经由FcγIIB促进抗原消除的抗原结合分子的制作方法

经由FcγIIB促进抗原消除的抗原结合分子的制作方法
【专利摘要】本发明提供：抗原结合分子，其包含(i)对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域、(ii)具有FcγRIIb选择性结合活性的Fcγ结合结构域和(iii)在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域；以及与给予该分子前相比降低该抗原的血浆中浓度的方法，其包括给予该分子。
【专利说明】经由FeYIIB促进抗原消除的抗原结合分子

【技术领域】
[0001] 本发明提供：抗原结合分子在从血浆中消除抗原中的使用；从血浆中消除抗原的 方法，其包括给予抗原结合分子；药物组合物，其包含可从血浆中消除抗原的抗原结合分 子；以及用于从血浆中消除抗原的抗原结合分子的制备方法。

【背景技术】
[0002] 抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为医药品受到关注。其中，IgG型 的抗体药物有大量上市，现在也正在开发着数量众多的抗体药物（非专利文献1和非专利 文献2)。另一方面，作为能适用于第二代抗体药物的技术，开发有各种技术，报道了使效应 子功能、抗原结合能力、药代动力学、稳定性提高的技术或者使免疫原性风险降低的技术等 (非专利文献3)。通常，抗体药物的给药量非常高，因而作为课题可考虑到难以制作皮下给 药制剂，制备成本高等。作为降低抗体药物的给药量的方法，可考虑改善抗体的药代动力学 的方法和使抗体与抗原的亲和性提高的方法。
[0003] 作为改善抗体的药代动力学的方法，报道有恒定区的人工氨基酸取代（非专利文 献4和5)。作为增强抗体对抗原的结合活性和/或中和活性的技术，报道有亲和性成熟技 术（非专利文献6)，通过对可变区的CDR区等的氨基酸导入突变可以增强对抗原的结合活 性。通过增强抗原结合能力，可以使体外的生物活性提高，或者降低给药量，进而也可以使 体内（机体内）的药效提高（非专利文献7)。
[0004] 另一方面，每一分子具有中和活性的抗体能够中和的抗原量依赖于亲和性，为了 以少的抗体量中和抗原，可以通过各种方法增强抗体的亲和性（非专利文献6)。进而，只 要是可共价地与抗原结合、对抗原的亲和性无限大的抗体，则可以用一分子的抗体来中和 一分子的抗原（二价的情形为二抗原）。但是，这样的方法中，限制是一分子抗体对一分子 抗原（二价的情形是二抗原）的化学计量的中和反应，不可能用抗原量以下的抗体量来完 全中和抗原。即，在通过增强亲和性来中和抗原的效果方面存在限制（非专利文献8)。中 和抗体的情形中，为了使其中和效果持续一定期间，需要给予机体内在该期间产生的抗原 量以上的抗体量，仅通过上述的抗体药代动力学改善或者亲和性成熟技术，在降低必要抗 体给药量方面存在限制。因此，为了用抗原量以下的抗体量来使抗原的中和效果持续目标 时间，需要用一个抗体来中和多个抗原。作为实现其的新方法，最近报道了 PH和/或金属 离子浓度依赖性地与抗原结合的抗原结合分子（专利文献1和2)。在血浆中的pH中性和 /或高钙离子浓度条件下与抗原强结合、在内体内的pH酸性和/或低钙离子浓度条件下从 抗原解离的离子浓度依赖性抗原结合分子，其可在内体内从抗原解离。离子浓度依赖性抗 原结合分子解离抗原后，若该分子通过FcRn再循环至血浆中，则可再次与抗原结合。因此， 一个离子浓度依赖性抗原结合分子可重复结合多个抗原。
[0005] 另一方面，与结合至FcRn而被再循环的抗体相比，抗原的血浆中滞留性非常短。 然而，即使抗原自身的血浆中滞留性短，若是这种血浆中滞留性长的普通抗体与该抗原结 合，那么抗体抗原复合体的血浆中滞留性也变得与抗体一样长。因此，通常，如果给予抗体， 那么由于该抗体结合的抗原以抗体抗原复合体的形式存在，准确地说，血浆中滞留性变长 (难以从血浆中消除），故而血浆中的抗原浓度上升。另一方面，离子浓度依赖性抗原结合 分子可通过在内体内从抗原解离来抑制血浆中抗原浓度的上升。但是，上述对血浆中抗原 浓度上升的抑制受到与该抗原在体内产生的量的平衡的影响。因此还考虑了，存在通过给 予这样的离子浓度依赖性抗原结合分子却使血浆中抗原浓度与给予该分子前相比上升的 情况的可能性（专利文献3)。
[0006] 最近，制作了在中性条件下具有FcRn结合的抗原结合分子。已发现，通过给予离 子浓度依赖性地与抗原结合、在中性条件下具有FcRn结合的抗原结合分子，可使血浆中抗 原浓度与给予该分子前相比降低（专利文献3)。与普通抗体通过给予抗体使血浆中抗原浓 度上升相比，在pH中性条件下具有FcRn结合活性的抗原结合分子和离子浓度依赖性地与 抗原结合、在PH中性条件下具有FcRn结合活性的抗原结合分子可通过给予该分子使血浆 中抗原浓度降低。这样的抗原结合分子可经由作为与FcRn结合的结果所引起的胞吞作用 主动地从血浆中除去抗原，因此作为药物极其有用。
[0007] 另一方面，作为IgG受体，除了 FcRn之外，还存在多种Fe Y受体（Fe Y RI、 Fe Y Rlla、Fe Y Rllb、Fe Y RIIIa)(非专利文献9)。抗体的活性型Fe Y受体结合活性在 抗体的细胞毒活性中发挥重要作用，因此，迄今开发了通过增强活性型Fe Y受体结合活性 增强了细胞毒活性的以膜型抗原为靶标的抗体（非专利文献10、11)。同样地，抑制型Fe Y 受体（FcYRIIb)结合活性在免疫抑制活性（非专利文献12、13、14)、激动活性（非专利文 献15、16)等中发挥重要作用，因此，抑制型Fe Y受体结合活性增强的以膜型抗原为靶标的 抗原的研究正在进行中（非专利文献17、18)。
[0008] 对于与可溶型抗原结合的抗体对FeY结合的影响，主要从副作用的观点进行了 研究。例如，已知在给予了抗VEGF抗体贝伐单抗（bevacizumab)的患者组中血栓栓塞风 险上升（非专利文献19)。另外，在抗CD40配体抗体的临床开发试验中，也同样地观察到 血栓栓塞，中止了临床试验（非专利文献20)。在血小板细胞上发现了活性型Fe Y受体 Fe Y RIIa而非抑制型Fe Y受体Fe Y RIIb (非专利文献21)，但是通过之后使用动物模型 等的研究表明，给予的任一抗体均经由与血小板上Fe Y RIIa的结合使血小板聚集，其结果 形成血栓（非专利文献22、非专利文献23)。据报道，在自身免疫疾病之一的系统性红斑狼 疮患者中，通过Fe Y RIIa依赖性机制活化血小板，血小板的活化与严重性相关（非专利文 献24)。另外，有报道称，使用增强了 Fe Y RIIb结合的抗体作为药物时，可望降低抗抗体的 产生风险（非专利文献25)，膜型抗原结合抗体的Fe Y RIIa结合增强的抗体增强树突细胞 或巨噬细胞介导的抗体依赖性吞噬活性（ADCP)(非专利文献26)。然而，以可溶型抗原为 靶标的抗体的活性型和/或抑制型Fe Y受体结合活性对于给予了该抗体的机体中该抗体 或该抗体所结合的抗原的血浆中动力学的效果尚属未知。
[0009] 现有技术文献 专利文献 专利文献 I :W02009/125825 专利文献 2 :W02012/073992 专利文献 3 :W02011/122011 非专利文献 非专利文献 I :Janice M Reichert，Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic. , Nat. Biotechnol. (2005) 23， 1073-1078 非专利文献 2 :Pavlou AKj Belsey MJ. , The therapeutic antibodies market to 2008., Eur. J. Pharm. Biopharm., (2005) 59 (3), 389-396 非专利文献 3 :Kim SJj Park Y， Hong HJ.， Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies.， Mol. Cells， （2005) 20 (1)， 17-29 非专利文献4 :Hinton PR, Xiong JM，Johlfs MG, Tang MT, Keller S，Tsurushita N. , An engineered human IgGl antibody with longer serum half-life.，J. Immunol. (2006) 176 (1)， 346-356 非专利文献5 :Ghetie V，Popov S，Borvak J，Radu C，Matesoi D，Medesan C，Ober RJj Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis.， Nat. Biotechnol. 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【发明内容】

[0010] 发明所要解决的技术问题 本发明乃鉴于上述情况而完成。如前所述，以可溶型抗原为靶标的抗体与活性型和/ 或抑制型Fe Y受体的结合活性对给予了该抗体的机体中该抗体或该抗体所结合的抗原的 血浆中动力学的效果尚属未知。即，本发明的课题在于，通过给予具有对血浆中以可溶型存 在的病因抗原的结合活性、对活性型和/或抑制型Fe Y受体具有所需的结合活性的抗原结 合分子，来抑制该分子所结合的抗原的血浆中浓度的上升。本发明的课题还在于，通过优化 抗血浆中以可溶型存在的病因抗原的抗原结合分子对活性型和/或抑制型Fe Y受体的结 合活性，来优化对该分子所结合的抗原的血浆中浓度上升的抑制。
[0011] 用于解决技术问题的手段 艮P，本发明提供：抗原结合分子，其包含（i)对抗原的结合活性随离子浓度条件而变 化的抗原结合结构域、（ii)具有FcYRIIb选择性结合活性的Fcy结合结构域和（iii)在 pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域；和使该抗原的血楽中浓度与给 予该分子前相比降低的方法，其包括给予该分子。此外，本发明提供抗原的血浆中浓度的降 低剂，其包含含有下述结构的抗原结合分子：（i)对该抗原的结合活性随离子浓度条件而 变化的抗原结合结构域、（ii)具有Fe Y RIIb选择性结合活性的Fe Y结合结构域和（iii) 在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域。本发明还提供药物组合物， 其包含含有下述结构的抗原结合分子：（i)对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗 原结合结构域、（ii)具有Fe Y RIIb选择性结合活性的Fe Y结合结构域和（iii)在pH酸 性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域。此外，本发明提供含有下述结构的 该分子在使抗原的血浆中浓度降低中的使用：（i)对该抗原的结合活性随离子浓度条件而 变化的抗原结合结构域、（ii)具有Fe Y RIIb选择性结合活性的Fe Y结合结构域和（iii) 在PH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域。除上述之外，本发明还提供 该分子的制备方法和/或筛选方法。并非旨在特别受以下的限定，作为非限定的一个方案， 具体提供以下内容：
[1]抗原结合分子在使抗原从血浆中消除中的使用，其中，所述抗原结合分子包含对 该抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和以EU编号表示的238位的 氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly的Fc区；
[2] [1]的使用，其中，所述Fe区为选自以EU编号表示的下述位置的至少一个以上的 氨基酸进一步被取代的Fe区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、 269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356 位、 358位、396位、409位和419位；
[3] [2]的使用，其中，所述Fe区含有以EU编号表示的下述位置的氨基酸中的任一个 以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为Ile， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gln中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gln中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272位的氨基酸为Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一个， 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Glu， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu ;
[4] [1]~[3]中任一项的使用，其中，所述抗原结合结构域为对所述抗原的结合活性随 钙离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；
[5] [4]的使用，其中，所述抗原结合结构域为结合活性以下述方式变化的抗原结合结 构域：在低钙离子浓度条件下对所述抗原的结合活性比在高钙离子浓度条件下对所述抗原 的结合活性低；
[6] [ir[3]中任一项的使用，其中，所述抗原结合结构域为对所述抗原的结合活性随 pH条件而变化的抗原结合结构域；
[7] [6]的使用，其中，所述抗原结合结构域为结合活性以下述方式变化的抗原结合 结构域：在pH酸性范围条件下对所述抗原的结合活性比在pH中性范围条件下的结合活性 低；
[8] [ir[7]中任一项的使用，其中，所述抗原结合结构域为抗体的可变区；
[9] [1]?[8]中任一项的使用，其中，所述Fc区为在SEQ ID NO: 14、15、16或17的任 一个中含有的Fc区中以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly的 Fc区；
[10] [1]~[8]中任一项的使用，其中，所述Fc区在pH酸性范围条件下的FcRn结合活 性与SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一个中含有的Fc区的FcRn结合活性相比增强；
[11] [10]的使用，其中，所述增强的Fc区为在SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一个 中含有的Fc区的氨基酸序列中选自以EU编号表示的下述位置的至少一个以上的氨基酸被 取代的 Fc 区：244 位、245 位、249 位、250 位、251 位、252 位、253 位、254 位、255 位、256 位、 257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285 位、286 位、288 位、 293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316 位、317 位、318 位、 332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376 位、377 位、378 位、 380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415 位、423 位、424 位、 427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439 位、440 位、442 位 或447位；
[12] [11]的使用，其中，所述增强的Fc区在SEQ ID NO: 14、15、16或17中含有的 Fc区的氨基酸序列中含有选自以EU编号表示的下述位置的氨基酸的至少一个以上的氨基 酸： 244位的氨基酸为Leu， 245位的氨基酸为Arg, 249位的氨基酸为Pro， 250位的氨基酸为Gln或Glu中的任一个，或者 251位的氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个， 252位的氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个， 254位的氨基酸为Ser或Thr中的任一个， 255位的氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个， 256 位的氨基酸为 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一个， 257位的氨基酸为Ala、lie、Met、Asn、Ser或Val中的任一个， 258位的氨基酸为Asp， 260位的氨基酸为Ser， 262位的氨基酸为Leu， 270位的氨基酸为Lys， 272位的氨基酸为Leu或Arg中的任一个， 279 位的氨基酸为 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任 一个， 283 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、 Trp或Tyr中的任一个， 285位的氨基酸为Asn， 286位的氨基酸为Phe， 288位的氨基酸为Asn或Pro中的任一个， 293位的氨基酸为Val， 307位的氨基酸为Ala、GliuGln或Met中的任一个， 308位的氨基酸为lie、Pro或Thr中的任一个， 309位的氨基酸为Pro， 311 位的氨基酸为 Ala、Glu、lie、Lys、Leu、Met、Ser、Val 或 Trp 中的任一个， 312位的氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个， 314位的氨基酸为Ala或Leu中的任一个， 316位的氨基酸为Lys， 317位的氨基酸为Pro， 318位的氨基酸为Asn或Thr中的任一个， 332 位的氨基酸为 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一个， 339位的氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个， 341位的氨基酸为Pro， 343位的氨基酸为Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr或Tyr中的任一个， 375位的氨基酸为Arg， 376位的氨基酸为Gly、lie、Met、Pro、Thr或Val中的任一个， 377位的氨基酸为Lys， 378位的氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个， 380位的氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个， 382 位的氨基酸为 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个， 385 位的氨基酸为 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一个， 386 位的氨基酸为 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个， 387位的氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个， 389位的氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个， 423位的氨基酸为Asn， 427位的氨基酸为Asn， 428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个， 430 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一个， 431位的氨基酸为His或Asn中的任一个， 433位的氨基酸为Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro或Ser中的任一个， 434位的氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一个， 436 位的氨基酸为 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一个， 438位的氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个， 440位的氨基酸为Lys，或者， 442位的氨基酸为Lys ;
[13] [ir[i2]中任一项的使用，其中，所述抗原结合分子为抗体；
[14] 药物组合物，其包含含有下述结构的抗原结合分子：对抗原的结合活性随离子浓 度条件而变化的抗原结合结构域和以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨 基酸为Gly的Fc区；
[15] [14]的药物组合物，其中，所述Fc区为选自以EU编号表示的下述位置的至少一 个以上的氨基酸进一步被取代的Fc区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267 位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356位、358位、396位、409位和419位；
[16] [15]的药物组合物，其中，所述Fc区含有以EU编号表示的下述位置的氨基酸中 的任一个以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为Ile， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gln中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gln中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272位的氨基酸为Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一个， 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Glu， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu ;
[17] 抗原结合分子的制备方法，其包括以下（a)~(e)的步骤： (a) 获得对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的步骤， (b) 获得编码在所述步骤（a)中选择的抗原结合结构域的基因的步骤， (c) 将在所述步骤（b)中获得的基因与编码以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、 且271位的氨基酸为Gly的Fe区的基因有效连接的步骤， (d) 培养含有在所述步骤（c)中有效连接的基因的宿主细胞的步骤， (e) 从在所述步骤（d)中获得的培养液分离抗原结合分子的步骤；
[18] [17]的制备方法，其中，所述Fc区为选自以EU编号表示的下述位置的至少一个 以上的氨基酸进一步被取代的Fc区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、 268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、 356 位、358 位、396 位、409 位和 419 位；
[19] [18]的制备方法，其中，所述Fc区含有以EU编号表示的下述位置的氨基酸中的 任一个以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为Ile， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gln中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gln中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272位的氨基酸为Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一个， 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Met， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu ;
[20] 包含抗原结合分子的药物组合物的制备方法，其包括以下（a)~(e)的步骤： (a) 获得对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的步骤， (b) 获得编码在所述步骤（a)中选择的抗原结合结构域的基因的步骤， (c) 将在所述步骤（b)中获得的基因与编码以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、 且271位的氨基酸为Gly的Fe区的基因有效连接的步骤， (d) 培养含有在所述步骤（c)中有效连接的基因的宿主细胞的步骤， (e) 从在所述步骤（d)中获得的培养液分离该抗原结合分子的步骤；
[21] [20]的制备方法，其中，所述Fe区为选自以EU编号表示的下述位置的至少一个 以上的氨基酸进一步被取代的Fe区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、 268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、 356 位、358 位、396 位、409 位和 419 位；
[22] [21]的制备方法，其中，所述Fe区含有以EU编号表示的下述位置的氨基酸中的 任一个以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为Ile， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gln中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gln中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272位的氨基酸为Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一个， 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Glu， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu ;
[23] 使抗原从血浆中消除的方法，其包括给予有效量的含有下述结构的抗原结合分 子的步骤：对该抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和以EU编号表 示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly的Fc区；
[24] [23]的方法，其中，所述Fc区为选自以EU编号表示的下述位置的至少一个以上 的氨基酸进一步被取代的Fc区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356 位、358位、396位、409位和419位；
[25] [24]的方法，其中，所述Fc区含有以EU编号表示的下述位置的氨基酸中的任一 个以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为Ile， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gln中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gln中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272位的氨基酸为Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gln中的任一个， 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Glu， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu ;
[26] [23]~[25]中任一项的方法，其中，所述抗原结合结构域为对所述抗原的结合活 性随钙离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；
[27] [26]的方法，其中，所述抗原结合结构域为结合活性以下述方式变化的抗原结合 结构域：在低钙离子浓度条件下对所述抗原的结合活性比在高钙离子浓度条件下对所述抗 原的结合活性低；
[28] [23]~[25]中任一项的方法，其中，所述抗原结合结构域为对所述抗原的结合活 性随pH条件而变化的抗原结合结构域；
[29] [28]的方法，其中，所述抗原结合结构域为结合活性以下述方式变化的抗原结合 结构域：在pH酸性范围条件下对所述抗原的结合活性比在pH中性范围条件下的结合活性 低；
[30] [23]~[29]中任一项的方法，其中，所述抗原结合结构域为抗体的可变区；
[31] [23]?[30]中任一项的方法，其中，所述？(：区为在5￡〇10勵：14、15、16或17的 任一个中含有的Fc区中以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly 的Fc区；
[32] [23]~[30]中任一项的方法，其中，所述Fc区在pH酸性范围条件下的FcRn结合 活性与SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一个中含有的Fe区的FcRn结合活性相比增强；
[33] [32]的方法，其中，所述增强的Fe区为在SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一个 中含有的Fe区的氨基酸序列中选自以EU编号表示的下述位置的至少一个以上的氨基酸被 取代的 Fe 区：244 位、245 位、249 位、250 位、251 位、252 位、253 位、254 位、255 位、256 位、 257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285 位、286 位、288 位、 293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316 位、317 位、318 位、 332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376 位、377 位、378 位、 380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415 位、423 位、424 位、 427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439 位、440 位、442 位 或447位；
[34] [33]的方法，其中，所述增强的Fe区在SEQ ID NO: 14、15、16或17中含有的Fe 区的氨基酸序列中含有选自以EU编号表示的下述位置的氨基酸中的至少一个以上的氨基 酸： 244位的氨基酸为Leu， 245位的氨基酸为Arg, 249位的氨基酸为Pro， 250位的氨基酸为Gln或Glu中的任一个，或者 251位的氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个， 252位的氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个， 254位的氨基酸为Ser或Thr中的任一个， 255位的氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个， 256 位的氨基酸为 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一个， 257位的氨基酸为Ala、lie、Met、Asn、Ser或Val中的任一个， 258位的氨基酸为Asp， 260位的氨基酸为Ser， 262位的氨基酸为Leu， 270位的氨基酸为Lys， 272位的氨基酸为Leu或Arg中的任一个， 279 位的氨基酸为 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任 一个， 283 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、 Trp或Tyr中的任一个， 285位的氨基酸为Asn， 286位的氨基酸为Phe， 288位的氨基酸为Asn或Pro中的任一个， 293位的氨基酸为Val， 307位的氨基酸为Ala、GliuGln或Met中的任一个， 308位的氨基酸为lie、Pro或Thr中的任一个， 309位的氨基酸为Pro， 311 位的氨基酸为 Ala、Glu、lie、Lys、Leu、Met、Ser、Val 或 Trp 中的任一个， 312位的氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个， 314位的氨基酸为Ala或Leu中的任一个， 316位的氨基酸为Lys， 317位的氨基酸为Pro， 318位的氨基酸为Asn或Thr中的任一个， 332 位的氨基酸为 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一个， 339位的氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个， 341位的氨基酸为Pro， 343位的氨基酸为Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr或Tyr中的任一个， 375位的氨基酸为Arg， 376位的氨基酸为Gly、lie、Met、Pro、Thr或Val中的任一个， 377位的氨基酸为Lys， 378位的氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个， 380位的氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个， 382 位的氨基酸为 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个， 385 位的氨基酸为 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一个， 386 位的氨基酸为 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个， 387位的氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个， 389位的氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个， 423位的氨基酸为Asn， 427位的氨基酸为Asn， 428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个， 430 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一个， 431位的氨基酸为His或Asn中的任一个， 433位的氨基酸为Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro或Ser中的任一个， 434位的氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一个， 436 位的氨基酸为 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一个， 438位的氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个， 440位的氨基酸为Lys，或者， 442位的氨基酸为Lys ;
[35] [23]~[34]中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为抗体。
[0012] 本发明中，以下表述以彼此相同的含义使用："抗原结合分子在使抗原从血浆中消 除中的使用，其中，所述抗原结合分子包含对该抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的 抗原结合结构域和以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly的Fc 区"，和"起因于抗原的疾病的治疗方法，其包括给予含有下述结构的抗原结合分子：对该抗 原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和以EU编号表示的238位的氨基 酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly的Fe区";以及"药物组合物，其包含含有下述结构的抗 原结合分子：对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和以EU编号表 示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly的Fe区"，"抗原结合分子在制备药 物组合物中的使用，其中，所述抗原结合分子包含对抗原的结合活性随离子浓度条件而变 化的抗原结合结构域和以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly 的Fe区"，和"制备药物组合物的方法，其包括使用含有下述结构的抗原结合分子的步骤： 对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和以EU编号表示的238位的 氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly的Fe区"。

【专利附图】

【附图说明】
[0013][图1]是表示与现有的中和抗体相比，通过给予增强了中性pH下的Fcy受体结 合的的离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体，可溶型抗原从血浆中消除的非限定的作用机 制的图。
[0014][图2]是显示将H54/L28-IgGl或pH依赖性地与人IL-6受体结合的Fv4-IgGl给 予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0015][图3]是显示将pH依赖性地与人IL-6受体结合的Fv4-IgGl、没有小鼠Fe Y R结 合的Fv4-IgGl的改变体即Fv4-IgGl-F760、增强了小鼠Fe Y R结合的Fv4-IgGl的改变体即 Fv4-IgGl-F1022或Fv4-IgGl的低岩藻糖型抗体即Fv4-IgGl-Fuc给予人FcRn转基因小鼠 时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0016][图 4]是显示将含有 Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1022 和 Fv4-IgGl-F1022 的改变体即 提高了 pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-IgGl-F1093作为重链的抗原结合分子给予人FcRn 转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0017][图 5]是显示将含有 Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1022 和 Fv4-IgGl-F1022 的改变体即 提高了 pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-IgGl-F1093作为重链的抗原结合分子给予人FcRn 转基因小鼠时的该小鼠血浆中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。
[0018][图6]是显示将Fv4-IgGl、增强了小鼠Fe YR结合的（特别是对小鼠Fe yRIIb、 小鼠Fe YRIII的结合得到增强）Fv4-IgGl的改变体即Fv4-IgGl-F1087和增强了小鼠 Fe Y R结合的（特别是对小鼠Fe Y RI、小鼠Fe Y RIV的结合得到增强）Fv4-IgGl的改变体 即Fv4-IgGl-F1182给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的 图。
[0019][图7]是显示将Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1087和提高了 pH酸性范围的FcRn结合 的 Fv4-IgGl-F1087 的改变体即 Fv4-IgGl-Fl 180、Fv4-IgGl-F1412 给予人 FcRn 转基因小鼠 时的该小鼠血浆中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。
[0020][图8]是显示将Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1182和提高了 pH酸性范围的FcRn结合 的Fv4-IgGl-F1182的改变体即Fv4-IgGl-F1181给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆 中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。
[0021][图9]是显示将Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1087和提高了 pH酸性范围的FcRn结合 的 Fv4-IgGl-F1087 的改变体即 Fv4-IgGl-Fl 180、Fv4-IgGl-F1412 给予人 FcRn 转基因小鼠 时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0022] [图10]是显示将Fv4-IgGl、Fv4-IgGl-F1182和提高了 pH酸性范围的FcRn结合 的Fv4-IgGl-F1182的改变体即Fv4-IgGl-F1181给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆 中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0023][图11]是显示将？￥41^61、对小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的结合增强了的 Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl-mF44和对小鼠Fe Y Rllb、小鼠Fe Y RIII的结合进一步 增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl-mF46给予正常小鼠时的该小鼠血浆中人IL-6 受体的浓度变化的图。
[0024][图12]是显示将？￥41^61、对小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的结合增强了的 Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl-mF44和对小鼠Fe Y Rllb、小鼠Fe Y RIII的结合进一步 增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl-mF46给予Fe Y RIII缺失小鼠时的该小鼠血浆 中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0025][图13]是显示将？￥41^61、对小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的结合增强了的 Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl-mF44和对小鼠Fe Y Rllb、小鼠Fe Y RIII的结合进一步 增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl-mF46给予Fc受体Y链缺失小鼠时的该小鼠 血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0026][图14]是显示将？￥41^61、对小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的结合增强了的 Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl-mF44和对小鼠Fe Y Rllb、小鼠Fe Y RIII的结合进一步 增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl-mF46给予Fe Y RIIb缺失小鼠时的该小鼠血浆 中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0027][图15]是显示使用具有Fe Y RIIa多态性（R/H)的来自供体的血小板的血小板聚 集测定中奥马珠单抗-Gld-v3/IgE免疫复合体的血小板聚集能力的评价结果的图。
[0028][图16]是显示使用具有Fe Y RIIa多态性（H/H)的来自供体的血小板的血小板聚 集测定中奥马珠单抗-Gld-v3/IgE免疫复合体的血小板聚集能力的评价结果的图。
[0029][图17]是表示评价洗涤血小板的膜表面的⑶62p表达的结果的图。用黑色涂覆 的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，图形的中央未涂覆者显示与免 疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果的图。
[0030][图18]是表示评价洗涤血小板的膜表面的活性型整联蛋白表达的结果的图。用 黑色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，图形的中央未涂覆者 显示与免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果的图。
[0031][图19]横轴表示各ro变体对FeYRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各ro变 体对FeYRIIa R型的相对结合活性的值。将各H)变体对各FeYR的结合量的值除以作为 对照的导入改变前的抗体IL6R-F652/IL6R-L (IL6R-F652是SEQ ID NO: 61规定的含有以 EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变Fc的抗体重链）对各FeYR的结合量的值， 进而乘以100倍，将所得的值作为各变体对各FeYR的相对结合活性的值。图中的F652 点图显示IL6R-F652/IL6R-L的值。
[0032][图20]纵轴显示将各改变导入不具有P238D改变的GpH7-B3(SEQ ID NO: 63)/ GpL16-kO中而得的改变体对Fe Y RIIb的相对结合活性的值，横轴显示将各改变导入具有 P238D改变的IL6R-F652(SEQ ID NO: 61)/IL6R-L中而得的改变体对FcyRIIb的相对结 合活性的值。应予说明，将各改变体对Fe Y RIIb的结合量的值除以导入改变前的抗体对 FcYRIIb的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为相对结合活性的值。这里，导入 到不具有P238D的GpH7-B3/GpL16-kO中的情形、导入到具有P238D的IL6R-F652/IL6R-L 中的情形均发挥对Fe Y RIIb的结合增强效果的改变含有在区A中；在导入到不具有P238D 的GpH7-B3/GpL16-kO中的情形发挥对Fe Y RIIb的结合增强效果，但在导入到具有P238D 的IL6R-F652/IL6R-L中的情形不发挥对Fe Y RIIb的结合增强效果的改变含有在区B中。
[0033][图21]表示Fe (P238D)/Fe YRIIb胞外区复合体的晶体结构。
[0034][图22]表示相对于FeYRIIb胞外区以及Fe CH2结构域A，通过基于C a原子间 距的最小二乘法，使Fe(P238D)/FeY RIIb胞外区复合体的晶体结构与Fe(WT)/FeY RIIb胞 外区复合体的模型结构叠合的图。
[0035][图23]表示对于Fe (P238D) /Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构与Fe (WT) / Fe Y RIIb胞外区复合体的模型结构，以Fe CH2结构域A以及Fe CH2结构域B各自单独通 过基于C a原子间距的最小二乘法进行叠合，并对P238D附近的详细结构进行比较的图。
[0036][图24]是示出在Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构中，在Fe CH2结 构域A的以EU编号表示的237位的Gly的主链和Fe Y RIIb的160位的Tyr之间观察到氢 键的图。
[0037][图25]是示出在Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构中，在Fe CH2结 构域B的以EU编号表示的270位的Asp和Fe Y RIIb的131位的Arg之间观察到静电相互 作用的图。
[0038][图26]横轴表示各2B变体对Fe Y RIIb的相对结合活性的值、纵轴表示各2B变 体对Fe Y RIIa R型的相对结合活性的值。将各2B变体对各Fe Y R的结合量的值除以作 为对照的导入改变前的抗体（以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变Fe)对各 Fe Y R的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各2B变体对各Fe Y R的相对结合活 性的值。
[0039][图27]是表示Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构中Fe链A的以EU 编号表示的233位的Glu与Fe Y RIIb胞外区的其周边残基的图。
[0040][图28]是表示Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构中Fe链A的以EU 编号表示的330位的Ala与Fe Y RIIb胞外区的其周边残基的图。
[0041][图29]是示出相对于Fe链B，通过基于Ca原子间距的最小二乘法，使 Fe (P238D) /Fe Y RIIb胞外区复合体和Fe (WT) /Fe Y RIIIa胞外区复合体的晶体结构叠合， Fe链B的以EU编号表示的271位的Pro的结构的图。
[0042][图30]是通过X射线晶体结构分析确定的Fe (P208) /Fe Y RIIb胞外区复合体的 图。就Fe部分的CH2结构域、CH3结构域各自而言，位于左侧者为结构域A，位于右侧者为 结构域B。
[0043][图31]是将通过X射线晶体结构分析确定的Fc(P208)/Fe Y RIIb胞外区复合 体的结构与Fe (WT)/Fe Y RIIa胞外区复合体的结构（PDB码：3RY6)，在Fe部分CH2结构 域A中，通过基于Ca原子间距的最小二乘法进行叠合，并进行了比较的图。图中，用粗 线描画的部分为Fe (P208)/Fe Y RIIb胞外区复合体的结构，用细线描画的部分为Fe (WT) / Fe Y RIIa胞外区复合体的结构。应予说明，在Fe (WT) /Fe Y RIIa胞外区复合体的结构中，仅 描画了 Fe部分的CH2结构域A。
[0044][图32]是显示在Fc(P208)/Fe YRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，与 Fe Y RIIb的160位的Tyr在主链部分形成氢键的Fe部分CH2结构域A的以EU编号表示的 237位的Asp附近的详细结构的图。
[0045][图33]是显示在Fc(P208)/Fe YRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，与 Fe Y RIIb的160位的Tyr在主链部分形成氢键的Fe部分CH2结构域A的以EU编号表示的 237位的Asp侧链周围的氨基酸残基的结构的图。
[0046][图34]是实施例10中显示的、将Fe (P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的X射线 晶体结构和Fe (P208)/Fe Y RIIb胞外区复合体的X射线晶体结构在Fe部分CH2结构域B 中通过基于C a原子间距的最小二乘法进行叠合，对于以EU编号表示的266位~271位的 环周边进行比较的图。本环中，Fe (P208)与Fe (P238D)比较，以EU编号表示的268位具有 H268D改变，以EU编号表示的271位具有P271G改变。
[0047][图35]是在Fe (P208)/Fe YRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，将Fe部分 CH2结构域B的Ser239周边的结构与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2F〇-Fc系数 的电子密度一起显示的图。
[0048][图36]是将通过X射线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FeYRIIaR胞外区复合体 的立体结构与Fe(P208)/FeYRIIb胞外区复合体的立体结构，通过基于Ca原子间距的最 小二乘法进行叠合，并进行了比较的图。
[0049][图37]是将Fe (P208)/Fe Y RIIaR胞外区复合体的X射线晶体结构和Fe (P208)/ Fe Y RIIb胞外区复合体的X射线晶体结构，在Fe部分CH2结构域A的以EU编号表示的237 位的Asp附近，与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2F〇-Fc系数的电子密度一起进行 比较的图。
[0050][图38]是将Fe (P208)/Fe Y RIIaR胞外区复合体的X射线晶体结构和Fe (P208)/ Fe Y RIIb胞外区复合体的X射线晶体结构，在Fe部分CH2结构域B的以EU编号表示的237 位的Asp附近，与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2F〇-Fc系数的电子密度一起进行 比较的图。
[0051][图39]是比较Gld和G4d的恒定区序列的图；图中，以粗框包围的氨基酸表示Gld 和G4d中的不同氨基酸残基位点。
[0052][图40]是显示正常小鼠中GA2-IgGl和GA2-F1087的血浆中抗体浓度变化的图。
[0053][图41]是显示给予了 GA2-IgGl和GA2-F1087的正常小鼠中的血浆中hlgA浓度 变化的图。
[0054][图42]是显示正常小鼠中GA2-IgGl和GA2-F1087的血浆中抗体浓度变化的图。
[0055][图 43]是给予了 278-IgGl 和 278-F1087 的 C57BL/6J 小鼠中的血浆中 hlgE (Asp6)浓度变化的图。
[0056][图44]是显示将Fv4-mIgGl和对小鼠Fe Y RIIb的结合增强了的Fv4-mIgGl的改 变体即Fv4-mIgGl-MB367给予正常小鼠时的该小鼠血浆中的抗人IL-6受体小鼠抗体浓度 变化的图。
[0057][图45]是显示将？￥4111861和对小鼠？(^1?1113的结合增强了的？ ￥4111861的改 变体即Fv4-mIgGl-MB367给予正常小鼠时的该小鼠血浆中的可溶型人IL-6受体浓度变化 的图。

【具体实施方式】
[0058] 提供以下的定义和详细说明来使本说明书中说明的本发明容易理解。
[0059] 氨某酸 本说明书中，例如，如 Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、 Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V 所表示，将 氨基酸以单字母密码或三字母密码或者这两者标记。
[0060] 氨某酸的改夺 为了改变抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可适宜采用位点特异性诱变法 (Kunkel 等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82，488-492))或重叠延伸 PCR等公 知的方法。通过这些公知的方法可适宜进行氨基酸的添加、缺失和/或取代。取代氨基酸 残基是指以通过取代成其它氨基酸残基例如就以下（a)~(c)的方面进行改变为目的： (a) 折叠结构或螺旋结构的区域中的多肽的主链结构； (b) 靶位点中的电荷或疏水性；或 (c) 侧链的大小。
[0061] 氨基酸残基根据其结构所含的侧链的特性被分类为以下的组： (1) 疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ; (2) 中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ; (3) 酸性：Asp、Glu; ⑷碱性：His、Lys、Arg ; (5) 影响链取向的残基：Gly、Pro;以及 (6) 芳族性：Trp、Tyr、Phe。
[0062] 这些的在各组内的氨基酸残基的取代称为保守取代，而在不同组之间的氨基酸残 基的取代称为非保守取代。本发明中的取代可以是保守取代，也可以是非保守取代，还可以 是保守保守取代与非保守取代的组合。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基 酸改变方法，也可采用多种公知的方法（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35，225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. (2003) 100 (11)，6353-6357)。还可适 宜使用例如：含有作为终止密码子之一的UAG密码子（琥珀密码子）的互补琥珀抑制基 因tRNA上连接有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统（Clover Direct (Protein Express))等。
[0063] 此外，作为表示氨基酸改变的表述，可适宜采用：在表示特定位置的数字的前后使 用改变前和改变后的氨基酸的单字母密码的表述。例如，在抗体恒定区所含的Fc区中加入 氨基酸取代时，所使用的P238D的改变表示以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp。艮P， 数字表示以EU编号表示的氨基酸的位置，其之前记载的氨基酸的单字母密码表示取代前 的氨基酸，其之后记载的氨基酸的单字母密码表示取代后的氨基酸。
[0064]和 / 或 本说明书中，"和/或"用语的含义是指熟语"和/或"的前后用语的组合，含有"和"与 "或"适宜组合的所有组合。具体而言，例如，"326位、328位和/或428位的氨基酸被取代" 包括以下的氨基酸的改变的变异： (a) 326 位，（b) 328 位，（c) 428 位，（d) 326 位和 328 位，（e)326 位和 428 位，（f) 328位和428位，（g) 326位、328位和428位。
[0065]抗原 本说明书中，"抗原"只要含有抗原结合结构域所结合的表位，则其结构并不限于特 定的结构。换而言之，抗原可以是无机物也可以是有机物。作为抗原，可例示如下所述的 分子：17-从、4-188、40。、6-酮-?6?13、8-异-?6?23、8-氧代-(16、41腺苷受体、433、八〇￡、 ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、 激活素 RIB ALK-4、激活素 RIIA、激活素 RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/ TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素（Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、 ALK-1、ALK-7、a -1-抗胰蛋白酶、a -V/P-1 拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、 APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3 整联蛋白、Axl、b2M、 B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子（BlyS)、BACE、BACE-I、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、 BAK、Bax、BCA-I、BCAM、Bel、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BM、BLC、BL-CAM、BLK、 BMP、BMP-2、BMP-2a、BMP-3、成骨蛋白（Osteogenin)、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-I、 BMP-7 (OP-1)、BMP-8 (BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA (ALK-3)、BMPR-IB (ALK-6)、BRK-2、 RPK-I、BMPR-II (BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、 BTC、补体因子 3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、CIO、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原（CEA)、 癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶 E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶0、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/ Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCLl、CCLll、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、 CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、 CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、 CCR7、CCR8、CCR9、CDl、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、 CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、 CD30、CD30L、CD32、CD33(p67 蛋白）、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、 CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、 CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌 毒素、产气荚膜梭菌（Clostridium Perfringens)毒素、CKb8-l、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、 CNTN-1、COX、C-Re t、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CLI、CX3CRI、CXCL、CXCLI、CXCL2、 CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、 CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗 原、0八队00：、0^?3、0(：-516队补体抑制因子（衰变促进因子）、脱（1-3)-16?-1(脑16?-1)、 Dhh、地高辛、DNAM-I、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-Al、EDA-A2、EDAR、EGF、 EGFR(ErbB-I)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxin 1、EpCAM、 Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子 Ila、因子 VII、因子 VIIIc、因子 IX、 成纤维细胞活化蛋白（FAP)、Fas、FcRl、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、 FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、？1、？11?、？1卜3、？1卜4、促卵胞激素、0乂乂乂(：趋化因子、？201、？202、 FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、⑶2、⑶3、⑶F、 ⑶F-l、⑶F-3(Vgr-2)、⑶F-5(BMP-14、CDMP-1)、⑶F-6(BMP-13、CDMP-2)、⑶F-7(BMP-12、 CDMP-3)、⑶F-8 (Myostatin，肌肉生长抑制素）、⑶F-9、⑶F-15 (MIC-I)、⑶NF、⑶NF、GFAP、 GFRa-1、GFR-a 1、GFR-a 2、GFR-a 3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白 IIb/IIIa(GPIIb/ 111&)、61^3?、8?130、 8?72、61?0、生长激素释放因子、半抗原（咿-。&?或肌？-。&?)、冊46卩、 HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子（HGF)、H印B gpl20、乙醜肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB_2)、Her3(ErbB_3)、Her4(ErbB_4)、单纯疱疫病 毒（HSV) gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原（High molecular weight melanoma-associated antigen) (HMW-MAA)、HIV gpl20、HIV IIIB gp 120 V3 环、 HLA、HLA-DR、HM1. 24、HMFG ?￡]\1、111?、肚1^、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒0〇^)、人生长激素 (HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-I、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA 受体、IgE、IGF、 IGF 结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-I、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、 IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、 干扰素（INF)-a、INF-P、INF-Y、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长 因子1、整联蛋白a2、整联蛋白a3、整联蛋白a4、整联蛋白a4/01、整联蛋白a4/37、 整联蛋白a5(aV)、整联蛋白a5/01、整联蛋白a5/P3、整联蛋白a6、整联蛋白31、 整联蛋白P 2、干扰素Y、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、 激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放 酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子（KGF)、层连蛋白5、 LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型 TGF-1、潜伏型 TGF-I bpl、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y 抗原、Lewis-Y 相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选 择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素@受体、Mac-1、MAdCAM、 MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF 受体、MGMT、 MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-I-a、MK、MMACl、MMP、MMP-I、MMP-10、MMP-II、MMP-12、 MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、 粘蛋白（Mucl)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C 粘附因子、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4或神经营养素-6、Neurturin、神 经生长因子（NGF)、NGFR、NGF- P、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGGI、OPG、0PN、 OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙 黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘 碱性磷酸酶（PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺 特异性膜抗原（PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素 A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒（RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、 RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、 SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤 相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体（例如，T细胞受体a / p )、TdT、TECK、TEM1、 TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸 PLAP 样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF- a、TGF- P、TGF- P 泛特 异性（TGF-P Pan Specific)、TGF-P RI (ALK-5)、TGF-P RII、TGF-P RIIb、TGF-P RIII、 TGF-P 1、TGF-P 2、TGF-P 3、TGF-P 4、TGF-P 5、凝血酶、胸腺 Ck-1、促甲状腺激素、Tie、 TMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-a、TNF-a @、TNF-3 2、TNFc、 TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL Rl Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、 TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcRl、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、 TRUNDD)、TNFRSF1IA(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF1IB(OPG 0CIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、 TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD 120b、p75-80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4 (0X40 ACT35、TXGPl R)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-I、APTl、CD95)、TNFRSF6B (DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、 TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRHl), TNFRSF25 (DR3 Ap〇-3, LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配体、TL2)、TNFSFl I (TRANCE/RANK 配 体 ODF、OPG 配体）、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配体、DR3 配体）、TNFSF13 (APRIL TALL2)、 TNFSF13B(BAFF BLYS、TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配体、LTg)、 TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配体 AITR 配体、TL6)、TNFSFlA(TNF-a 黏附素 (Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、 TNFSF4(0X40 配体 gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40 配体 CD154、gp39、HIGM1、MD3、TRAP)、 TNFSF6 (Fas 配体 Apo-I 配体、APTl 配体）、TNFSF7 (CD27 配体 CD70)、TNFSF8 (CD30 配体 CD153)、TNFSF9(4-1BB 配体 CD137 配体）、TP-I、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-Rl、 TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原 CA125、肿瘤 相关抗原表达病毒Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-I、 VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-I (flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、 VEGI、VM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、 WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、 WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNTlI、WNT16、XCLl、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP、XPD、 HMGBl、IgA、A P、CD81、CD97、CD98、DDRl、DKKl、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、 氧化LDL、PCSK9、激肽释放酶原、RON、TMEM16F、S0D1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、 VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、NavL 1、NavL 2、NavL 3、NavL 4、NavL 5、NavL 6、 NavL 7、NavL 8、NavL 9、EPCR、Cl、Clq、Clr、Cls、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、 C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素、壳硬蛋白（sclerostin)、血纤 蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、因子V、因子Va、因子VII、因子Vila、因子 VIII、因子Villa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子Xlla、 因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI、tPA、纤溶酶原、纤溶 酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配 体蛋白聚糖-4、LPA、SlP以及用于激素和生长因子的受体。
[0066] 上述抗原的例示中也记载了受体，这些受体在血浆等生物流体中以可溶型存在 时，可与本发明的抗原结合分子形成复合体，所以，只要上述列举的受体以可溶型在血浆等 生物流体中存在，就可作为与本发明的抗原结合分子结合而形成本发明的复合体的抗原使 用。作为这样的可溶型受体的一个非限定的方案，可例示出例如Mullberg等（J. Immunol. (1994) 152 (10)，4958-4968)中记载的可溶型 IL-6R 即由 SEQ IDNO: 1 表示的 IL-6R 多 肽序列中1-357位氨基酸组成的蛋白质。
[0067] 上述抗原的例示中也记载了可溶型抗原，对该抗原所存在的溶液没有限定，该可 溶型抗原可存在于生物流体，即充斥于机体内的脉管或组织/细胞间的所有流体。作为一 个非限定的方案，本发明的抗原结合分子所结合的抗原可存在于细胞外液。细胞外液是脊 椎动物中血浆、组织间液体、淋巴液、密实的结缔组织、脑脊液、髓液、穿刺液或关节液等骨 和软骨中的成分、肺泡液（支气管肺泡灌洗液）、腹水、胸膜液、心包液、囊内液或眼房水（房 水）等细胞透过液（作为细胞的主动运输/分泌活动的结果而产生的各种腺腔内液体和消 化道腔等其他体腔内液体）的统称。
[0068] 表位 表示存在于抗原中的抗原决定簇的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗 原结合结构域所结合的抗原上的位点。所以，例如表位可通过其结构来定义。此外，也可以 通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多 肽时,还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。此外,表位为糖链时，也可以通过特 定的糖链结构来规定表位。
[0069] 线性表位是下述表位，其含有氨基酸一级序列被识别的表位。线性表位在固有序 列中典型地含有至少3个氨基酸，和最普通地含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个 氨基酸。
[0070] 与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级 序列并非是被识别表位的单一规定成分（例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗 体所识别的表位）。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体 结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，蛋白质分子折叠形成三维结构 时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定 表位的立体结构的方法包括例如：X射线晶体学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋 转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第 66卷、Morris(编）。
[0071] 结合活件 下述例示了通过含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表 位的结合的方法，但通过含有针对IL-6R以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分 子来确认对表位的结合的方法也可以基于下述例示而适宜实施。
[0072] 例如，含有针对IL-6R抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别存在于IL-6R分 子中的线性表位，可通过如下所示操作来确认。为了上述目的，合成了含有构成IL-6R的胞 外结构域的氨基酸序列的线性肽。该肽可化学地合成。或者，可以利用由SEQ ID NO: 2表示 的IL-6R的cDNA中编码相当于胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因步骤技术得到。 其次，对含有构成胞外结构域的氨基酸序列的线性肽和含有针对IL-6R的抗原结合结构域 的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA， 可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对IL-6R表达细 胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验， 可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
[0073] 此外，含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别立体结构表 位，这可如下进行确认。为了上述目的，制备了表达IL-6R的细胞。可举出：含有针对IL-6R 的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与IL-6R表达细胞接触时强烈地与该细胞结合， 但该抗原结合分子与经固定化的含有构成IL-6R胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质 上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指，对人IL-6R表达细胞的结合活性的80%以下、 通常50%以下、优选30%以下、特别优选15%以下的结合活性。
[0074] 作为测定对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达 细胞的结合活性的方法，可举出例如：Antibodies A Laboratory Manual记载的方法（Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)。S卩，可通过 以IL-6R表达细胞为抗原的ELISA或FACS (荧光活化细胞分选（fluorescence activated cell sorting))的原理来进行评价。
[0075] 在ELISA形式中，对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的 IL-6R表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将 被测多肽缔合物添加至固定有IL-6R表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的 酶标记抗体检测与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在FACS中，制作被测抗原结合分子 的稀释系列，确定相对于IL-6R表达细胞的抗体结合效价（titer)，由此可以比较被测抗原 结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性。
[0076] 被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通 过流式细胞仪检测。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置： FACSCantoTM II FACSAriaTM FACSArrayTM FACSVantageTM SE FACSCaliburTM (均为 BD Biosciences 公司的商品名） EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为 Beckman Coulter 公司的商品名）。
[0077] 例如，作为含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的抗原结合活 性的优选测定方法的一例，可举出以下方法。首先，将表达IL-6R的细胞与被测抗原结合分 子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分 子用适宜的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能 够以IOy g/ml至lOng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过FACSCalibur (BD公司）测定 荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software (BD公司） 进行分析而得的荧光强度即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原 结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
[0078] 含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子与某抗原结合分子共有 表位，这可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验 等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。
[0079] 具体而言，在交叉阻断试验中，包被微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白在候选竞争 抗原结合分子的存在下或不存在下经过预培养后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IL-6R 蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合 能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对 包被有IL-6R蛋白的孔的结合活性越降低。
[0080] 经由IL-6R蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结 合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合 物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试 验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体而言，公知的是 放射标记或突光标记等。
[0081] 与在候选竞争抗原结合分子的不存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行 比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20%、优选至少2(T50%、进一步优选至少50%的 含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是 与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。
[0082] 在鉴定含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的 结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位，这可通过比较两者的抗原结合 分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
[0083] 作为这种测定结合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通过比较被测抗原 结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外 的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗 原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如 与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
[0084] 此外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表 位，这可通过以下方法来评价。首先，制备表达IL-6R的细胞和表达在表位中导入了突变的 IL-6R的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液中添加被测抗 原结合分子和对照抗原结合分子。其次，用合适的缓冲液洗涤，向所得细胞悬浮液中添加能 够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的 细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur (BD公司）来测定。被测抗原结合分子和对照抗 原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例 如，能够以10 U g/ml至lOng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映 为使用CELL QUEST S〇ftware(BD公司）进行分析而得的荧光强度即几何平均值。即，通过 得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结 合分子的结合活性。
[0085] 本方法中，例如"实质上不与突变IL-6R表达细胞结合"可通过以下方法判断。首 先，用标记抗体染色与表达突变IL-6R的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分 子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得 的荧光强度可以使用CELL QUEST Software进行分析。由多肽缔合物存在下和不存在下的 几何平均值，根据下述的计算式算出该比较值（AGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子 的结合所带来的荧光强度的增加比例。
[0086] A Geo-Mean = Geo-Mean (多肽缔合物存在下）/Geo-Mean (多肽缔合物不存在下） 将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IL-6R表达细胞的结合量的几何平 均比较值（突变IL-6R分子AGeo-Mean值）与反映被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞 的结合量的AGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IL-6R表达细胞和IL-6R 表达细胞的AGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备为相互相 同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别IL-6R中的表位的抗原结合分子被用作对照抗 原结合分子。
[0087] 被测抗原结合分子相对于突变IL-6R表达细胞的AGeo-Mean比较值只要小于被 测抗原结合分子相对于IL-6R表达细胞的AGeo-Mean比较值的至少80%、优选50%、进一步 优选30%、特别优选15%，则认为"实质上不与突变IL-6R表达细胞结合"。求出Geo-Mean值 (几何平均）的计算式记载于 CELL QUEST Software User's Guide (BD biosciences 公 司）。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗 原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
[0088] 抗原结合结构域 本说明书中，"抗原结合结构域"只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构 域。作为这类结构域的实例，可优选举出例如：抗体的重链和轻链的可变区、机体内存在 的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称为A结构域的组件（国际公开 W02004/044011、W02005/040229)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白纤连蛋白中的蛋白结合结 构域10Fn3结构域的Adnectin (国际公开W02002/032925)、以构成蛋白A的含有58个氨基 酸的3个螺旋束（bundle)的IgG结合结构域为支架的Affibody (国际公开W01995/001937)、 具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基重复重叠而成的结构的 锚蛋白重复序列（ankyrin repeat :AR)的分子表面露出的区域DARPins (Designed Ankyrin R印eat proteins)(国际公开W02002/020565)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋 白（neutrophil gelatinase-associated Iipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度 保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区即Anticalin等（国 际公开W02003/029462)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得免疫系统且不具有免疫球蛋 白结构的可变性淋巴细胞受体（variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸残基 的重复（leucine-rich-repeat(LRR))组件重复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型 片结构的凹陷区域（国际公开W02008/016854)。作为本发明的抗原结合结构域的优选实 例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域 的实例，优选可举出"scFv(单链Fv) "、"单链抗体"、"Fv"、"scFv2(单链Fv2) "、"Fab"或 "F(ab'）2" 等。
[0089] 本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同 的表位可以存在于例如含有SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的蛋白质中。或者，本发明的 抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相互不同的表位结合。这里，不同的表位可以存 在于例如含有SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的蛋白质中。
[0090] 特异件 与本发明提供的抗原结合分子对抗原的结合相关的特异性是指：特异性地结合的分子 的一方的分子对于其一个或多个结合对象分子以外的分子不显示实质性结合的状态。此 处，不显示实质性结合是指，如前述结合活性项目中所记载，对该对象分子以外的分子显示 对该对象分子的结合活性的80%以下、通常50%以下、优选30%以下、特别优选15%以下的 结合活性。此外，也可以用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位为 特异性的情形。此外，抗原结合结构域所结合的表位含有在多个不同的抗原中时，具有该抗 原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。
[0091] 中和活件 本发明的一个非限定的方案中提供包含下述抗原结合分子作为有效成分的药物组 合物：包含（i)对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域、（ii)对 Fe YRIIb具有选择性结合活性的Fe Y结合结构域和（iii)在pH酸性范围条件下具有FcRn 结合活性的FcRn结合结构域，具有对该抗原的中和活性的抗原结合分子。一般地，中和活 性是指抑制病毒或毒素等对细胞具有生物学活性的配体的该生物学活性的活性。即，具有 中和活性的物质是指与该配体或该配体所结合的受体结合而抑制该配体与受体的结合的 物质。与配体的结合因中和活性而受到阻断的受体不能够发挥该受体介导的生物学活性。 在抗原结合分子为抗体时，这种具有中和活性的抗体一般称为中和抗体。某被测物质的中 和活性可通过在该被测物质存在或不存在下的条件之间比较配体存在下的生物学活性来 测定。
[0092] 例如，被认为是IL-6R的主要配体的物质，可适宜举出：由SEQ ID NO: 3表示的 IL-6。其氨基末端形成胞外结构域的I型膜蛋白IL-6受体与因IL-6诱导而二聚化的gpl30 受体一起形成异四聚体（Heinrich等人（Biochem. J. (1998) 334，297-314))。由于该 异四聚体的形成，与gpl30受体缔合的Jak发生活化。Jak进行自磷酸化和受体的磷酸化。 受体和Jak的磷酸化位点对于属于Stat3这样的具有SH2的Stat家族的分子、MP激酶、 PI3/Akt、其它具有SH2的蛋白或衔接头发挥结合位点的功能。接着，与gpl30受体结合的 Stat通过Jak进行磷酸化。磷酸化的Stat形成二聚体而转移到核内，调节祀基因的转录。 Jak或Stat也可以经由其它类的受体而参与信号级联。不受控制的IL-6的信号级联在自 身免疫疾病的病态或炎症、多发性骨髓瘤或前列腺癌等的癌症中被观察到。可作为癌基因 发挥作用的Stat3在多种癌症中稳态性活化。在前列腺癌和多发性骨髓瘤中，源自IL-6 受体的信号级联和源自上皮生长因子受体（EGFR)家族成员的信号级联之间存在交互作用 (Ishikawa 等人（J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46 (2)，55-66))。
[0093] 这样的细胞内的信号级联根据每一细胞种类而不同，因此可对作为目标的每一靶 细胞设定适宜的靶分子，不限定于上述的因子。通过测定机体内信号的活化，可以评价中和 活性。此外，以对存在于机体内信号级联下游的靶基因的转录诱导作用作为指标，也可以 检测机体内信号的活化。靶基因的转录活性变化可以通过报道基因测定的原理进行检测。 具体而言，将GFP(绿色荧光蛋白）或萤光素酶等报道基因配置在靶基因的转录因子或启 动子区的下游，通过测定该报道基因活性，可以将转录活性变化作为报道基因活性进行测 定。机体内信号的活化的测定试剂盒可适宜使用市售的试剂盒（例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等）。
[0094] 进而，通常作为测定作用于在促进细胞生长的方向上发挥功能的信号级联的EGF 受体家族等的受体配体的中和活性的方法，可以通过测定作为靶标的细胞的生长活性，来 评价抗原结合分子的中和活性。例如，作为评价或测定对于其生长受例如HB-EGF等EGF 家族的生长因子促进的细胞生长的、基于抗HB-EGF抗体的中和活性的抑制效果的方法，可 适宜使用以下的方法。作为在试管内评价或测定该细胞生长抑制活性的方法，可以使用测 定活细胞摄入培养基中添加的[3H]标记的胸苷作为DNA复制能力指标的方法。作为更简 便的方法，可以使用在显微镜下计测将台盼蓝等染料排除到细胞外的能力的染料排除法或 MTT法。后者利用了：活细胞具有将四氮唑盐MTT (3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯 基溴化四唑）转换为蓝色的甲（formazan)产物的能力。更具体而言，向被测细胞的培养 液中添加配体和被测抗体，经过一定时间后，将MTT溶液加入培养液中静置一定时间，由此 MTT被摄入到细胞内。其结果，黄色化合物MTT由于细胞内的线粒体内的琥珀酸脱氢酶而 转变为蓝色化合物。使该蓝色生成物溶解、显色后，测定其吸光度，以此作为活细胞数的指 标。除了 MTT之外，还可适宜使用市售的（nacalai tesque等）MTS、XTT、WST-1、WST-8等 试剂。在活性测定时，将作为对照抗体的与抗HB-EGF抗体具有相同同种型的抗体且不具有 该细胞生长抑制活性的结合抗体、和抗HB-EGF抗体同样进行使用，抗HB-EGF抗体显示较对 照抗体强的细胞生长抑制活性，由此可以判定活性。
[0095] 作为用于评价活性的细胞，可适宜使用例如作为其生长受HB-EGF促进的细胞的、 卵巢癌细胞RMG-I细胞株或者用连接有编码人EGFR胞外结构域与小鼠G-CSF受体胞内结 构域框内融合而成的融合蛋白hEGFR/mG-CSFR的基因以表达的载体转化的小鼠Ba/F3细胞 等。如此，本领域技术人员可以通过适宜选择用于评价活性的细胞，来用于上述的细胞生长 活性的测定。
[0096] 抗体 本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制备得到的免疫球 蛋白。抗体可从天然存在其的血浆或血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上 清液中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全合成。作为抗体的实例，优 选可举出：免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。作为人的免疫球蛋白，已知有IgGU 1 §62、1§63、1§64、1§41、1§42、1 §0、1§￡、1§11这9种类型（同种型）。本发明的抗体中可含 有这些同种型中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。作为人IgGU人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定区， 基因多态性所致的多个的同种异型序列记载于Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242中，本发明中可以是其中的任一个序列。特别是 作为人IgGl的序列，EU编号356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。此外，作为 人Ig K恒定区和人Ig X恒定区，基因多态性所致的多个的同种异型序列记载于Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242 中，本发明中可 以是其中的任一个序列。
[0097] 制备具有所期望结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例 示与IL-6R结合的抗体（抗IL-6R抗体）的制作方法。与IL-6R以外的抗原结合的抗体也 可以根据下述例示而适宜制作。
[0098] 抗IL-6R抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗 IL-6R抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体含 有：由杂交瘤产生的单克隆抗体和利用基因步骤技术通过用含有抗体基因的表达载体转化 的宿主细胞产生的单克隆抗体等。应予说明，本申请发明的单克隆抗体包括"人源化抗体" 和"嵌合抗体"。
[0099]产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所示的方法来制作。 艮P，使用IL-6R蛋白作为敏化抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞 融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。其次，通过通常的筛选方法筛选单克隆抗 体产生细胞，由此可以选择出产生抗IL-6R抗体的杂交瘤。
[0100] 具体而言，单克隆抗体的制作例如如下所示地进行。首先，表达其核苷酸序列公开 在SEQ ID NO: 2中的IL-6R基因，由此可得到由SEQ ID NO: 1表示的IL-6R蛋白，其用作 敏化抗原用于抗体制备。即，将编码IL-6R的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适 当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清液中纯化所期望的人IL-6R蛋 白。为了从培养上清液中获得可溶型的IL-6R，代替由SEQ ID NO: 1表示的IL-6R蛋白，表 达了例如，如 Mullberg 等（J. Immunol. (1994) 152 (10)，4958-4968)所记载的可溶型 IL-6R、即SEQ ID NO: 1表示的IL-6R多肽序列中、含有第1位至357位氨基酸的蛋白。此 夕卜，纯化的天然IL-6R蛋白也可以同样地用作敏化抗原。
[0101] 作为用于免疫哺乳动物的敏化抗原，可使用该纯化IL-6R蛋白。此外，IL-6R的部 分肽也可以用作敏化抗原。此时，该部分肽也可以根据人IL-6R的氨基酸序列通过化学合 成获得。此外，也可以通过将IL-6R基因的一部分整合至表达载体并进行表达来获得。进 而，还可以使用蛋白质分解酶分解IL-6R蛋白来获得，用作部分肽的IL-6R肽的区域和大小 并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中相当 于第20-357位氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸 的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体而言，可以将8~50、优选 1(T30个残基的肽用作敏化抗原。
[0102] 此外，也可以将IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得 的融合蛋白用作敏化抗原。为了制备用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体 的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或两种以 上的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如前所述地插入表达载体。融合蛋白的制 作方法记载于 Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al. , Molecular Cloning 2nd ed.，9. 47-9. 58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. press)。用作敏化抗原的 IL-6R 的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于国际公开W02003/000883、W02004/022754、 W02006/006693 等中。
[0103] 作为用该敏化抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融 合中使用的亲本细胞的相容性来选择。通常适宜使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠 或兔、猴等。
[0104] 按照公知的方法将上述动物用敏化抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过将敏化 抗原注射给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体而言，将用PBS (磷酸缓冲盐水 (Phosphate-Buffered Saline))或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原根据需要 与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该敏化抗原对哺乳动物每4至21天给 予数次。此外，敏化抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作敏 化抗原时，有时期望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白质结合的该敏化抗原肽进行 免疫。
[0105] 此外，产生所期望抗体的杂交瘤也可通过使用DNA免疫如下所示来制作。DNA免疫 是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载 体DNA的该免疫动物中，敏化抗原在该免疫动物的机体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋 白质抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下优越性： -能够维持如IL-6R的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激 -无需纯化免疫抗原。
[0106] 为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IL-6R蛋 白的DNA。编码IL-6R的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA插入适当的表达载 体，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如PCDNA3.1等市售的表达载体。作为将 载体给予机体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金颗粒用基因 枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IL-6R的抗体的制作也可以 采用国际公开W02003/104453中记载的方法来制作。
[0107] 如此将哺乳动物免疫，确认到血清中与IL-6R结合的抗体效价的上升后，从哺乳 动物采集免疫细胞，进行细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
[0108] 作为与前述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优 选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物是指赋予细胞能够在特定培养条件下存 活（或死亡）的性质。选择标记物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺 失（以下简称为HGPRT缺失）或胸苷激酶缺失（以下简称为TK缺失）等。具有HGPRT、TK 缺失的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性（以下简称为HAT敏感性）。HAT敏感 性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可 利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会生长。
[0109] HGPRT缺失、TK缺失的细胞各自可通过含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤（以下 简称为8AG)或5'溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞 会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此 夕卜，被称为G418抗性的选择标记物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生 素（庆大霉素类似物）的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
[0110] 作为这类骨髓瘤细胞，可适宜使用例如P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550) > P3x63Ag8U. I (Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7)，511-519)、 MPC-II(CelI(1976)8 (3)，405-415)、SP2/0 (Nature(1978)276 (5685)，269-270)、FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2)，1-21)、S194/5.XX0.BU. I (J. Exp. Med. (1978) 148 (1)，313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
[0111] 基本上，根据公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法（Methods Enzymol. (1981)73，3-46)等，进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
[0112] 更具体而言，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下，在通常的营养培养液中实施 前述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇（PEG)、仙台病毒（HVJ)等，进而为了提 高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂使用。
[0113] 免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选 使免疫细胞为1至10倍。作为用于前述细胞融合的培养液，使用例如适于前述骨髓瘤细胞 株的生长的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可 优选添加胎牛血清（FCS)等血清补液。
[0114] 对于细胞融合，将规定量的前述免疫细胞和骨髓瘤细胞在前述培养液中充分混 合，将预先加热至37°C左右的PEG溶液（例如平均分子量1000至6000左右）通常以30至 60%(w/v)的浓度添加。混合液通过缓慢混合而形成所期望的融合细胞（杂交瘤）。其次， 依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交 瘤的生长不利的细胞融合剂等。
[0115] 这样得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液（含有次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸苷的培养液）培养来进行选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够所 期望的杂交瘤以外的细胞（非融合细胞）死亡的时间（通常，所述足够的时间为数天至数 周）。其次，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
[0116] 如此得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记 物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT或TK缺失的细胞可以通过用HAT培养液 (含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液）培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT 敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性 地生长。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞（非融合细 胞）死亡的时间。具体而言，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。其次， 可通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
[0117] 所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来 实施。例如，与IL-6R结合的单克隆抗体可以与细胞表面表达的IL-6R结合。这样的单克 隆抗体可通过例如FACS (荧光活化细胞分选）来筛选。FACS是可以通过用激光分析与荧光 抗体接触的细胞并测定各细胞发出的荧光来测定抗体对细胞表面的结合的系统。
[0118]为了利用FACS来对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达 IL-6R的细胞。优选用于筛选的细胞是强制表达IL-6R的哺乳动物细胞。作为对照，通过使 用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞，可以选择性地检测抗体对细胞表面的IL-6R的 结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与IL-6R强制表达细胞结合的抗体的杂 交瘤，可以获得产生IL-6R单克隆抗体的杂交瘤。
[0119] 或者，可以基于ELISA的原理来评价抗体对固定化的IL-6R表达细胞的结合活性。 例如，将IL-6R表达细胞固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清液与孔内的固定化 细胞接触，检测与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可 通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择出的、产生具有抗原结合能力的所期 望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释方法等进行克隆。
[0120] 这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。此外，该 杂交瘤可以在液氮中长期保存。
[0121] 按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清液中获得所期望的单克隆抗体。 或者，可以将杂交瘤给予和其具有相容性的哺乳动物并使其生长，从其腹水中获得单克隆 抗体。前者的方法适于获得高纯度的抗体。
[0122] 也可以适宜地使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将 克隆的抗体基因整合至适当的载体中，导入宿主，由此表达由该基因所编码的抗体。用于抗 体基因的分离、向载体中的导入以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等确立 (Eur.J. Biochem. (1990) 192 (3)，767-775)。此外，如下所述的重组抗体的制备方法也是 公知的。
[0123] 例如，由产生抗IL-6R抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IL-6R抗体的可变区（V区） 的cDNA。为此，通常首先从杂交瘤提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法，例如可 使用如下所述的方法： -胍超离心法（Biochemistry (1979) 18 (24)，5294-5299) -AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1)， 156-159)。
[0124]提取的 mRNA 可使用 mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience 制）等 进行纯化。或者还市售有 QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience 制）等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可从杂交瘤获得 mRNA。可以使用反转录酶由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工业社制）等合成。此外，为 了 cDNA的合成和扩增，可以适宜采用使用了 SMART RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech制） 和 PCR 的 5'-RACE 法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (23)，8998-9002、 NucleicAcidsRes. (1989) 17 (8)，2919-2932)。进而，可以在这种 cDNA 的合成过程中 向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
[0125] 从所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体， 并导入大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。 而且，对于该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，可以通过公知的方法例如双脱氧核 苷酸链终止法等来确认。
[0126] 为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5' -RACE法，其中使用了可变区基因 扩增用的引物。首先，将从杂交瘤细胞提取的RNA作为模板来合成cDNA，获得5'-RACE cDNA 文库。5'-RACE cDNA文库的合成中可适宜地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的 试剂盒。
[0127] 以所得的5'_RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体 基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不 同的碱基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒（Roche Diagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。
[0128] 具体而言，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用能够扩增编码作为重 链的Y 1、Y 2a、Y 2b、Y 3、作为轻链的K链和：V链的基因的引物。为了扩增IgG的可变 区基因，通常，3'侧的引物采用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而 5'侧的引物则采用5' RACE cDNA文库制作试剂盒所附带的引物。
[0129] 利用如此扩增得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋 白。将经重构的免疫球蛋白针对IL-6R的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如， 为了获得针对IL-6R的抗体时，进一步优选抗体对IL-6R的结合是特异性的。与IL-6R结 合的抗体可例如如下所述进行筛选： (1) 使含有由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与IL-6R表达细胞接触的步骤； (2) 检测IL-6R表达细胞与抗体的结合的步骤；以及 (3) 选择与IL-6R表达细胞结合的抗体的步骤。
[0130] 检测抗体和IL-6R表达细胞的结合的方法是公知的。具体而言，通过如前所述的 FACS等方法，可检测抗体与IL-6R表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜利用 IL-6R表达细胞的固定标本。
[0131] 作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可适宜采用淘选法，其利用了噬菌 体载体。从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库的形式获得抗体基因时，有 利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序 列连接，可形成单链Fv (scFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体，可以获得在表面 表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可 以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所 期望结合活性的scFv。
[0132] 得到编码抗IL-6R抗体的V区的目标cDNA后，通过识别插入在该cDNA的两末端 的限制酶位点的限制酶，将该cDNA消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的碱 基序列中出现频率低的碱基序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体，优 选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上所述消化的编码抗IL-6R抗体的V区的cDNA插 入适当的表达载体，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区（C区）的基 因和编码前述V区的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变 区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也含有在本 发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入前述V区基因，可以构建嵌 合抗体表达载体。具体而言，例如，可在保持有编码所期望抗体恒定区的DNA的表达载体的 5'侧适宜地配置消化前述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消 化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。
[0133] 为了制备抗IL-6R单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗 体基因整合至表达载体中。用于表达抗体的表达调控区含有例如增强子和启动子。此外， 可以在氨基末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作 为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 4)的肽，除此之外 也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多 肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。其次，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可 以获得表达编码抗IL-6R抗体的DNA的重组细胞。
[0134] 为了表达抗体基因，编码抗体重链（H链）和轻链（L链）的DNA被分别整合于不 同的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体共转化（co-transfect)相同的宿主细 胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，也可以将编码H链和L链的DNA整合于单 一表达载体中，并用其转化宿主细胞（参照国际公开WO 1994/011523)。
[0135] 用于将分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多 个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作 宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，动物细胞可例示下述 细胞。
[0136] (1)哺乳类细胞：CHO (中国仓鼠卵巢细胞系）、COS (猴肾细胞系）、骨髓瘤（Sp2/ 0、NS0等）、BHK (幼仓鼠肾细胞系）、Hela、Vero、HEK293 (具有剪切的腺病毒（Ad) 5 DNA的 人胚肾细胞系）、Freestyle293、PER. C6细胞（转化有5型腺病毒（Ad5) ElA和ElB基因的 人胚视网膜细胞系）等（Current Protocols in Protein Science (2001 年 5 月，第 5. 9 单元，表5. 9. 1)) (2) 两栖类细胞：非洲爪蟾卵母细胞等 (3) 昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5 等。
[0137] 或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草（Nicotiana tabacum)等烟草 (Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统。植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤 组织培养的细胞。
[0138] 进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞： -酵母：酿酒酵母（Saccharomyces serevisiae)等酵母（Saccharomyces)属、巴斯德 毕赤酵母（Pichia pastoris)等毕赤酵母属 _丝状真菌：黑曲霉菌（Aspergillus niger)等曲霉（Aspergillus)属。
[0139] 此外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可 适宜利用大肠杆菌（E. coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标 抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得 所期望的抗体。
[0140] 除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以从导入 有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入编码乳汁 中固有产生的蛋白质的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白质，可 利用例如山羊P酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚 胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊（或其后 代）产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。此外，为了 使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素（Bio/ Technology (1994)， 12 (7)， 699-702)。
[0141] 对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该抗原结合分子中的抗原结 合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为 了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工改变。基因重组型抗体含有例如人源化 (Humanized)抗体等。这些改变抗体可使用公知方法适宜制备。
[0142] 用于制作本说明书中记载的抗原结合分子的抗原结合结构域的抗体可变区通常 由被4个框架区域（FR)保持的3个互补决定区（complementarity-determining region; CDR)构成。CDR是实质上决定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。 另一方面，构成FR的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度 的同一性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。
[0143] 人源化抗体也被称为重构（reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小 鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基 因重组方法也是已知的。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法， 公知的是例如重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待 移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR分别准备引物。通常，对于将小鼠CDR移植到 人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR，在维持CDR功能方面认为有利。即，通常优选利 用下述人FR，其含有与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
[0144] 此外，连接的碱基序列被设计为相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。结 果得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被 设计为相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行 互补链合成反应。通过该反应，人FR通过小鼠⑶R序列而连接。
[0145] 最终3个⑶R和4个FR连接得到的V区基因，通过会与其5'末端和3'末端发生退 火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的DNA和编码 人抗体C区的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用 载体。将该整合载体导入宿主建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗 体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体（参照欧州专利公开EP239400、 国际公开 W01996/002576)。
[0146] 通过定性或者定量地测定并评价如上所述制作的人源化抗体的抗原结合活性，可 以适宜地选择人抗体FR，以便通过CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要， 也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合位点的方式来取代FR的氨基酸残基。例如， 可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。具体而 言，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这样的引物合成的 FR中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸取代的突变型抗 体的抗原结合活性，可以选择具有所期望性质的突变FR序列（Cancer Res.，（1993) 53， 851-856)。
[0147] 此外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物（参照国际公开 W01993/012227、W01992/003918、W01994/002602、W01994/025585、W01996/034096、 W01996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所期望的人抗体。
[0148] 进而，使用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V 区以单链抗体（scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗 原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合 的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望 的人抗体C区序列框内融合后，插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达 载体导入上述列举的适宜表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗 体。这些方法已经公知（参照国际公开W01992/001047、W01992/020791、W01993/006213、 W01993/011236、TO1993/019172、TO1995/001438、W01995/015388)。
[0149] 此外，作为获得抗体基因的方法，除了上述之外，还可适宜地使用如Bernasconi 等（Science (2002) 298，2199-2202)或国际公开W02008/081008中记载的B细胞克隆 (各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体（特别是IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4)的表达载体构建用的用途等）的方法。
[0150]EU编号和Kabat编号 根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定 (Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md.，1987年和1991年）。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段 时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的 EU编号来表示。
[0151]离子浓度备件 金属离子浓度备件 本发明的一个方式中，离子浓度是指金属离子浓度。"金属离子"是指属于除了氢以外 的碱金属和铜族等第I族、碱土类金属和锌族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和 硅之外的第IV族、铁族和钼族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亚族的元素以及锑、铋、 钋等金属元素的离子。金属原子具有释放出原子价电子而形成阳离子的性质，称这为离子 化倾向。认为离子化倾向大的金属富有化学活性。
[0152] 作为本发明中优选的金属离子的实例，可举出钙离子。钙离子参与许多生命现象 的调节，钙离子参与骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收缩，白细胞的运动和吞噬等的活化， 血小板的变形和分泌等的活化，淋巴细胞的活化，组胺的分泌等肥大细胞的活化，儿茶酚胺 a受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答，胞吐作用，递质从神经元末端的释放，神经元的轴 浆流等。作为细胞内的钙离子受体，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上 来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合模体也大量已 知。还熟知例如，钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝 血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集 素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
[0153] 本发明中，在金属离子为钙离子时，作为钙离子浓度条件，可举出低钙离子浓度条 件和高钙离子浓度条件。本发明的抗原结合分子中含有的抗原结合结构域的抗原结合活性 随钙离子浓度条件而变化是指，低钙离子浓度和高钙离子浓度条件的不同导致抗原结合分 子中含有的抗原结合结构域的抗原结合活性发生变化。可举出例如，高钙离子浓度条件下 的抗原结合结构域的抗原结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合结构域的抗原结 合活性的情形。此外还可例示出，低钙离子浓度条件下的抗原结合结构域的抗原结合活性 高于高钙离子浓度条件下的抗原结合结构域的抗原结合活性的情形。
[0154] 本说明书中，高钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自IOOy M至 IOmM之间的浓度。此外，在其它方案中，可以是选自200 iiM至5mM之间的浓度。此外，在不 同的方案中，可以是选自400 iiM至3mM之间的浓度，在其它的方案中也可以是选自200 iiM 至2mM之间的浓度。进而，还可以是选自400 M至ImM之间的浓度。特别优选可举出选自 与机体内血浆中（血中）的钙离子浓度接近的500 ii M至2. 5mM之间的浓度。
[0155] 本说明书中，低钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自0. IuM至 30iiM之间的浓度。此外，在其它方案中，可以是选自0. 2iiM至20iiM之间的浓度。此外， 在不同的方案中，可以是选自〇. 5 ii M至10 ii M之间的浓度，在其它的方案中也可以是选自 Iy M至5 M之间的浓度。进而，还可以是选自2 M至M之间的浓度。特别优选可举出 选自与机体内的早期内体内的离子化钙浓度接近的I U M至5 ii M之间的浓度。
[0156] 本发明中，低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原 结合活性意指，本发明的抗原结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子在选自〇. IyM 至30 ii M之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于选自IOOii M至IOmM之间的钙离子浓度 下的抗原结合活性。优选意指本发明的抗原结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子在 选自0. 5 ii M至IOii M之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自200 ii M至5mM之间 的钙离子浓度下的抗原结合活性，特别优选意指机体内的早期内体内的钙离子浓度下的抗 原结合活性弱于机体内的血浆中的钙离子浓度下的抗原结合活性，具体意指抗原结合分子 在选自IuM至5iiM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自500 ii M至2. 5mM之 间的钙离子浓度下的抗原结合活性。
[0157] 抗原结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子的抗原结合活性随金属离子浓 度条件而变化与否可以通过使用例如前述结合活性项目中所记载的公知测定方法来确定。 例如，为了确认与低钙离子浓度条件下的抗原结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子 的抗原结合活性相比高钙离子浓度条件下的所述结构域或所述分子的抗原结合活性变得 更高，对低钙离子浓度和高钙离子浓度条件下的所述结构域或所述分子的抗原结合活性进 行比较。
[0158] 进而，本发明中，"低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下 的抗原结合活性"的表述也可以表述为抗原结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子的 高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合活性。应予说 明，本发明中有时也将"低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的 抗原结合活性"记载为"低钙离子浓度条件下的抗原结合活性弱于高钙离子浓度条件下的 抗原结合活性"，此外，有时也将"使低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓 度条件下的抗原结合活性"记载为"使低钙离子浓度条件下的抗原结合活性弱于高钙离子 浓度条件下的抗原结合活性"。
[0159] 本领域技术人员可以适宜选择测定抗原结合活性时的钙离子浓度以外的条件， 没有特别限定。例如，可以在ffiPES缓冲液、37 °C的条件下进行测定。例如，可以使用 Biacore (GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合结构域或含有该结构域的抗原结合分 子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合结构域或含 有该结构域的抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的 结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合结 构域或含有该结构域的抗原结合分子，由此可以评价对膜型抗原的结合活性。
[0160] 本发明的抗原结合分子中，只要低钙离子浓度条件的抗原结合活性弱于高钙离 子浓度条件的抗原结合活性，则低钙离子浓度条件下的抗原结合活性和高钙离子浓度 条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的低钙离子浓度条件下的 KD(Dissociation constant:解离常数）和高I丐离子浓度条件的KD之比KD (Ca 3uM)/KD (Ca 2mM)的值为2以上，进一步优选KD (Ca 3iiM)/KD (Ca 2mM)的值为10以上，进一步优 选1?化&311]\〇/1(0化&21111)的值为40以上。1(0化 &311]\〇/1(0化&21111)的值的上限没有 特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。
[0161] 作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD (解离常数），而在 抗原为膜型抗原时可以使用表观KD(Apparent dissociation constant:表观解离常数）。 KD(解离常数）和表观KD(表观解离常数）可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例 如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图（Scatchard plot)、流式细胞仪等。
[0162] 此外，作为示出本发明的抗原结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子的低钙 浓度条件下的抗原结合活性和高钙浓度条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可适宜 使用例如解离速率常数即kd (Dissociation rate constant:解离速率常数）。代替KD (解 离常数）而使用kd(解离速率常数）来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的 低钙浓度条件下的kd(解离速率常数）和高钙浓度条件下的kd(解离速率常数）之比即 kd(低钙浓度条件）/kd (高钙浓度条件）的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步 优选为10以上，更优选为30以上。kd(低钙浓度条件）/kd(高钙浓度条件）的值的上限 没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的 值。
[0163] 作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数），在 抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(Apparent dissociation rate constant :表观解离速 率常数）。kd (解离速率常数）和表观kd (表观解离速率常数）可通过本领域技术人员公 知的方法测定，例如可使用Biacore (GE healthcare)、流式细胞仪等。应予说明，本发明中， 在测定不同钙离子浓度下的抗原结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子的抗原结合 活性时，钙浓度以外的条件优选为相同。
[0164] 例如，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙 离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的筛选方法，可例示WO 2012/073992等（例如段落0200-0213)中记载的方法。
[0165] t?库 根据一个方案，本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以由文库获得，该文库主 要由多种抗原结合分子形成，所述多种抗原结合分子的序列相互不同，并且其抗原结合结 构域中含有至少一个使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残 基。作为离子浓度的实例，优选可举出金属离子浓度或氢离子浓度。
[0166] 本说明书中，"文库"是指多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多 肽、或编码它们的序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多种抗原结合分子或含有抗原结合 分子的多种融合多肽的序列并非单一的序列，而是序列相互不同的抗原结合分子或含有抗 原结合分子的融合多肽。
[0167] 本说明书中，序列相互不同的多种抗原结合分子的记载中的"序列相互不同"这一 术语意指文库中的各抗原结合分子的序列相互不同。即，文库中的相互不同的序列的数量 反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为"文库大小"。通常的噬菌体展示 文库为IO 6至1〇12,通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至1〇14。然而， 噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体颗粒的实际数目通常比文库大小大10至10, 000 倍。该过量倍数也称为"文库当量数"，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至 10, 000个。所以，本发明中的"序列相互不同"这一术语意指文库当量数除外的文库中的各 抗原结合分子的序列相互不同，更具体意指序列相互不同的抗原结合分子存在IO 6至1〇14 个分子、优选IO7至1〇12个分子、进一步优选IO8至IO11个分子、特别优选IO 8至101°个分 子。
[0168] 此外，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库这一记载中的术语"多种"， 对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒来说，通常是指这 些物质的2种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面相互不同，则表示 该物质存在2种以上。作为实例，可举出氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体 氨基酸。例如，当除了柔性残基以外或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨 基酸以外，序列实质上相同、优选相同的本发明的2个以上的抗原结合分子存在时，则本发 明的抗原结合分子存在多种。在其它实例中，当除了编码柔性残基的碱基以外或除了编码 露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、优选相同的序 列的本发明的2个以上的多核苷酸分子存在时，贝U本发明的多核苷酸分子存在多种。
[0169] 进而，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库的记载中的"主要由...形 成"的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中抗原结合分子的抗原结合活性随 离子浓度条件而不同的抗原结合分子的数量。具体而言，优选表现出这种结合活性的抗原 结合分子在文库中至少存在IO 4个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由表现 出这种结合活性的抗原结合分子至少存在IO5个分子的文库中获得。进一步优选本发明的 抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在IO 6个分子的文库中获 得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在 IO 7个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗 原结合分子至少存在IO8个分子的文库中获得。其它表述中，也可适宜地表述为文库中的 序列不同的独立克隆的数量中的抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而不同的 抗原结合分子的比例。具体而言，本发明的抗原结合结构域可以由表现出这种结合活性的 抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数量的0. 1%至80%、优选0. 5%至60%、更优 选1%至40%、进一步优选2%至20%、特别优选4%至10%的文库中获得。融合多肽、多核苷 酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表述。此外， 病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表述。
[0170] 俥抗原结合结构域的抗原结合活件随钙离子浓度备件而夺化的氨某酸 通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可用任意方法制 备，例如，在金属离子为钙离子浓度的情形中，可以使用预先存在的抗原结合结构域或抗原 结合分子、预先存在的文库（噬菌体文库等）、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫 动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入能螯合钙的氨基酸（例如天冬氨 酸或谷氨酸）或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库（能螯合钙的氨基酸（例如天冬氨酸 或谷氨酸）或非天然氨基酸的含有率提高的文库或者在特定位置导入能够螯合钙的氨基 酸（例如天冬氨酸或谷氨酸）或非天然氨基酸突变而得的文库等）等。
[0171] 如前所述，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸 的实例，例如，在金属离子为钙离子时，只要是形成钙结合模体的氨基酸即可，不论其种类 如何。钙结合模体是本领域技术人员所周知的，并且有详细记载（例如Springer等（Cell (2000) 102，275-277)、Kawasaki 和 Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2，305-490)、 Moncrief 等（J. Mol. Evol. (1990) 30，522-562)、Chauvaux 等（Biochem. J. (1990) 265，261-265)、Bairoch 和&?(卩￡85 1^?.(1990) 269，454-456)、〇3￥18(恥￥81〇1. (1990) 2，410-419)、Schaefer 等（Genomics (1995) 25，638?643)、Economou 等（EMB0 J. (1990) 9，349-354)、Wurzburg 等（Structure. (2006) 14，6，1049-1058))。即，本 发明抗原结合分子中可以含有ASGPR，⑶23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知钙结 合模体。作为这种钙结合模体的优选实例，除了上述之外，还可举出SEQ ID NO: 5所述的 抗原结合结构域中所含的钙结合模体。
[0172] 此外，作为使本发明的抗原结合分子中含有的抗原结合结构域的抗原结合活性随 钙离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，还可适宜使用具有金属螯合作用的氨基酸。作为 具有金属螯合作用的氨基酸的实例，优选可举出例如：丝氨酸（Ser (S))、苏氨酸（Thr (T))、 天冬酰胺（Asn(N))、谷氨酰胺（Gin(Q))、天冬氨酸（Asp(D))和谷氨酸（Glu(E))等。
[0173] 含有前述氨基酸的抗原结合结构域的位置并不限于特定的位置，只要是使抗原结 合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可 变区或轻链可变区中的任意位置。在一个非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以 由下述文库获得，该文库主要由重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合 活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在另 一非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的 CDR3中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原 结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的CDR3的以Kabat编号表示的95位、 96位、IOOa位和/或101位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0174] 此外，在本发明的非限定的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文 库获得，该文库主要由轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙 离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在另一非限定 的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDRl中含 有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构 域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDRl的以Kabat编号表示的30位、31位和/ 或32位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0175] 此外，在其它非限定的方式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该 文库主要由轻链的CDR2中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在另 一非限定的方案中，提供下述文库，该文库主要由轻链的CDR2的以Kabat编号表示的50位 含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0176] 进而，在其它非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该 文库主要由轻链的CDR3中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其 它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR3的以 Kabat编号表示的92位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0177] 此外，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库作为本发明的不同方案来获得， 该文库主要由选自上述记载的轻链的CDRl、CDR2和CDR3中的2个或3个CDR含有该氨基 酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。进而，本发明的抗原结合结构域可以由下述 文库获得，该文库主要由轻链的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位 中的任一个以上含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0178] 在特别优选的实施方案中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框 架序列具有人的种系框架序列。因此，在本发明的一个方案中，若框架序列完全为人的序 列，则认为在给予人（例如疾病的治疗）时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免 疫原性反应。根据上述含义，本发明的"含有种系序列"意指本发明的框架序列的一部分与 任意的人的种系框架序列的一部分相同。例如，在本发明的抗原结合分子的重链FR2的序 列为多个不同的人的种系框架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，也是本发明的"含 有种系序列"的抗原结合分子。
[0179]作为框架的实例，优选可举出例如：/-1^86(111^口:/八匕386.1]11'(3-0口6.03111.3(3.111^/) 等网站中所包括的、现在已知的完全人型框架区域的序列。这些框架区域的序列能够 适宜用作本发明的抗原结合分子中所含的种系序列。种系序列可基于其相似性来分类 (Tomlinson 等（J. Mol. Biol. (1992) 227，776-798)Williams Immunol. (1993) 23， 1456-1461)和 Cox 等（Nat. Genetics (1994) 7， 162-168))。可 以从分类为7个亚类的V K、分类为10个亚类的V X、分类为7个亚类的VH中适宜选择合 适的种系序列。
[0180] 完全人型VH序列并不仅限于下述，可适宜举出例如：VHl亚类（例如，VH1-2、 VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1_69)、VH2 亚类（例如，VH2-5、 VH2-26、VH2-70)、VH3 亚类（VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、 VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、 VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4 亚类（VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、 乂114-59、￥114-61)、￥册亚类（￥册-51)、￥册亚类（￥册-1)、￥117亚类（￥117-4、￥117-81)的￥11序 列等。它们也记载于公知文献（Matsuda等（J. Exp. Med. (1998) 188，1973-1975))等 中，本领域技术人员可以基于它们的序列信息适宜设计本发明的抗原结合分子。还可适宜 使用它们以外的完全人型框架或框架的亚区（sub-region)。
[0181] 完全人型VK序列并不仅限于下述，可适宜举出例如：分类为Vkl亚类的A20、 A30、LI、L4、L5、L8、L9、Lll、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、02、04、08、012、014、 018 ;分类为 Vk2 亚类的 A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、01、011 ;分类为 Vk3 亚类的 A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25 ;分类为Vk4亚类的B3 ;分类为Vk5亚类的B2(本说明 书中也称为 Vk5_2);分类为 VK6 亚类的 A10、A14、A26 等（Kawasaki 等（Eur. J. Immunol. (2001) 31，1017-1028)、Schable 和 Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374， 1001-1022)和&'ensing-Kuppers 等（Gene (1997) 191，173-181))。
[0182] 完全人型的VA序列并不仅限于下述，可适宜举出例如：分类为VLl亚类的Vl-2、 V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1_22 ;分 类为 VLl 亚类的 V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19;分类 为 VL3 亚类的 V3-2、V3-3、V3-4 ;分类为 VL4 亚类的 V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6 ;分类为 VL5 亚类的 ￥5-1、￥5-2、75-4、￥5-6等（1^￥&8&1^等（6611〇1116 1^8.(1997) 7，250-261))。
[0183] 通常这些框架序列根据一个或更多个氨基酸残基的区别而相互不同。这些框架序 列可以与本发明的"使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨 基酸残基"一起使用。作为与本发明的"使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而 变化的至少一个氨基酸残基"一起使用的完全人型框架的实例，并不仅限于此，此外还可举 出：K0L、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM 等（例如，前述的 Kabat 等（1991)和 Wu 等〇. Exp. Med (1970) 132，211-250))。
[0184] 本发明并不受特定理论的束缚，认为种系序列的使用有望排除大多数个体中有害 免疫反应的一个原因如下所述。通常的免疫反应中产生的亲和性成熟阶段的结果造成免疫 球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的⑶R的附 近，对框架区域的残基也造成影响。这些框架的突变在种系的基因中不存在，此外成为患者 的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人类种群暴露于种系的基因所表达的框架序 列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些种系的框架在患者中的免疫原性低或为非 免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性 种系基因的集合中选择。
[0185] 为了制作本发明的前述可变区序列的序列、重链可变区或轻链可变区序列或者 CDR序列或框架序列中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨 基酸的抗原结合分子，可适宜采用位点特异性诱变法（Kunkel等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82，488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。
[0186] 例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度 条件而变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区、与被制作为随机可变区序列 文库的重链可变区组合，由此可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的 文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，可适宜举出例如：将SEQ ID NO: 5 (Vk5-2)所述的轻链可变区序列和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组 合而成的文库。
[0187] 此外，也可以进行设计，以使前述被选择作为预先含有使抗原结合结构域或抗原 结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的 轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。本发明中，这样的 残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要随 离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻 链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。例如，在离子浓度为钙 离子浓度时，作为导入SEQ ID NO: 5 (Vk5-2)所述的轻链可变区序列中的柔性残基的非限 定性实例，可举出表1或表2中所述的氨基酸残基。
[0188] [表1]

【权利要求】
1. 抗原结合分子在使该抗原从血浆中消除中的使用，其中所述抗原结合分子包含对抗 原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和以EU编号表示的238位的氨基 酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly的Fc区。
2. 权利要求1的使用，其中，所述Fc区为选自以EU编号表示的下述位置的至少一个 以上的氨基酸进一步被取代的Fc区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、 268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、 356 位、358 位、396 位、409 位和 419 位。
3. 权利要求2的使用，其中，所述Fc区含有以EU编号表示的下述位置的氨基酸中的任 一个以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为lie， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gin中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gin中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272 位的氨基酸为 Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro 或 Gin, 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Glu， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu。
4. 权利要求1~3中任一项的使用，其中，所述抗原结合结构域为对所述抗原的结合活 性随钙离子浓度条件而变化的抗原结合结构域。
5. 权利要求4的使用，其中，所述抗原结合结构域为结合活性以下述方式变化的抗原 结合结构域：在低钙离子浓度条件下对所述抗原的结合活性比在高钙离子浓度条件下对所 述抗原的结合活性低。
6. 权利要求1~3中任一项的使用，其中，所述抗原结合结构域为对所述抗原的结合活 性随pH条件而变化的抗原结合结构域。
7. 权利要求6的使用，其中，所述抗原结合结构域为结合活性以下述方式变化的抗原 结合结构域：在pH酸性范围条件下对所述抗原的结合活性比在pH中性范围条件下的结合 活性低。
8. 权利要求1~7中任一项的使用，其中，所述抗原结合结构域为抗体的可变区。
9. 权利要求1?8中任一项的使用，其中，所述Fc区为在SEQ ID NO: 14、15、16或17的 任一个中含有的Fc区中以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨基酸为Gly 的Fc区。
10. 权利要求1~8中任一项的使用，其中，所述Fc区在pH酸性范围条件下的FcRn结合 活性与SEQ ID NO: 14、15、16或17的任一个中含有的Fc区的FcRn结合活性相比增强。
11. 权利要求10的使用，其中，所述增强的Fc区为在SEQ ID NO: 14、15、16或17的任 一个中含有的Fc区的氨基酸序列中选自以EU编号表示的下述位置的至少一个以上的氨基 酸被取代的Fc区：244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285 位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316 位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376 位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415 位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439 位、440 位、442 位或447位。
12. 权利要求11的使用，其中，所述增强的Fc区在SEQ ID NO: 14、15、16或17中含有 的Fc区的氨基酸序列中含有选自以EU编号表示的下述位置的氨基酸中的至少一个以上的 氨基酸： 244位的氨基酸为Leu， 245位的氨基酸为Arg， 249位的氨基酸为Pro， 250位的氨基酸为Gin或Glu中的任一个，或者 251位的氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个， 252位的氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个， 254位的氨基酸为Ser或Thr中的任一个， 255位的氨基酸为Arg、Gly、lie或Leu中的任一个， 256 位的氨基酸为 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一个， 257位的氨基酸为Ala、lie、Met、Asn、Ser或Val中的任一个， 258位的氨基酸为Asp， 260位的氨基酸为Ser， 262位的氨基酸为Leu， 270位的氨基酸为Lys， 272位的氨基酸为Leu或Arg中的任一个， 279 位的氨基酸为 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任 一个， 283 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、 Trp或Tyr中的任一个， 285位的氨基酸为Asn， 286位的氨基酸为Phe， 288位的氨基酸为Asn或Pro中的任一个， 293位的氨基酸为Val， 307位的氨基酸为Ala、Glu、Gin或Met中的任一个， 308位的氨基酸为lie、Pro或Thr中的任一个， 309位的氨基酸为Pro， 311 位的氨基酸为 Ala、Glu、lie、Lys、Leu、Met、Ser、Val 或 Trp 中的任一个， 312位的氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个， 314位的氨基酸为Ala或Leu中的任一个， 316位的氨基酸为Lys， 317位的氨基酸为Pro， 318位的氨基酸为Asn或Thr中的任一个， 332 位的氨基酸为 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一个， 339位的氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个， 341位的氨基酸为Pro， 343位的氨基酸为Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr或Tyr中的任一个， 375位的氨基酸为Arg， 376位的氨基酸为Gly、lie、Met、Pro、Thr或Val中的任一个， 377位的氨基酸为Lys， 378位的氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个， 380位的氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个， 382 位的氨基酸为 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个， 385 位的氨基酸为 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一个， 386 位的氨基酸为 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个， 387位的氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个， 389位的氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个， 423位的氨基酸为Asn， 427位的氨基酸为Asn， 428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个， 430 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一个， 431位的氨基酸为His或Asn中的任一个， 433位的氨基酸为Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro或Ser中的任一个， 434位的氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一个， 436 位的氨基酸为 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一个， 438位的氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个， 440位的氨基酸为Lys，或者， 442位的氨基酸为Lys。
13. 权利要求1~12中任一项的使用，其中，所述抗原结合分子为抗体。
14. 药物组合物，其包含含有下述结构的抗原结合分子：对抗原的结合活性随离子浓 度条件而变化的抗原结合结构域和以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、且271位的氨 基酸为Gly的Fc区。
15. 权利要求14的药物组合物，其中，所述Fc区为选自以EU编号表示的下述位置的至 少一个以上的氨基酸进一步被取代的Fc区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、 267 位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、 355 位、356 位、358 位、396 位、409 位和 419 位。
16. 权利要求15的药物组合物，其中，所述Fc区含有以EU编号表示的下述位置的氨基 酸中的任一个以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为lie， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gin中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gin中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272位的氨基酸为Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gin中的任一个， 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Glu， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu。
17. 抗原结合分子的制备方法，其包括以下（a)~(e)的步骤： (a)获得对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的步骤， (b) 获得编码在所述步骤（a)中选择的抗原结合结构域的基因的步骤， (c) 将在所述步骤（b)中获得的基因与编码以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、 且271位的氨基酸为Gly的Fc区的基因有效连接的步骤， (d) 培养含有在所述步骤（c)中有效连接的基因的宿主细胞的步骤， (e) 从在所述步骤（d)中获得的培养液分离抗原结合分子的步骤。
18. 权利要求17的制备方法，其中，所述Fc区为选自以EU编号表示的下述位置的至少 一个以上的氨基酸进一步被取代的Fc区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267 位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356位、358位、396位、409位和419位。
19. 权利要求18的制备方法，其中，所述Fc区含有以EU编号表示的下述位置的氨基酸 中的任一个以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为lie， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gin中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gin中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272位的氨基酸为Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gin中的任一个， 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Glu， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu。
20. 包含抗原结合分子的药物组合物的制备方法，其包括以下（a)~(e)的步骤： (a) 获得对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的步骤， (b) 获得编码在所述步骤（a)中选择的抗原结合结构域的基因的步骤， (c) 将在所述步骤（b)中获得的基因与编码以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp、 且271位的氨基酸为Gly的Fc区的基因有效连接的步骤， (d) 培养含有在所述步骤（c)中有效连接的基因的宿主细胞的步骤， (e) 从在所述步骤（d)中获得的培养液分离该抗原结合分子的步骤。
21. 权利要求20的制备方法，其中，所述Fc区为选自以EU编号表示的下述位置的至少 一个以上的氨基酸进一步被取代的Fc区：233位、234位、237位、264位、265位、266位、267 位、268 位、269 位、272 位、274 位、296 位、326 位、327 位、330 位、331 位、332 位、333 位、355 位、356位、358位、396位、409位和419位。
22. 权利要求21的制备方法，其中，所述Fc区含有以EU编号表示的下述位置的氨基酸 中的任一个以上： 233位的氨基酸为Asp， 234位的氨基酸为Tyr， 237位的氨基酸为Asp， 264位的氨基酸为lie， 265位的氨基酸为Glu， 266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个， 267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gin中的任一个， 268位的氨基酸为Asp、Glu或Gin中的任一个， 269位的氨基酸为Asp， 272位的氨基酸为Asp、Phe、lie、Met、Asn、Pro或Gin中的任一个， 274位的氨基酸为Gln， 296位的氨基酸为Asp或Phe中的任一个， 326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个， 327位的氨基酸为Gly， 330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个， 331位的氨基酸为Ser， 332位的氨基酸为Thr， 333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个， 355位的氨基酸为Gln， 356位的氨基酸为Glu， 358位的氨基酸为Met， 396 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、lie、Lys、Leu、Met、Gin、Arg 或 Tyr 中的任一个， 409位的氨基酸为Arg， 419位的氨基酸为Glu。
【文档编号】C12P21/02GK104244980SQ201380021594
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月24日
【发明者】井川智之, 前田敦彦, 岩柳有起, 原谷健太, 坚田仁, 门野正次郎, 味元风太 申请人:中外制药株式会社