专利名称：外周血sparc 结合抗体及其用途的制作方法
外周血SPARC结合 几体及其用途
交叉参考相关申请
本申请根据35U.S.C.§ 119(e)要求2010年6月3日提交的美国临时申请N0.61/351，246的优先权利益，所述临时申请的完整内容通过引用并入本文。
发明背景
酸性的富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)(也被称作骨粘连蛋白(osteonectin))是281个氨基酸的糖蛋白。SPARC具有对于多种配体、包括阳离子(例如，Ca2+、Cu2+、Fe2+)、生长因了(例如，血小板衍生生长因子(TOGF)和血管内皮生长因子(VEGF))、细胞外基质(ECM)蛋白(例如，胶原1-V和胶原IX、玻连蛋白和凝血酶敏感蛋白-1)、内皮细胞、血小板、白蛋白和羟基磷灰石的亲和力。SPARC的表达在发育上受到调控，主要在正常发育或响应于损伤的过程中在正在发生重塑的组织中表达(参见，例如，Lane等人，FASEBJ.，8，163-173 (1994))。高水平的SPARC蛋白在正在发育的骨和牙齿中表达。
SPARC为在几种侵袭性癌症中被上调的基质细胞蛋白(matricellular protein),但在绝大部分正常组织中不存在(Porter等人,J.Histochem.Cytochem., 43, 791 (1995)和参见下文)。事实上，SPARC的表达在多种肿瘤(例如，膀胱、肝、卵巢、肾、肠和乳腺)中被诱导。在膀胱癌中，例如，SPARC表达与晚期癌相关联。已显示T2期或更晚期的侵袭性膀胱肿瘤相对于Tl期的膀胱肿瘤(或不那么浅表性的肿瘤)表达更高水的SPARC并且具有更差的预后(参见，例如，Yamanaka等人，J.Urology, 166，2495-2499 (2001))。在脑膜瘤中，SPARC的表达只与侵袭性肿瘤关联(参见，例如，Rempel等人，ClincalCancer Res.，5，237-241 (1999))。还已在74.5%的原位侵袭性乳腺癌损伤(参见，例如，Bellahcene,等人,Am.J.Pathol., 146, 95-100 (1995))和 54.2% 的乳腺的浸润性导管癌(参见，例如，Kim 等人，J.Korean Med.Sc1.，13,652-657(1998))中检测到 SPARC 的表达。SPARC表达还与乳腺癌的频繁微钙化关联(参见，例如，Bellahcene等人，同上)，这表明SPARC表达可负责乳腺转移对骨的亲和力。还已知SPARC结合白蛋白(参见，例如，Schnitzer, J.Biol.Chem.，269，6072 (1994))。
因此，存在对利用SPARC在疾病中的作用，特别地SPARC在一些癌症中的作用的组合物和方法的需要。
发明概述
在一个方面，本发明提供了包含SPARC结合抗体的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括1_12、Imml4、hHTI或其组合。
在另一个方面，本发明提供了诊断或治疗动物的疾病例如癌症的方法，包括施用诊断上或治疗上有效的量的包含SPARC结合抗体的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Tmml 2.Tmml 4.hHTI 或其组合。
本发明还提供了利用一种或多种抗癌剂和SPARC结合抗体治疗动物的肿瘤的方法，包括:从动物分离生物样品，检测所述生物样品中的SPARC蛋白的表达，定量所述生物样品中SPARC蛋白的量，如果生物样品中的SPARC蛋白高于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂和治疗有效量的抗SPARC抗体，或如果SPARC蛋白低于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂并且不施用SPARC结合抗体。按照本发明使用的用于定量SPARC表达的量的适当的生物样品包括例如血液、血清和血浆。根据本发明的用于治疗肿瘤的适当的SPARC结合抗体包括基于例如Imml2、Imml4、hHTI等的人源化SPARC结合抗体。适用于SPARC结合抗体的用途的生物样品中的SPARC的阈值水平可以为至少约4.3ng/ml，至少约43ng/ml或优选，至少约430ng/ml。
在本发明的所有方法和组合物中，可将SPARC结合抗体缀合至治疗或诊断活性试齐U。适合施用本发明提供的组合物和应用本发明的方法的适当动物包括但不限于人患者。
附图的几个视图的概述
图1为用于克隆和表达Imml至Imml2的Fab区域的pASK84的限制性图谱。
图2提供了两个人SPARC结合Fab克隆Fab6和Fabl6的氨基酸序列(SEQ IDN015-16)。
图3为用于克隆和表达Fabl6的pBAD载体的限制性图谱。
图4提供了 pBad中的Fab16的氨基酸序列(SEQ ID NO: 17)。
图5 为用于从 Fab6(SEQ ID NO: 15) Fab16 (SEQ ID NO: 16)克隆和表达完全人抗体Imml3和Imml4的pcDNA3002NE0载体的限制性图谱。
图 6 提供了 Imml (SEQ ID NOl 和 8)、Imm2 (SEQ ID N02 和 9)、Imm3 (SEQ ID N03和 10)、Imm4 (SEQ ID N04 和 11)、Imm6 (SEQ ID N05 和 12)、ImmlO (SEQ ID N06 和 13)和Imml2(SEQ ID N07和14)的构架区(FffR)和互补决定区(CDR)的氨基酸序列。
图7提供了针对人SPARC的Imml至Imm6和Imm8至Imml2上清液的1: 1、1:10和1:100稀释物以及对照mAb的定量ELISA结果。
图8 提供了浓度为 0.04 μ g/mL、0.2 μ g/mL、I μ g/mL 和 5 μ g/mL 的纯化的 Imml 至Imml2抗人SPARC抗体以及阳性和阴性对照的定量ELISA结果。
图 9 提供了比较 Imml、Imm3、Imm4、Imm7、Imm9 和 ImmlO 抗体对 HTI_SPARC(血小板SPARC)的结合以及ImmlO、Immll、Imml2和对照抗体对Biol-SPARC的结合的定量ELISA结果。
图10提供了在不同浓度上Fabl6对HT1-SPARC (血小板SPARC)和Biol-SPARC的结合的定量ELISA结果。
图11为使用表面等离子体共振技术产生的Fabl6对人HTI SPARC的结合的传感图。
图12为使用表面等离子体共振技术产生的Fabl6对人B101SPARC的结合的传感图。
图13提供了 Immll、Tmml 2.1mml3和Imml4在不同浓度上结合人SPARC的定量ELISA结果。
图14为抗变性的人SPARC的Imm系列抗体的Western印迹。
图15为描述SPARC结合抗体mHTI (称为Imml7)、Imml2和Imml4以及对照mlgG对荷有LL/2Lewis肺癌的动物的存活的影响的曲线。
图16提供了 I mml2、Imml4和mHTI (称为1_17)结合人和鼠SPARC的定量ELISA结果。
图17A为描述对于高SPARC和低SPARC，组群I (已接受先前化学疗法的患者(PC))的总存活的曲线。
图17B为对于高SPARC和低SPARC，组群2 (未接受先前化学疗法的患者(NPC))的总存活的曲线。
图18为描述在治疗之前和之后，组群I (先前化学疗法)和组群2 (无先前化学疗法)与正常对照相比较的SPARC水平的点图。
图19为描述治疗后血浆SPARC的百分比变化的条形图。
图20A为描述高风险群(群集I)和低风险群(群集2)中的患者的无进展存活(PFS)的曲线。
图20B为描述高风险群(群集I)和低风险群(群集2)中的患者的总存活(OS)的曲线。
图21为描述对于高风险(HR)和低风险(LR)群集，组群I (先前化学疗法)和组群2 (无先前化学疗法)的SPARC水平的点图。
图22A为描述与高风险(HR)群集中的所有患者相比较处于为0、1或2的风险水平的患者的无进展存活(PFS)的曲线。
图22B为描述与高风险(HR)群集中的所有患者相比较处于为0、1或2的风险水平的患者的总存活(OS)的曲线。
图23A为描述在 利用25mg/kg的5_氟尿嘧啶(5-FU)和0.lmg、0.15mg或0.20mg的SPARC治疗后与盐水或单独的5-FU相比较的肿瘤体积的曲线。
图23B为描述在利用多西他赛(10mg/kg)和0.2mg的SPARC治疗后与盐水、单独的多西他赛或单独的SPARC相比较的肿瘤体积的曲线。
图24A为描述在利用舒尼替尼(SUT) (30mg/kg) ,SPARC(BIOl) (0.2mg)和白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel) (ABX) (15mg/kg)治疗后与阴性对照、单独的SPARC、单独的白蛋白结合型紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇+舒尼替尼以及白蛋白合型紫杉醇+SPARC相比较的HT29肿瘤体积的曲线。
图24B为描述在利用贝伐单抗(AVS) (0.2mg) ,SPARC(BIOl) (0.2mg)和白蛋白结合型紫杉醇(ABX) (15mg/kg)治疗后与阴性对照、单独的SPARC、单独的白蛋白结合型紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇+贝伐单抗以及白蛋白结合型紫杉醇+SPARC相比较的HT29肿瘤体积的曲线。
图24C为描述在利用舒尼替尼(SUT) (30mg/kg) ,SPARC(BIOl) (0.2mg)和白蛋白结合型紫杉醇(ABX) (10mg/kg)治疗后与单独的白蛋白结合型紫杉醇以及白蛋白结合型紫杉醇+舒尼替尼相比较的MDA-MB-231肿瘤体积的曲线。
图24D为描述在利用贝伐单抗(AVS) (0.2mg) ,SPARC(BIOl) (0.2mg)和白蛋白结合型紫杉醇(ABX) (10mg/kg)治疗后与盐水、单独的SPARC、单独的白蛋白结合型紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇+贝伐单抗以及白蛋白结合型紫杉醇+SPARC相比较的PC3肿瘤体积的曲线。
图25为描述在施用Ομ g/mL、10 μ g/mL和100 μ g/mL的重组野生型人SPARC(BIOl)后与阴性对照DPBS相比较的每珠粒芽数的条形图。
图26A 描述了在 O μ g/mL、10 μ g/mL 和 100 μ g/mL 的重组野生型人 SPARC(BIOl)下的管形成。
图26B为描述在浓度为O μ g/mL、10 μ g/mL和100 μ g/mL的重组野生型人SPARC(BIOl)存在的情况下与阳性对照VEGF和未处理的管相比较的管长度的点图。
图27为描述与盐水、单独的SPARC和单独的白蛋白结合型紫杉醇相比较，利用SPARC(4mg/kg)和白蛋白结合型紫杉醇(10mg/kg)处理的MDA-MB-435-Luc+转移模型中的蛋白质水平表征的肺转移的点图。
图28 提供了包括 SPARC(10mg/mL)和 Imml2、SPARC 和 Imml4、SPARC 和 mHTI (鉴定为Imml7)、mIgG(阴性对照)、无抗体(阴性对照)以及在不存在SPARC或抗体的情况下的LL2转移组织样品中管形成的照片。
图29 提供了多种抗体包括 mHTI (称为 “HTI”)、Imm-12 和 Imm_14 与 Imm_2 和 Imm_3相比较的肿瘤定位的定量荧光结果。
发明详述
本发明涉及某些SPARC结合抗体，已分析了所述抗体的对人和鼠SPARC的结合特异性以及抑制血管生成和转移的能力。令人惊讶地，分析显示虽然三种抗体在筛选ELISA中结合天然和变性人SPARC，但仅有一种抗体也结合鼠SPARC。还令人惊讶地发现这三种抗体Imml2、Imml4和mHTI具有抗血管生成(即，抗肿瘤)和抗转移性质。
定义
〃肽〃和“多肽”在本文中可互换使用并且是指由通过肽键连接的氨基酸残基的链组成的化合物。多肽的"活性部分"意指比全长多肽短，但保持可测量的生物活性和保持生物检测的肽。
如本文中所用，术语“肿瘤”是指任何赘生性生长、增殖或细胞团，无论是良性的还是恶性的(癌性的)，无论是原发性位点损伤还是转移灶。
如本文中所用，术语“癌症”是指由已丧失对正常生长控制的易感性的细胞的增殖引起或表征的增殖性病症。相同组织类型的癌症通常始于相同组织，并且可基于它们的生物特征被分成不同亚型。癌症的4个一般种类是癌(上皮细胞衍生的)、肉瘤(结缔组织或中胚层衍生的)、白血病(形成血液的组织衍生的)和淋巴瘤(淋巴组织衍生的)。已知有200多种不同类型的癌症，并且可影响身体的每一个器官和组织。不限制癌症的定义的癌症的具体实例可包括黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。可受不同癌症影响的器官和组织的实例包括胰腺、乳腺、 甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、脑垂体、肾上腺、肾、胃、食管、直肠、小肠、结肠、肝、胆囊、头与颈、舌、嘴、眼和眼眶、骨、关节、脑、神经系统、皮肤、血液、鼻咽组织、肺、喉、尿道、宫颈、阴道、外分泌腺、和内分泌腺。可选择地，癌症可以是多中心的或可以是原发部位不明(CUPS)的。
如本文中所用，“适当的SPARC结合抗体”或“SPARC结合抗体”是能够特异性结合SPARC的抗体。
如本文中所用，“肿瘤靶向抗体”是指其中疾病为肿瘤、癌症、赘生物(neoplasm)等的疾病靶向抗体。
如本文中所用，“SPARC结合抗体”是指对于循环SPARC具有亲和力的抗体，其Kd在I或10或100或IOOOnM的范围内-优选小于或等于ΙΟηΜ。
如本文中所用，“治疗有效量”是指缓解(至一定程度，如由熟练医生判断的)哺乳动物的疾病或病况的一种或多种症状的组合物的量。此外，组合物的“治疗上有效的量”意指部分或完全回复至与疾病或病况相关或诱发疾病或病况的正常生理或生化参数的量。本领域临床医生可确定当例如静脉内、皮下、腹膜内、口服或通过吸入施用时为了治疗或预防特定疾病病况或病症的组合物的治疗有效量。为了在治疗上有效所需的组合物的精确量，除了许多患者特异性考虑外，将取决于许多因素例如活性试剂的比活性、使用的递送设备、试剂的物理特征、施用目的。但在理解本文中所示的公开内容后，治疗有效量的确定在本领域临床医生的能力之内。
如本文中所用，术语〃治疗”、〃处理〃、〃疗法〃和〃治疗性处理〃是指治愈性治疗、预防性治疗或防治性治疗。"预防疗法”的实例是靶向疾病(例如，癌症或其他增殖性疾病)或与其相关的病况的可能性的预防或减少。需要治疗的人包括已患有疾病或病况的人以及易于患有待预防的疾病或病况的人。如本文中所使用的术语“治疗”、“处理”、“疗法”和“治疗性处理”也描述了目的在于抵抗疾病或相关病况的哺乳动物的管理和护理，并且包括施用组合物以缓解疾病、病况的症状、副作用或其他并发症。癌症的治疗性处理包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法、基因疗法和免疫疗法。
如本文中所用，术语“试剂”或“药物”或“治疗剂”是指怀疑具有治疗性质的化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别地哺乳动物)细胞或组织制备的提取物。可纯化、大体上纯化或部分纯化试剂或药物。根据本发明的“试剂”还包括放射治疗剂或“化学治疗剂”。
如本文中所用，术语“诊断剂”是指允许利用方法例如ELISA定量血浆/循环SPARC的试剂。
如本文中所用，术语“化学治疗剂”是指具有抗癌、赘生物和/或增殖性疾病的活性的试剂。
如本文中所用，术语"放射治疗方案"或"放射疗法”是指施用辐射以杀伤癌细胞。辐射与细胞内的不同分子相互作用，但导致细胞死亡的主要靶是脱氧核糖核酸(DNA)。然而，放射疗法通常也导致对细胞和细胞核膜和其他细胞器的损伤。DNA损伤通常包括糖-磷酸酯主链的单链和双链断裂。此外，可存在能破坏细胞功能的DNA和蛋白质的交联。取决于辐射类型，DNA损伤的机制可变化，相对生物有效性亦变化。例如，重粒子(即，质子、中子)直接破坏DNA并且具有更大的相对生物有效性。然而，电磁辐射通过主要由细胞的水的电离产生的寿命短暂的羟基自由基导致间接的离子化作用。辐射的临床应用由外线束放射(来自外部来源)和短距离放射治疗(使用植入或插入患者的辐射源)组成。外线束辐射由X射线和/或Y射线组成，而短距离放射治疗使用衰变并且发射α粒子或β粒子连同Y射线的放射性核。
如本文中所用，术语〃备选治疗方案〃或〃备选疗法〃(非上述一线化学治疗方案)可包括例如受体酪氨酸激酶抑制剂(例如IreSSa (吉非替尼)、TarCevaTM(埃罗替尼)、ErbitUX (西妥昔单抗)、伊马替尼甲磺酸(Gleevec ));蛋白体抑制剂(例如硼替佐米(Velcade )) ;VEGFR2抑制剂例如PTK787 (ZK222584)、aurora激酶抑制剂(例如ZM447439);雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)抑制剂、环加氧酶-2 (C0X-2)抑制剂、雷帕霉素抑制剂(例如西罗莫司、(Rapamune ));法呢酰基转移酶抑制剂(例如替匹法尼(Zarnestra ));基质金属蛋白酶抑制剂(例如BAY12-9566 ;硫酸多糖tecogalan);血管生成抑制剂(例如阿瓦斯丁(Avastin )(贝伐单抗)；夫马洁林的类似物例如TNP-4 ;羧胺三唑；BB-94和BB-2516 ;沙利度胺；白细胞介素_12 ;三羧氨基喹啉(Iinomide);肽片段；和抗血管生长因子和血管生长因子受体的抗体)；血小板衍生生长因子受体抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、有丝分裂原激活的激酶抑制剂、有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶抑制剂、劳斯肉瘤病毒转化癌基因(SRC)抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、小缺氧诱导因子抑制剂、hedgehog抑制剂和TGF-β信号传导抑制剂。此外，免疫治疗剂也可被认为是备选治疗方案。例如，血清或含Y球蛋白的形成的抗体；非特异性免疫刺激佐剂；活性特异性免疫疗法；和过继免疫疗法。此外，备选疗法可包括其他基于生物学的化学实体例如多核苷酸，包括反义分子、多肽、抗体、基因疗法载体等。可单独或组合地或与本文中描述的其他治疗方案组合地施用此类备选治疗剂。组合治疗中备选治疗方案中使用的化学治疗剂和其他试剂的使用方法(包括给药和施用方案)对于本领域普通技术人员来说也是已知的。
如本文中所用，术语“肿瘤定位”意指在注射入荷瘤动物后，SPARC结合抗体在表达SPARC的肿瘤中所聚集的程度。肿瘤定位可通过任何适当的方法来测量，包括但不限于利用荧光染料标记抗体，将现有荧光抗体注射入具有肿瘤的动物，测定肿瘤荧光相对于来自远离任何肉眼可见肿瘤(gross tumor)的皮肤的突光的比率，其中如果所述比率>20,优选> 10，更优选>5，则 定位存在。
抗体
本发明提供了 SPARC结合抗体。具体地，SPARC结合抗体可以为Imml2、Imml4、mHT1、hHTI (mHTI的人源化形式)或其组合。
此外，本发明提供了能够结合血液中发现的SPARC例如HTI (血小板)SPARC和肿瘤部位发现的SPARC例如Biol-SPARC的SPARC结合抗体。各种测定抗体结合强度的方法对于本领域普通技术人员来说是已知的。
对于人用途，为了避免免疫原性和免疫应答，优选使用人源化SPARC结合抗体或适当的片段例如Fab’、Fab或Fab2。人源化抗体或其片段可以例如使用下列已建立的方法之一来产生:1)可使用人IgG骨架并以抗SPARC抗体的可变⑶R区替代其可变⑶R区来构建人源化抗体，其中重链和轻链独立地在分开的启动子下表达或在一个启动子下与IRES序列一起共表达；2)可使用经工程改造具有人免疫系统的小鼠产生针对SPARC的人源化单克隆抗体；3)可使用噬菌粒(M13、λ大肠杆菌噬菌体或能够表面呈递的任何噬菌体系统)产生针对SPARC的人源化抗体。为了构建全长抗体，可将可变区转移至重链和轻链的⑶R上。重链和轻链在哺乳动物细胞例如CH0、293或人髓样细胞中的共表达可提供全长抗体。类似地，可使用良好建立的方法制备Fab’、Fab或Fab2片段和单链抗体。
本发明还提供了特异性识别独特于血浆SPARC的表位的人源化抗体。人源化抗体通常为其中来自CDR的残基被来自非人物种例如小鼠、大鼠或兔子CDR的残基替代的具有期望的特异性、亲和力和能力的人抗体。在一些情况下，人抗体的Fv构架残基被相应的非人残基替代。任何适当的单克隆抗体可用作CDR的来源，例如，结合人和鼠SPARC，特别是结合循环人SPARC，在体外测定中显示良好的抗血管生成活性，以及在动物模型中具有前景的结果(例如，在异种移植模型系统中减少转移)的抗SPARC抗体。
人源化单克隆抗体存在4个一般步骤。这些步骤为:(I)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸序列和预测的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中将使用哪一个抗体构架区，(3)实际的人源化方法/技术和(4)转染和表达人源化抗体。参见，例如，美国专利 N0.4，816，567; 5, 807，715; 5，866，692; 6, 331，415; 5，530，101; 5，693，761; 5, 693，762; 5，585，089; 6，180，370 和 6，548，640 (将其通过引用并入本文)。例如，可将恒定区工程改造成更相似于人的恒定区，以在抗体被用于临床试验和人的治疗时避免免疫应答。参见，例如，美国专利N0.5，997，867和5，866，692 (将其通过引用并入本文)。
重要地，抗体被人源化保持对抗原的高亲和力和其它有利的生物性质。为了实现该目的，可通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念上的人源化产品的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且对于本领域普通技术人员来说是熟悉的。例示和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。此类展示的检查允许分析残基在行使候选免疫球蛋白序列的功能中的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从共有序列和输入序列选择和组合构架残基以便获得期望的抗体特征，例如增加的对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接和最实质性地参与影响抗原结合。人源化抗体还可在铰链区包含修饰以改进抗体的一个或多个特征。
或者，可利用噬菌体展示技术筛选和重组地制造抗体。参见，例如，美国专利N0.5，565，332; 5, 580，717; 5，733，743和6，265，150 (将其通过引用并入本文)。或者，可将噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature348:552-553 (1990))用于从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库体外产生人抗体和抗体片段。
在天然免疫应答中，抗体基因以高速率积累突变(体细胞高度突变)。引入的一些改变将赋予更高的亲和力，显示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在随后抗原攻击过程中优先复制和分化。该天然过程可通过应用称为“链改组”的技术来模拟。Marks，等人，Bio/Technol.10:779-783 (1992))。在该方法中，通过噬菌体展示获得的“初级”人抗体的亲和力可通过利用获自未免疫的供体的V结构域基因的天然存在的变体的文库(文库)连续替代重链和轻链V区域基因来增强。该技术使得能够产生具有在pM-nM范围内的亲和力的抗体和抗体片段。
基因改组还可用于从啮齿目动物抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿目动物抗体相似的亲和力和特异性。根据该方法(其也被称为“表位印迹(epitopeimprinting) ”)，利用一个文库的人V结构域基因替代通过噬菌体展示技术获得的啮齿目动物抗体的重链或轻链 V结构域基因，从而产生啮齿目动物-人嵌合体。针对抗原的选择导致能够恢复功能性抗原-结合位点的人可变区的分离，即表位控制(印迹)伴侣的选择。当重复该方法以替代剩余的啮齿目动物V结构域时，获得人抗体(参见PCT公布号W093/06213，1993年4月I日公布)。与通过⑶R移植进行的啮齿目动物抗体的常规人源化不同，该技术提供了不具有啮齿目动物来源的构架或CDR残基的完全人抗体。很明显虽然上文中的论述涉及人源化抗体，但所述的一般原理适用于定制用于例如狗、猫、灵长类动物、马和牛的抗体。
本发明的SPARC结合抗体包括完全抗体以及保留针对SPARC的结合位点的抗体的片段(例如，Fab’、Fab和Fab2)。抗体可以是任何种类的抗体例如IgM、IgA、IgG、IgE、IgD和IgY。抗体可以是例如二价、单价或嵌合抗体(一个针对SPARC的效价和另一个针对活性试剂(例如tTF或篦麻毒素A，或本文中描述的另一种活性试剂)的效价)。人源化抗体不限于IgG。相同的技术可用于产生所有其它种类的抗体例如IgE、IgA、IgD、IgM，每一种抗体具有不同的适当地针对特定疾病靶的抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。抗体的功能性片段可通过限制性蛋白水解来产生。此类片段可以是单价的(例如Fab’ )或双价的(例如Fab2)。还可在大肠杆菌(E.coli)中将片段合成为单链scfv或微型双功能抗体(diabody)。
组合物
本发明提供了包含上述SPARC结合抗体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含Imml2、Imml4、mHTI或hHTI连同适当的载体。在其它实施方案中，组合物包含Imml2、Imml4、mHTI或hHTI的组合以及适当载体。在优选实施方案中，组合物是包含SPARC结合抗体和药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。
本发明的组合物还可包含活性试剂。在一些实施方案中，活性试剂为能够直接产生其药理学效应的药学活性治疗剂。在其它实施方案中，活性试剂为诊断剂。在优选实施方案中，活性试剂为缀合有SPARC结合抗体或与其一起施用的诊断性或治疗性活性试剂。应理解一些活性试剂可用作诊断和治疗剂，因此此类术语不是相互排斥的。
本发明的组合物可用于相对于单独的活性试剂的递送增强活性试剂至患病部位的递送，或增强SPARC的清除，从而导致SPARC的血液水平的降低。在优选实施方案中，SPARC的血液水平的降低为 至少约10%。在更优选实施方案中，SPARC的血液水平的降低为至少约 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45% 或最优选至少约 50%。
活性试剂可以是任何适当的治疗剂或诊断剂例如化学治疗剂或抗癌剂。适当的诊断剂包括荧光染料、放射性试剂、MRI造影剂、X射线造影剂、超声造影剂和PET造影齐U。根据本发明使用的适当的化学治疗剂或其他抗癌剂包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(genistein)、生物活性试剂(TNF、tTF)、放射性核素(1311、90Y、lllIn、211At、32P 和其他已知的治疗性放射性核素)、阿霉素、安莎霉素类抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺钼、卡钼、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)及衍生物、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烧、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泰素、考布他汀、discodermolide和反钼。
根据本发明使用的其他适当的化学治疗剂包括但不限于抗代谢药例如，天冬酰胺酶)、抗有丝分裂物质(例如，长春花生物碱)、DNA损伤剂(例如，顺钼)、促细胞凋亡剂(诱导程序化细胞死亡或细胞凋亡的试剂)(例如，epipodophylotoxins)、分化诱导剂(例如，维生素A酸类(retinoids))、抗生素(例如，博来霉素)和激素(例如，他莫昔芬、己烯雌酚(diethylstilbestrol))。此外,根据本发明使用的适当的化学治疗剂包括抗血管生成试剂(血管生成抑制剂)例如，IFN-α、夫马洁林、血管他丁、内皮他丁、沙立度胺等。许多其它抗血管生成试剂已被鉴定并且在本领域是已知的,包括由Carmeliet和Jain (2000)列出的那些。抗血管生成试剂可以是天然存在的或非天然存在的。在一些实施方案中，化学治疗剂为合成抗血管生成肽。例如，先前已报告小的合成的促细胞凋亡肽的抗血管生成活性包括两个功能结构域，一个靶向肿瘤微血管上的CD13受体(氨肽酶N)并且另一个在内化后破坏线粒体膜。Nat.Med.1999，5 (9):1032-8。在其它实施方案中，抗血管生成试剂为第二代二聚肽 CNGRC-GG-d(KLAKLAK)2，称为 HKP (猎人杀手肽(Hunter KillerP印tide))，经发现具有提高的抗肿瘤活性。在某些实施方案中，抗血管生成试剂不是抗-VEGF抗体(例如贝伐单抗)，虽然本领域普通技术人员也理解可根据本发明使用贝伐单抗。
优选化学治疗剂包括多西他赛、紫杉醇及其组合。“其组合”是指包含超过I种药物剂型的施用，例如多西他赛和紫杉醇，以及多西他赛与紫杉醇的连续地但时间上不同的施用(例如，在一个周期中使用多西他赛但在下一周期中使用紫杉醇)。特别优选的化学治疗剂包含蛋白质结合药物的颗粒，包括但不限于，其中组成蛋白质结合的药物颗粒的蛋白质包括白蛋白，包括其中超过50%的化学治疗剂以纳米颗粒形式存在。最优选，化学治疗剂包含白蛋白结合的紫杉醇的颗粒例如Abraxane 。可按照本发明使用此类白蛋白结合的紫杉醇制剂(称为“白蛋白结合型紫杉醇”)，其中施用的紫杉醇剂量为约30mg/m2至约1000mg/m2，约3周的给药周期(即，约每3周一次施用紫杉醇的剂量)。此外，理想地，施用的紫杉醇的剂量为约50mg/m2至约800mg/m2,优选约80mg/m2至约700mg/m2,最优选约250mg/m2至约300mg/m2，约3周的给药周期。其他治疗剂还包括但不限于生物活性多肽、抗体和其片段、外源凝集素和毒素(例如篦麻毒素A)或放射性核素。用作根据本发明的活性试剂的适当抗体包括但不限于缀合(偶联的)或未缀合的(未偶联的)抗体、单克隆或多克隆抗体、人源化或非人源化的抗体以及Fab'、Fab或Fab2片段、单链抗体等。涉及的抗体或抗体片段可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fe片段。在不同优选实施方案中，活性试剂是抗体本身的Fe片段、单链抗体、Fab片段、微型双功能抗体(diabody)等。在更优选实施方案中,抗体或抗体片段介导补体激活、细胞介导的细胞毒性、调理作用、肥大细胞活化和/或其它免疫应答。此外，药学活性试剂可以是siRNA。在优选实施方案中，SiRNA分子抑制与肿瘤相关的基因(例如c-Sis和其他生长因子、EGFR、PDGFR, VEGFR、HER2、其他受体酪氨酸激酶、Src-家族基因、Syk-ZAP-70家族基因、BTK家族基因、其他细胞质酪氨酸激酶、Raf激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、其他细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶、Ras蛋白和其他调节性GTP酶)的表达。还可将SPARC结合抗体缀合于聚乙二醇(PEG)。PEG缀合能够增加蛋白质的循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性和抗原性，并改善其生物活性。可以使用任意合适的缀合方法，包括但不限于:例如，使甲氧基-PEG与SPARC结合抗体的可供利用的氨基或其它活性反应位点例如组氨酸或半胱氨酸反应。此外，可以使用重组DNA法将具有PEG反应活性基团的氨基酸添加到本发明的SPARC结合抗体中。可在将PEG与SPARC结合抗体反应之前加工PEG，例如，可将接头基团添加到PEG。此外，本发明可以使用可释放的和杂合的PEG化策略，例如SPARC结合抗体的PEG化，以便添加到SPARC结合抗体中的某些位点的PEG分子在体内被释放。此类PEG缀合方法是本领域已知的(参见,例如，Greenwald等人，Adv.DrugDelivery Rev.55:217-250(2003)。涉及的SPARC结合抗体和其缀合物，可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)以及与无机酸例如盐酸或磷酸形成的盐，或与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等。
通常在包含载体例如药学上可接受的载体的制剂中提供本发明的组合物。载体通常是液体，但也可以是固体，或液体与固体成分的组合。载体优选为生理上可接受的(例如药学上可接受的或药理学上可接受的)载体(例如赋形剂或稀释剂)。适当的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、重量克分子渗透压浓度调节剂、缓冲剂和PH调节剂。适当的添加剂包括生理上生物相容性缓冲剂、螯合剂或钙螯络合物的添加或任选地，钙或钠盐的添加。可包装药物组合物以以液体形式使用，或可进行冷冻干燥。优选生理上可接受的载体介质是水、缓冲的水、生理盐水、0.4%的盐水、0.3%的甘氨酸、透明质酸等。生理上可接受的载体是本领域公知的并且是可以容易获得的。载体的选择可至少部分地通过靶组织和/或细胞的位置和用于施用组合物的具体方法来确定。
可配制用于通过途径包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、脑硬膜上、表面、经皮、皮下、经粘膜(包括例如肺)、鼻内、经直肠、经阴道或口服途径施用的组合物。所述组合物还可包含另外的成分例如稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂和pH调节剂等。
适合用于注射施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标接受体的血液等渗的溶质；水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、冷冻保护剂和防腐剂。制剂的形式可以是单元剂量或多剂的密封的容器，例如安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件下，在临使用前，仅需要添加无菌的液体载体例如用于注射的水。可以从无菌粉末、颗粒或片剂来制备即用型的注射溶液和悬浮液。
可通过以所需的量将活性试剂与一种上面例举的成分或其组合(根据需要)一起掺入适当的溶剂，然后过滤灭菌来制备无菌注射液。优选地用于注射的溶液不含内毒素。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和来自上面列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分+来自其先前无菌过滤的液体的任何另外理想的成分的粉末。在所有情况下，制剂必须是无菌的并且其流动性必须达到容易注射的程度。其在生产和储存的条件下必须是稳定的，并且必须能抗微生物例如细菌和真菌的污染作用而保存。可以在水中通过适宜地与表面活性试剂例如羟基纤维素混合来制备游离碱或药学上可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散液。在通常的 储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以阻止微生物的生长。
在优选实施方案中，可以将活性成分捕获在例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳剂中的聚羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol, A.Ed.(1980)。具体地，可通过这样的方法如Rezler等人，J.Am.Chem.Soc.129(16):4961-72(2007) ; Samad 等人，Curr.Drug Deliv.4(4):297-305(2007);以及美国专利4，485，045和4，544，545中描述的方法来制备包含SPARC结合抗体的脂质体。具有增加的循环时间的脂质体公开于美国专利5，013，556中。
特别有用的脂质体可通过例如反相蒸发法利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂组合物产生。可通过确定孔径的过滤器挤出脂质体以产生具有理想的直径的脂质体。可如Werle等人，Int.J.Pharm.370(1-2):26-32(2009)中所述，将本发明的多肽缀合至脂质体。
在其他实施方案中，可使用天然病毒或病毒样颗粒、树枝状大分子、碳纳米装配物、聚合物载体、顺磁颗粒、磁铁颗粒、聚合物小体(polymersome)、filomicelle、胶束或脂蛋白递送组合物。
至气道内的施用可提供全身性或局部施用，例如至气管和/或肺。此类施用可使用气雾剂、溶液和设备例如支气管镜通过吸入或通过身体敷用来进行。对于吸入，本文中的组合物可方便地利用吹入器、喷雾器、泵、加压封装装置(pressurized pack)或用于递送气雾剂的其他方便的方法、粉末的非气雾喷雾器或液体的非气雾喷雾器递送。加压封装装置可包括适当的推进剂例如液化气体或压缩气体。液化气体包括例如氟化氯化烃类、氯氟烃、hydrochlorocarbon,烃类和烃醚类。压缩气体包括例如氮气、氧化亚氮和二氧化碳。具体地，包括二氟二氯甲烷、三氯 氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体的使用。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以递送控制的量来确定剂量单位。在施用干燥粉末组合物中，粉末混合物可包括适当的粉末基底例如乳糖或淀粉。粉末组合物可以以单位剂型例如胶囊、药筒或可借助于吸入器或吹入器从其施用粉末的泡罩包装(blister pack)提供。
还可通过经粘膜或经皮肤方法进行全身性施用。对于经粘膜或经皮肤施用，将适合于待穿过的屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂在本领域内通常是已知的，并且对于经粘膜施用，包括例如去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻腔喷雾、吸入的气雾剂、直肠或阴道栓剂、漱口药、速溶片剂或锭剂来实现。对于经皮肤施用，将活性成分配制于软膏、药膏、凝胶、泡沫或乳膏剂中，如本领域内通常已知的。
可使用药物递送系统递送药物组合物。此类递送系统包括透明质酸溶液或胶原片段的悬液。可将药物配制在微胶囊中，利用适当的聚合材料设计以用于控制释放，例如聚乳酸、乙轻纤维素、聚已酸内酯、聚已酸内酯二醇(polycaprolactone diol)、多聚赖氨酸、聚乙醇酸、聚马来酸、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]等。使用药物递送系统的特定制剂可以以液体悬液、软膏、复合至绷带、胶原罩(collagen shield)等的形式存在。
组合物还可包含任何其他适当的成分，特别地用于增强组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，存在多种本发明的组合物的制剂。
持续释放的组合物还可用于本发明的组合物，例如在例如美国专利5，672，659和5，595，760中描述的组合物。立即或持续释放组合物的使用取决于待治疗的病况的性质。如果病况由急性或超急性的障碍组成，则利用立即释放的治疗优于延长释放组合物。或者，对于某些预防性或长期治疗，持续释放组合物可以是适当的。
此外，组合物可包含额外的治疗或生物活性试剂。例如，可存在在特定适应症的治疗中有用的治疗因子。控制炎症的因子例如布洛芬或留类可以是减小与药物组合物的体内施用和生理压力相关的肿胀和炎症的组合物的部分。
由本发明提供的组合物可包括例如约0.5mL至约4mL的具有偶联至SPARC结合抗体的活性试剂的水性或有机液体，活性试剂的浓度为约10mg/mL至约100mg/mL,优选约lmg/mL至约10mg/mL,更优选约0.lmg/mL至约lmg/mL。活性试剂可以以任何适当的和治疗上有效的浓度存在，例如，浓度为约10mg/mL至约50mg/mL的贝伐单抗。
方法
技术领域：
本发明提供了通过施用诊断或治疗有效量的包含SPARC结合抗体的组合物来诊断或治疗动物的疾病的方法，所述SPARC结合抗体包括Imml2、Imml4、mHT1、hHTI或其组合。在一些实施方案中，本发明提供了通过施用有效量的Imml2、Imml4、mHT1、hHTI或其组合来诊断动物的疾病的方法。在其它实施方案中，本发明提供了通过施用有效量的Imml2、Imml4、mHT1、hHTI或其组合来治疗动物的疾病的方法。上述任何组合物可用于本发明的方法。
根据本发明的方法，可给哺乳动物施用治疗有效量的组合物以相对于单独的活性试剂的递送增加活性试剂至疾病部位的递送，或增加清除，从而导致SPARC的血液水平下降。在优选实施方案中，SPARC的血液水平的下降为至少约10%。在更优选实施方案中，SPARC的血液水平的下降为至少约15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或最优选至少约50%。
本发明还提供了诊断动物的疾病或病况的方法，包括(a)给动物施用诊断有效量的SPARC结合抗体，所述SPARC结合抗体包括Imml2、Imml4、mHT1、hHTI或其组合；(b)检测存在于动物的特定部位或组织中的SPARC结合抗体的量；和(c)如果存在的SPARC结合抗体的量显示显著高于正常水平的SPARC存在于特定部位或组织中，则疾病或病况存在。
同样的，本 发明还提供了利用一种或多种抗癌剂和SPARC结合抗体治疗动物的肿瘤的方法，包括:从动物分离生物样品，检测所述生物样品中的SPARC蛋白的表达，定量生物样品中的SPARC蛋白的量，如果存在于生物样品中的SPARC蛋白显示高于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂和治疗有效量的抗-SPARC抗体，或者如果SPARC蛋白低于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂并且不施用SPARC结合抗体。
通常使用抗-SPARC抗体检测存在于样品中的SPARC蛋白的水平。然而，在一些实施方案中，可仅使用抗体的一部分，使用不为抗体的SPARC结合分子或使用一些检测SPARC表达、不需要抗体或SPARC结合分子的其它方法来测定SPARC蛋白的表达。
本方法可用于特征在于SPARC的过表达的任何病况。本发明对于其是有用的示例性疾病包括任意身体组织包括软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等中的异常增殖的病况、组织重构、增生、扩大的伤口愈合。可使用本发明的方法和组合物治疗或诊断的疾病的实例包括癌症、糖尿病或其它肾病、炎症、纤维化、关节炎、血管或人工血管移植物或血管内装置的再狭窄等。
本发明的方法的范围内的其它疾病包括但不限于癌症、再狭窄或其他增殖性疾病、纤维化、骨质疏松症或扩大的伤口愈合。具体，此类适当的疾病包括但不限于，其中:(a)癌症可以是例如原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、血液肿瘤、乳腺癌、脑癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、多发性骨髓瘤、肝癌、白血病、淋巴瘤、口癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、和甲状腺癌，(b)再狭窄可以是例如冠状动脉再狭窄、脑动脉再狭窄、颈动脉再狭窄、肾动脉再狭窄、股动脉再狭窄、周围动脉再狭窄或其组合，(C)其他增殖性疾病可以是例如超常增生(hyperplasias)、子宫内膜异位症、肥大性症痕(hypertrophic scars)和症痕挖瘡(keloid)、增生性糖尿病视网膜病、肾小球肾炎、增生性肺动脉高压、类风湿关节炎、动静脉畸形、粥样硬化斑块、冠状动脉疾病、延迟伤口愈合、血友病性关节(hemophilic joints)、不连接骨折(nonunionfractures)、郎-奥韦综合征(Osler-Weber syndrome)、银屑病、化脓性肉芽肿、硬皮病、tracoma、月经过多、血管粘附和乳头状瘤和(d)纤维化疾病可以是例如肝纤维化、肺纤维化和腹膜后纤维化。动物可以是需要治疗或诊断的任何患者或受试者。在优选实施方案中，动物是哺乳动物。在特别优选实施方案中，动物是人。在其它实施方案中，动物可以是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、马、牛或非人灵长类动物。本发明还提供了使用抗SPARC中和抗体例如适当的SPARC结合抗体抑制SPARC活性的方法。中和抗体具有在体内阻断SPARC与其效应物的相互作用，例如SPARC与细胞表面组分的相互作用或SPARC对其天然配体例如白蛋白、生长因子和Ca2+的结合的能力。本发明提供了用于将化学治疗剂递送至动物的肿瘤的方法。该方法包括给人或其它动物施用治疗有效量的药物组合物，其中药物组合物包含偶联至适当的SPARC结合抗体的化学治疗剂和药学上可接受的载体。结合本发明的其它实施方案的本文中所示的化学治疗剂、动物及其组分的描述也适用于将化学治疗剂递送至肿瘤的上述方法的相同方面。其对化学疗法的应答可被预测或测定，可按照本发明进行治疗的待检测的肿瘤的类型通常是在人和其它哺乳动物中发现的那些肿瘤类型。肿瘤同样地也可以是接种(例如在实验室动物中)的结果。许多类型和形式的肿瘤可在人和其它动物病况中遇到，并且无意将本发明的方法的应用限定于任何特定肿瘤类型或种类。正如已知的，肿瘤包括因不受控制的和进行性细胞分裂而产生的并且通常也称为“赘生物(neoplasm) ”的异常组织团块。本发明的方法对于例如人的肿瘤细胞和结合的间质细胞、实体瘤和与软组织结合的肿瘤例如软组织肉瘤是有用的。肿瘤或癌可位于口腔和咽、消化系统、呼吸系统、骨和关节(例如，骨转移)、软组织、皮肤(例如，黑素瘤)、乳腺、生殖系统、泌尿系统、眼和眼眶、脑和中枢神经系统(例如，神经胶质瘤)或内分泌系统(例如，甲状腺)，并且不一定限定于原发性肿瘤或癌症。与口腔相关的组织包括但不限于舌和嘴的组织。癌症可在消化系统的组织中产生，例如食道、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝、胆囊和胰腺。呼吸系统的癌可影响喉、肺和支气管并且包括例如小细胞和非小细 胞肺癌。肿瘤可产生于组成男性和女性生殖系统的子宫颈、子宫体、卵巢外阴、阴道、前列腺、睾丸和阴茎，以及构成泌尿系统的膀胱、肾、肾盂和输尿管。肿瘤或癌可位于头和/或颈(例如，喉癌和甲状旁腺癌)。肿瘤或癌还可位于造血系统或淋巴系统，包括例如，淋巴瘤(例如，何杰金病和非何杰金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤或白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病等)。优选地，肿瘤位于膀胱、肝、卵巢、肾、肠、脑或乳腺。在其它实施方案中，本发明提供了用于通过SPARC结合抗体将药学活性试剂递送至特征在于SPARC的过表达的疾病的部位的方法。此类疾病包括异常增殖状况、组织重塑、超常增生和身体组织(例如，软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等)的扩大的伤口愈合。可通过施用包含偶联至适当的SPARC抗体的治疗剂的药物组合物治疗或诊断的疾病的实例包括癌症、糖尿病或其它视网膜病变、炎症、关节炎、血管的再狭窄、人造血管移植或血管内装置等。与本发明的其它实施方案结合的本文中所示的化学治疗剂、肿瘤、动物和其组分的描述也适用于递送药物活性试剂的上述方法的相同方面。在其它实施方案中，本发明的方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的包含脂质体结合的或白蛋白结合的化学治疗剂的药物组合物，其中脂质体或白蛋白被偶连至适当的疾病靶向SPARC结合抗体。可使用任何适当的方法将化学治疗剂偶连至SPARC结合抗体。优选地，通过共价键包括例如二硫键将化学治疗剂化学地偶连至化合物。也可按照本发明的方法施用一个或多个剂量的一种或多种化学治疗剂例如上述化学治疗剂。本发明方法中使用的化学治疗剂的类型和数目将取决于用于特定肿瘤类型的标准化学治疗方案。换句话说，虽然可利用单一化学治疗剂常规地治疗特定癌症，但也可用化学治疗剂的组合常规地治疗另一种特定癌症。用于将适当的治疗剂、化学治疗剂、放射性核素等偶联或缀合至抗体或其片段的方法在本领域已进行了详尽说明。下列实例进一步举例说明了本发明，但当然，不应当解释为以任何方式限制其范围。根据本发明的方法包括例如组合治疗，其中动物也正在经历一个或多个选自手术、化学疗法、放射疗法、热疗法(thermotherapy)、免疫疗法、激素疗法和激光疗法的癌症治疗法。术语“共施用”和“组合治疗”是指给受试者施用两种或更多种治疗活性试剂。可将试剂包含在单一药物组合物中并且同时施用，或可将试剂包含在分开的制剂中，并且相继地给受试者施用。只要可在受试者中同时检测到两种试剂，两种试剂就被认为是共施用的。本发明中涉及的组合治疗可包括但不限于抗体施用、疫苗施用、细胞毒性试剂、天然氨基酸多肽、核酸、 核苷酸类似物和生物反应调节剂的施用。可一起或相继使用两种或更多种组合的化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化试剂、抗代谢药、天然产物、激素和拮抗剂以及杂类。烷基化试剂的实例包括氮芥例如氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-sarcolysin)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺例如六甲三聚氰胺和塞替派；烷基磺酸盐例如白消安；亚硝基脲例如卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、洛莫司汀(CCNU)和链佐星(链脲佐菌素)；DNA合成拮抗剂例如磷酸雌莫司汀；和三嗪例如达卡巴嗪(DTIC、二甲基-三嗪咪唑羧酰胺)和替莫唑胺。抗代谢物的实例包括叶酸类似物例如甲氨蝶呤(amethopterin);喃唳类似物例如氟尿喃唳(5-氟尿喃唳、5-FU、5FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷、FUdR)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)和吉西他滨；嘌呤类似物例如巯嘌呤(6-niercaptopurine、6_MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤，TG)和喷司他丁(2’-deoxycoformycin、deoxycoformycin)、克拉屈滨和氟达拉滨；和拓扑异构酶抑制剂例如安吖啶。天然产物的实例包括长春碱例如长春碱(VLB)和长春新碱；紫杉烷例如紫杉醇(Abraxane )和多西他赛(Taxotere );表鬼日毒素例如依托泊苷和替尼泊苷；喜树碱例如托泊替康和伊立替康；抗生素类例如放线菌素D(actinomycin D)、柔红霉素(daunomycin、正定霉素)、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素(丝裂霉素C)、伊达比星、表柔比星；酶例如L-天冬酰胺酶；和生物应答调节剂例如干扰素-α和白细胞介素2。激素和拮抗剂的实例包括促黄体释放激素激动剂例如例如布舍瑞林；肾上腺皮质激素例如泼尼松和相关制剂；孕激素例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素例如己烯雌酚和炔雌醇和相关制剂；雌激素拮抗剂例如他莫昔芬和阿那曲唑；雄激素例如丙酸睾酮和氟甲睾酮和相关制剂；雄激素拮抗药例如氟他胺和比卡鲁胺；和促性腺素释放激素类似物例如亮丙瑞林。杂类的实例包括沙利度胺；钼的配合物例如顺钼(czs-DDP)、奥沙利钼和卡钼；蒽二酮(例如米托蒽醌)；取代的脲例如羟基脲；丙卡巴肼衍生物例如丙卡巴肼(N-丙卡巴肼、MIH);肾上腺皮质抑制剂例如米托坦(邻、对’-DDD)和氨鲁米特；RXR激动剂例如贝沙罗汀(bexarotene);和酪氨酸激酶抑制剂例如伊马替尼。
本发明的方法中表征的药物组合物可以以单次剂量或以多剂量施用。当通过输注施用抗体时，输注可是单次持续给药或可以通过多次输注递送。可将试剂直接注射进入异常靶基因表达的位置上或附近的组织。可将试剂多次注射进入所述位置上或附近的组织。
为约lug/kg至100mg/kg的体重/施用的量级的剂量水平在疾病的治疗中是有用的。关于剂量，抗体可以以小于约75mg/kg的体重或小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1,0.5,0.1,0.05,0.01,0.005,0.001 或 0.0005mg/kg 的体重和小于 200nmol 的抗体 /kg 的体重或小于 1500、750、300、150、75、15、7.5,1.5,0.75,0.15,0.075,0.015,0.0075,0.0015、0.00075,0.00015nmol的抗体/kg的体重的单位剂量施用。可以例如通过注射(例如，静脉内或肌内、鞘内或直接至器官内)、吸入或表面施用来施用单位剂量。
本领域普通技术人员也可容易地确定用于向给定的受试者施用本发明的抗体的适当的剂量方案。例如，可在SPARC表达的部位上或其附近以单次注射或沉积的方式给受试者施用SPARC-结合抗体组合物一次。可每天一次、每半周一次、每周一次、每二周一次、每半月一次、每月一次、每两月一次或在医生的指导下施用本发明的组合物。在一些实施方案中，可每天一次或二次给受试者施用组合物，进行约3至约28天，更优选约7至约10天的时期。在其他实施方案中，以低于每天一次，例如低于每2、4、8或30天一次的频率施用单位剂量。在其他实施方案中，不定期(例如，无规律的频率)施用单位剂量。
当给药方案包括多个施用时，应理解给受试者施用的有效量的SPARC-结合抗体组合物可包括在整个给药方案期间施用的抗体的总量。本领域普通技术人员应理解，确切的单个剂量可取决于多个因素而作稍微调整，包括待施用的具体SPARC结合抗体组合物、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速度、待治疗的具体病症、病症的严重度、寡核苷酸试剂的药代动力学以及患者的年龄、性别、体重和一般健康状况。鉴于不同施用途径的不同功效，预期存在必需剂量水平的广泛变化。
可在单 次剂量或在两次或更多次剂量中施用有效剂量，如在特定情况下需要或考虑的。如果需要促进重复或经常性输注，递送设备例如泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储池(reservoir)的植入可以是理想的。在成功的治疗后，可能需要使患者经历维持治疗以预防疾病状态的复发。抗体组合物的浓度是足以有效地治疗或预防病症或调节人的生理条件的量。施用的抗体的浓度或数量将取决于就施用的试剂和施用方法测定的参数。
某些因素可影响有效地治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重度、先前的治疗、受试者的一般身体状况和/或年龄和其他现有疾病。还应理解，用于治疗的抗体的有效剂量可在整个特定治疗的过程中增加或减少。剂量的变化可产生于并且根据诊断测定的结果而变得显然。例如，可在施用抗体组合物后监控受试者。基于来自监控的信息，可施用额外量的抗体组合物。本领域普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方案和重复率。
实施例1
本实施例显示一系列能够结合人SPARC的抗体的制备。
使用小鼠品系RBF/DnJ，利用常规杂交瘤法在商业上产生12种小鼠来源的抗人SPARC抗体。
将pASK84表达载体(图1)用于表达命名为Imml至Imml2的所得抗体的Fab区域。Fab区域被靶向外周，在外周中收集它们，随后在蛋白A琼脂糖柱上通过活动层析(activity chromatography)进行纯化。利用Western印迹验证身份，利用ELISA验证SPARC结合活性。
Imml3和Imml4是使用人噬菌体展示文库产生的完全人抗-人SPARC抗体。针对商业人 Fab 噬菌体展示文库HuFabL (CreativeBiolabs, Shirley, NY)淘选 SPARC。鉴定了两个目标Fab序列:Fab6 (SEQ ID NO 15) Fab 16 (SEQ ID N016)，如图2中显示的。通过ELISA验证这两个Fab分子的SPARC结合活性。
将这些Fab区域克隆入pBAD载体(图3)，将其在细菌中进行表达和纯化。从裂解的细菌的周质级分分离由PBAD载体表达的Fab蛋白，序列提供于图4中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳验证从周质级分获得的Fab区域的身份。将Fab蛋白在蛋白A琼脂糖柱上通过活动层析纯化至均质。
为了产生完全人SPARC结合抗体，通过pcDNA3002Neo载体(Invitrogen, Carlsbad, CA)(图5)克隆和表达Fab6和Fabl6的基因。纯化所得的抗体，通过凝胶电脉和N-末端分析验证其身份。将从Fab6产生的完全人抗体命名为Imml3,将从Fabl6产生的完全人抗体命名为Imml4。
在按照上述方法产生它们后，通过利用商业小鼠同种型分型测试试剂盒(AbDSerotec, Raleigh, NC)按照同种型表征Imml至Imml4抗体。结果示于表I中。
表权利要求
1.一种包含SPARC结合抗体的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imml2、Imml4、hHTI或其组合。
2.权利要求1的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括hHTI。
3.权利要求1的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imml2。
4.权利要求1的组合物,其中所述SPARC结合抗体包括Imml4。
5.权利要求1至4的任一项的组合物，其还包括缀合至SPARC结合抗体的活性试剂。
6.权利要求5的组合物，其中所述活性试剂包括治疗剂或诊断剂。
7.权利要求6的组合物，其中治疗剂或诊断剂为选自如下试剂的治疗剂:酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性试剂、生物分子、放射性核素、阿霉素、安莎霉素类抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺钼、卡钼、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泰素、考布他汀、discodermolide、反钼、抗-血管内皮生长因子化合物(“抗-VEGF”)、抗-表皮生长因子受体化合物(“抗-EGFR”)、5_氟尿嘧啶及衍生物、放射性核素、多肽毒素、细胞凋亡诱导剂、治疗增敏剂、酶或其活性片段，及其组合。
8.权利要求6的组合物，其中所述治疗剂或诊断剂为包含抗体或抗体片段的治疗剂。
9.权利要求8的组合物，其中所述抗体或抗体片段为IgG或IgA或IgD或IgE或IgM的Fe片段。
10.权利要求8或9的组合物，其中所述抗体或抗体片段介导补体活化、细胞介导的细胞毒性或调理作用、或肥大细胞活化或其它免疫应答中的一种或多种。
11.权利要求6的组合物，其中所述治疗剂或诊断剂为选自荧光染料、放射性试剂、MRI造影剂、X射线造影剂、超声造影剂和PET造影剂的诊断剂。
12.权利要求1-11的任一项的组合物，其中所述组合物包含在脂质体中。
13.权利要求1-11的任一项的组合物，其中所述组合物包含在白蛋白纳米颗粒中。
14.权利要求1-13的 任一项的组合物，其中所述组合物还包含适当的药学载体。
15.权利要求1-16的任一项的组合物，其中通过静脉内，通过表面，通过注射，通过吸入，鼻内，经直肠或口服途径给患者施用所述组合物。
16.一种用于诊断或治疗动物的疾病的方法，包括施用诊断或治疗有效量的包含SPARC结合抗体的组合物，其中所述SPARC结合抗体包括Imml2、Imml4、hHTI或其组合。
17.权利要求16的方法，其中所述SPARC结合抗体包括hHTI。
18.权利要求16的方法，其中所述SPARC结合抗体包括Imml2。
19.权利要求16的方法，其中所述SPARC结合抗体包括Imml4。
20.权利要求16-19的任一项的方法，其中所述组合物还包含缀合至SPARC结合抗体的活性试剂。
21.权利要求20的方法，其中所述活性试剂包含治疗剂或诊断剂。
22.权利要求21的方法，其中所述治疗剂或诊断剂为选自下列试剂的治疗剂:酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性试剂、生物分子、放射性核素、阿霉素、安莎霉素类抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺钼、卡钼、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泰素、考布他汀、discodermolide、反钼、抗-血管内皮生长因子化合物(“抗-VEGF”)、抗-表皮生长因子受体化合物(“抗-EGFRs”)、5-氟尿嘧啶及衍生物、放射性核素、多肽毒素、细胞凋亡诱导剂、治疗增敏剂、和酶或其活性片段。
23.权利要求21的方法，其中所述治疗剂或诊断剂为包含抗体或抗体片段的治疗剂。
24.权利要求23的方法，其中所述抗体或抗体片段为IgG、或IgA、或IgD、或IgE或IgM的Fe片段。
25.权利要求23或24的方法，其中所述抗体或抗体片段介导补体活化、细胞介导的细胞毒性或调理作用、或肥大细胞活化或其它免疫应答中的一种或多种。
26.权利要求21的方法，其中所述治疗剂或诊断剂为选自荧光染料、放射性试剂、MRI造影剂、X射线造影剂、超声造影剂和PET造影剂的诊断剂。
27.权利要求16-26的任一项的方法，其中所述组合物还包含适当的药学载体。
28.权利要求16-27的任一项的方法，其中通过静脉内，通过表面，通过注射，通过吸入，鼻内，经直肠或口服途径给患者施用治疗有效量的所述组合物。
29.权利要求16-28的任一项的方法，还包括施用治疗有效量的白蛋白结合的纳米颗粒紫杉醇。
30.权利要求16的方法，其中所述肿瘤选自:口腔肿瘤、咽肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、骨肿瘤、软骨肿瘤、骨转移、肉瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤、生殖系统肿瘤、尿道肿瘤、眼眶肿瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、神经胶质瘤、内分泌系统肿瘤、甲状腺肿瘤、食管肿瘤、胃肿瘤、小肠肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤、胰腺肿瘤、喉肿瘤、肺肿瘤、支气管肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈肿瘤、宫体肿瘤、卵巢肿瘤、外阴肿瘤、阴道肿瘤、前列腺肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、肾盂肿瘤、输尿管肿瘤、头颈肿瘤、甲状旁腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、慢性髓样白血病。
31.权利要求16-30的任一项的方法，其中所述动物为人。
32.—种利用抗癌试剂和SPARC结合抗体治疗动物的肿瘤的方法，包括: (a)从所述动物分离生物样品； (b)检测所述生物样品中的SPARC蛋白的表达；和 (c)定量所述生物样品中SPARC蛋白的量； 其中如果SPARC蛋白高于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂和治疗有效量的抗SPARC结合抗体；或 如果SPARC蛋白低于阈值水平，则施用治疗有效量的抗癌剂并且不施用SPARC结合抗体。
33.权利要求32的方法，其中所述SPARC结合抗体包括Imml2、Imml4、hHTI或其组合。
34.权利要求32的方法，其中从体液分离所述生物样品。
35.权利要求34的方法，其中所述体液选自脑脊髓液、血液、血浆、血清和尿液。
36.权利要求32-35的任一项的方法，其中所述动物为人。
37.权利要求32的方法，其中所述肿瘤选自:口腔肿瘤、咽肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、骨肿瘤、软骨肿瘤、骨转移、肉瘤、皮肤肿瘤、黑素瘤、乳腺肿瘤、生殖系统肿瘤、尿道肿瘤、眼眶肿瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、神经胶质瘤、内分泌系统肿瘤、甲状腺肿瘤、食管肿瘤、胃肿瘤、小肠肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤、胰腺肿瘤、喉肿瘤、肺肿瘤、支气管肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、宫颈肿瘤、宫体肿瘤、卵巢肿瘤、外阴肿瘤、阴道肿瘤、前列腺肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、肾盂肿瘤、输尿管肿瘤、头颈肿瘤、甲状旁腺癌、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、慢性髓样白血病。
38.权利要求32的方法，其中所述治疗剂或抗癌试剂选自多西他赛、紫杉醇、紫杉烷、钼化合物、抗叶酸、抗代谢药、抗有丝分裂剂、DNA损伤剂、促细胞凋亡剂、分化诱导剂、抗血管生成试剂、抗生素、激素、肽、抗体及其组合。
39.权利要求32的方法，其中治疗所述动物还包括施用治疗有效量的血管生成抑制剂。
40.权利要求39的方法，其中所述血管生成抑制剂选自贝伐单抗、舒尼替尼、HKP、IFN-α、夫马洁林、血管他丁、内皮他丁、沙立度胺及其组合。
41.权利要求32的方法，其中所述化学治疗剂包含蛋白质结合的药物的颗粒。
42.权利要求40的方法，其中所述蛋白质结合的药物颗粒的蛋白质组分包括白蛋白。
43.权利要求41的方法，其中所述化学治疗剂包括白蛋白结合的紫杉醇的颗粒。
44.权利要求32-43的任一项的方法，其中利用抗体检测SPARC蛋白的表达。
45.权利要求32-43 的任一项的方法，其中不利用抗体检测SPARC蛋白的表达。
46.权利要求32-43的任一项的方法，其中利用非抗体SPARC结合分子来检测SPARC蛋白的表达。
47.权利要求32-43的任一项的方法，其中不使用SPARC结合分子检测SPARC蛋白的表达。
全文摘要
本发明提供了具有对于SPARC，特别地血浆SPARC的高亲和力的SPARC结合抗体，以及使用此类抗体治疗病况包括癌症的方法。
文档编号A61K39/00GK103221062SQ201180034977
公开日2013年7月24日 申请日期2011年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者V·特里鲁, 刘西平, B·德塞 申请人:阿布拉西斯生物科学有限责任公司