的单克隆抗体。
【专利说明】一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法。
【背景技术】
[0002]1975年德国科学家Kohler和英国科学家Milstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术。单克隆抗体技术的基本原理为:小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B淋巴细胞来承担的；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是永久的细胞。把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇等介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体，另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且可工厂化生产，来源容易。单克隆抗体用途广泛，在生物学、医学和其他研究领域中都显示了极大的应用价值。在医学领域中，单克隆抗体在疾病诊断、判断预后、防治以及致病机制研究等方面起着巨大的促进作用。迄今全球已研制出数万种单克隆抗体。
[0003]目前，多数血浆中的各种蛋白浓度的指标多使用夹心ELISA法测定，这种方法特异性好，敏感度高。夹心ELISA需要两个结合同一个蛋白抗原但不同位点的单克隆抗体。制备两个结合同一个蛋白抗原但不同位点的单克隆抗体的杂交瘤细胞株和制备单个单克隆抗体杂交瘤细胞株基本一样，但在获得阳性克隆细胞株后，要进行抗体之间抗原结合位点的检测，只有结合同一个蛋白抗原但不同位点的两个单克隆抗体才可应用于夹心ELISA测定法的建立。制备单克隆抗体包括抗原制备、动物免疫、建立抗体检测方法、细胞融合、选择杂交瘤、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、稳定性测定以及单克隆抗体的大量生产等一系列复杂步骤，一般要花费6个月以上的时间。获得阳性克隆后，再检测这些阳性单克隆抗体是否结合同一位点。传统的方法是将所有的阳性单克隆杂交瘤细胞株进行培养生产抗体，并将这些抗体分离纯化出来，然后将纯化后的阳性单克隆抗体用碱性磷酸酶标记。再利用抑制性ELISA的方法检测这些阳性克隆单克隆抗体是否结合同一个位点。如果两个阳性的单克隆抗体之间不能相互抑制，则说明这两个抗体不结合到同一个位点，这样这两个抗体就可以配对建立夹心ELISA检测方法。
[0004]在单克隆抗体的阳性克隆杂交瘤细胞株数量很多的情况下，使用传统方法对党克隆抗体之间抗原结合位点的检测需要大量的工作量和时间。随着越来越多的疾病相关指标的发现和临床应用，对应用于ELISA的配对的单克隆抗体的需求越来越大，特别是ELISA微阵芯片技术的发展，对高质量的配对单克隆抗体的需求更是越来越多。利用ELISA微阵芯片技术，只需要一个血样就可以同时测定成百上千的指标。大大降低了对血样的采集和检测的时间。因此夹心ELISA配对抗体的高通量筛选方法建立迫在眉睫。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术不足，提供了一种简便、高效、准确的高通量筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法。
[0006]本发明技术方案如下:
一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的筛选方法，包括如下步骤:
(1)将具有2个或2个以上抗原决定簇的抗原免疫小鼠，分离小鼠的脾脏细胞，并将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，进行选择性培养，利用ELISA方法筛选出阳性克隆抗体杂交瘤细胞株，并分别将各个阳性克隆抗体杂交瘤细胞株进行克隆化培养获得单克隆抗体杂交瘤细胞株，再将每株单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养，分别得到不同阳性单克隆抗体杂交瘤细胞的培养上清液；
(2)将步骤(I)得到的不同阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株的培养上清液以两两组合的方式分别加入到共价交联有蛋白A或G的胶乳颗粒的溶液中，孵育后加入抗原，蛋白A或G可特异性结合抗体，从而使得单克隆抗体浓缩吸附于胶乳颗粒表面，如果加入的两个单克隆抗体结合抗原的不同结合位点，就会使得胶乳颗粒凝集，从而光吸收度增加。如果加入的两个单克隆抗体结合的抗原结合位点相同，胶乳颗粒不会发生凝集，光吸收度不会变化。通过测定600nM的吸光度变化就可以确认两个单克隆抗体的抗原结合位点是否相同。
[0007]在本发明涉及的【技术领域】，具有2个或2个以上抗原决定簇的抗原均适应于本发明所述的筛选方法，如cTni，BNP, RBP, LPPLA2, PCT, HbAlc,纤溶酶原，纤溶酶抑制剂或ST2。本发明的一个优选的方案中，使用的抗原为人ST2蛋白。
[0008]本发明所述的单克隆抗体的筛选方法，可用于制备双抗夹心ELISA检测法所需的配对单克隆抗体中，本发明的一个优选的方案中，使用本发明所述的单克隆抗体的筛选方法用于制备具有不同位点的抗ST2蛋白的抗体，用于人血液中ST2蛋白的双抗夹心ELISA检测。
[0009]进一步的，本发明所述的单克隆抗体的筛选方法，可用于制备双抗夹心ELISA检测试剂盒，本发明的一个优选的方案中，使用本发明所述的单克隆抗体的方法筛选制备具有不同位点的抗ST2蛋白的抗体，进而制备ST2蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒。
[0010]本发明所述的技术方案是基于免疫胶乳池度分析法(immunolatexturbidimetry)的创造性改进。传统的免疫比池技术是在免疫沉淀反应(Precipitation)检测法的基础上建立的，在大量抗体的存在下，当加入抗原时，抗原抗体结合后形成复合物，抗原抗体结合后形成复合物的大小使反应系统透光度发生改变，抗原越多形成的复合物越多，光吸收度就越高，相反抗原越少，形成的抗原抗体复合物越少，光吸收度越低，通过测定光吸收度的变化可定量测定抗原的浓度。但是由于抗原浓度较低时，抗原抗体复合物少，不易形成浊度，吸光度变化不大，因此灵敏度很低，微克每毫升就是极限。为解决快速反应及微量化的要求，人们开发了 了胶乳颗粒增强免疫浊度法(immunolatexturbidimetry),其基本原理是:将特异性抗体吸附在大小适中、均勻一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内，不阻碍光线透过；两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少。胶乳颗粒增强免疫浊度法的灵敏度大大提高，是传统的免疫浊度法的1000多倍，可以测定纳克每毫升的浓度。[0011]本发明只需将待测试剂加在一起，混匀即读，10分钟就能知道结果，是一个快速简单的检测方法。由于本发明为了简化步骤，能够直接使用阳性单克隆抗体的细胞培养上清液进行检测，因此对方法进行了改进，采用可以特异性的结合抗体的Fe片段的蛋白A或者蛋白G作为媒介，将蛋白A或者蛋白G共价交联到胶乳微球颗粒上，单克隆抗体通过和蛋白A或者蛋白G结合吸附在胶乳微球颗粒上，形成单抗一蛋白A (或蛋白G) —胶乳微球复合体，当有抗原存在时，如果加进的两个单克隆抗体是结合在同一个位点，则能形成抗原一单抗一蛋白A (蛋白G) —胶乳微球复合体，胶乳微球无法形成凝聚，因此光吸收度不发生变化，如果加进的两个单克隆抗体是结合在抗原的不同位点上，则形成胶乳微球复合体一蛋白A (或蛋白G)—单抗I一抗原一单抗2—蛋白A (或蛋白G) —胶乳微球复合体，胶乳微球形成凝聚，光吸收度增加。因此通过测定光吸收度的变化就可以很快的确定两个抗体是否结合在同一个蛋白抗原的同一个位点上。
[0012]本发明所述的胶乳颗粒为本【技术领域】常规使用的种类，胶乳颗粒与蛋白A或蛋白G的交联方式也是常规使用的技术，胶乳颗粒与交联试剂盒均可以商业购买得到，如本发明实施例中使用的胶乳颗粒及交联试剂盒购自于Bangs Laboratories, Inc.( Fishers, IN,USA)。
[0013]ST2是白细胞介素一 I受体家族的成员。具有跨膜(sST2)和可溶性(ST2)两种亚型。人血浆中可溶性ST2的浓度与多种疾病相关。血浆中ST2浓度与心衰和心肌梗塞患者的愈后有很大的相关性。血浆中ST2浓度的升高预示心衰和心肌梗塞患者有很差的愈后。和其它心血管疾病的指标相比，比如cTni, BNP, LppLA2等，血浆中ST2浓度对预示心衰和心肌梗塞患者的愈后具有更高的准确性。特别是在预示心衰和心肌梗塞患者的一年后的死亡率方面，是其它指标都没法比拟的。本发明以制备具有不同抗原结合位点的抗人ST2单克隆抗体为例，提供了一种高通量ELISA配对单克隆抗体的筛选方法，该方法可应用于不同抗原的夹心ELISA配对单克隆抗体的筛选。
[0014]本发明优点:
1.本发明所述方法不需要抗体的大量生产和纯化，也不用对每个阳性克隆抗体进行标记，即可同时、快速测定不同的单克隆抗体是否结合同一个位点，简化了筛选的步骤，缩短了时间，特别适用高通量筛选。
[0015]2.本发明选择可以特异性的结合抗体的Fe片段的蛋白A或者蛋白G作为媒介，将蛋白A或者蛋白G共价交联到胶乳微球颗粒上，与传统的将抗体与胶乳微球颗粒进行化学偶联或者包被相比，可适用于所有抗体亚型的筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为使用本发明所述方法制得的抗人ST2配对单克隆抗体用于夹心ELISA法测定人ST2的浓度的结果图。
[0017]【具体实施方式】
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0018]在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0019]下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0020]在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0021]实例I抗人ST2单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
将完全福氏佐剂与人ST2溶液按1:1的比例混合制成乳剂。皮下多点注射免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠(每只小鼠200微升，每点约40微升)。两周后以不完全福氏佐剂与人ST2溶液按1:1的比例混合制成乳剂，皮下多点注射人ST2强免疫小鼠。两周后取血测定抗体的效价。经尾静脉注射人ST2加强免疫小鼠，四天后，将小鼠处死，分离脾脏细胞，将分离的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞以50% PEG介导融合。然后在含HAT的培养基进行选择培养。只有融合的细胞才能在HAT培养基中存活下来。
[0022]实施例2抗人ST2单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选
分别将100微升溶于PBS缓冲液浓度为I微克每毫升的人ST2溶液加到96孔酶标板的小孔中，4度放置一个晚上。第二天将人ST2包被的96孔酶标板用洗液(含有0.05% Tween的PBS缓冲液)洗两次。然后用封闭液(1%BSA/洗液)室温封闭酶标板两个小时。将封闭液倒掉，然后将实施例1得到的杂交瘤培养液分别取100微升细胞培养上清液加到96孔板，室温孵育2小时，将上清液倒掉，用洗液(含有0.05% Tween的PBS缓冲液)洗板两次，然后加入100微升碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体加入96孔酶标板的小孔中，室温孵育I小时，用洗液洗两次，加入100微升显色反应底物(4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物)，室温显色30分钟，在波长为410纳米读光吸收值。挑取光吸收值大于1.0克隆做进一步的亚克隆试验。得到20株阳性抗人ST2抗体杂交瘤细胞。
[0023]实施例3杂交瘤细胞的克隆化培养
单克隆杂交瘤细胞可由有限稀释法培养获得。具体方法如下，将实施例2得到的阳性抗人ST2抗体的杂交瘤细胞计数，经过系列的稀释制备浓度为I个细胞/200微升的单细胞悬液。将200微升的单细胞悬液加到96孔细胞培养板的小孔中(I细胞/0.2ml /孔)。在37度，5% 二氧化碳的细胞培养箱培养。约10天左右选择单克隆孔，检测抗体，如阳性者，再克隆，一般克隆3次。选择抗体阳性强、细胞生长好的克隆，进行扩大培养，建系，保存。
[0024]实施例4抗人ST2单克隆抗体的生产
将实例2得到的20个阳性克隆的细胞株分别以IxlO5个/ml的密度接种于2毫升DMEM完全培养基中，利用24孔细胞培养板，培养细胞4天，分别得到20个含有不同的抗ST2抗体的培养上清液，用ELISA检测抗体的效价。收集上清，用于配对抗体的筛选。
[0025]实施例5蛋白A与胶乳微球的共价交联
所用的胶乳颗粒和交联试剂盒从Bangs Laboratories, Inc.( Fishers, IN, USA)购买。具体操作按说明书进行。简单地说，将12.5毫克的400nm的胶乳微球置于1.5毫升的离心管中，30000 Xg离心30分钟，去上清，将胶乳悬浮于0.4毫升的50mM MES pH 5.2的缓冲液中，30000 X g离心30分钟，去上清，将胶乳悬浮于0.17毫升的50mM MES pH 5.2的缓冲液中，加入5毫克的EDC，室温致敏微球15分钟，加入200微克蛋白A，混匀，室温反应60分钟，，离心去上清，用0.4毫升的0.0lM Tris pH 8.0的缓冲液洗3次，然后将微球重悬于0.4毫升的0.0lM Tris pH 8.0的缓冲液中，4度保存备用。
[0026]实施例6配对抗体的筛选
配置Rl反应液(组分为0.02M的Tris缓冲液，多聚乙醇3%，吐温-20 0.1%)。将实施例4得到的20个含有不同的抗ST2抗体的培养上清液两两配对分组，将每组对应的单克隆抗体细胞培养上清液各100微升和实施例5得到的蛋白A胶乳颗粒交联物40微升混合加到96孔板的小孔中。室温孵育I小时，离心去上清，用Tris缓冲液洗涤一次，将人ST2溶于Rl反应液，配制成浓度为I微克每毫升的溶液，吸取200微升溶液加入每组小孔中，混匀，37度孵育5分钟，测定600nM条件下的吸光度。结果见表1，结果表明抗体4与抗体14为具有不同结合位点的抗体。抗体18和抗体6为具有不同结合位点的抗体。
[0027]表 I
【权利要求】
1.一种筛选抗原不同结合位点的单克隆抗体的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将具有2个或2个以上抗原决定簇的抗原免疫小鼠，分离小鼠的脾脏细胞，并将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，用ELISA方法筛选出阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株，并分别将各个阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株进行克隆化培养，再将每株单克隆抗体杂交瘤细胞分别培养，分别得到不同阳性单克隆抗体杂交瘤细胞的培养上清液； (2)将步骤(1)得到的不同阳性单克隆抗体杂交瘤细胞的培养上清液以两两组合的方式分别加入到共价交联有蛋白A或G的胶乳颗粒的溶液中，孵育后加入抗原，测定600nM的吸光度，光吸收度没有改变的单克隆抗体组为一对具有相同抗原结合位点的单克隆抗体，光吸收度增加的单克隆抗体组为一对具有不同抗原结合位点的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体的筛选方法，其特征在于所述抗原为cTni，BNP,RBP, LPPLA2, PCT, HbAlc,纤溶酶原，纤溶酶抑制剂或ST2。
3.如权 利要求1或2所述的单克隆抗体的筛选方法，在制备双抗夹心ELISA检测法所需的配对单克隆抗体中的应用。
4.如权利要求1或2所述的单克隆抗体的筛选方法，在制备双抗夹心ELISA检测试剂盒中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK104020289SQ201410283271
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】赖增祖, 叶欣, 徐健, 赖晓娟, 杨奎东 申请人:宁波艾科生物科技有限公司