一种新型检测人布鲁氏菌病抗体的免疫层析试纸及制备方法
【专利摘要】本发明涉及人畜共患病免疫诊断领域，公开了一种布鲁氏菌病抗体检测试纸条及其制备方法。该布鲁氏菌病抗体检测试纸条，首先制备粒径为30nm的胶体金，用其标记重组大消化链球菌蛋白L(protein L)作为指示标记，溶解于金标工作液中，喷涂在玻璃纤维上制成金标垫。从布鲁氏菌基因组中克隆出VirB5基因，并将其连接在pET-28α上，构建成表达载体，并转化到大肠杆菌中，表达出VirB5蛋白，经过分离纯化后包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，将与蛋白L结合的IgG包被硝酸纤维素膜上作为质控线，制备成免疫层析检测装置。本发明布鲁氏菌病免疫层析装置具有特异性强，灵敏度高，稳定性好，简单，经济，快速等特点，对该病的监测和控制流行具有非常重要实际应用价值。
【专利说明】一种新型检测人布鲁氏菌病抗体的免疫层析试纸及制备方 法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学诊断检测【技术领域】，具体涉及一种检测对人感染布鲁氏菌后体 内产生抗体检测试纸及其制备方法。本发明还涉及到作为布鲁氏菌IV型蛋白分泌系统家 族之一的VirB5作为诊断抗原的基因工程制备过程，及其在这种蛋白在布鲁氏菌抗体检测 方面的应用。 技术背景
[0002] 布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是一种严重危害人和家畜健康的"再现 性"（reemerging)人畜共患传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》中规定管理的乙类 传染病。全球约有170个国家和地区流行此病。近年来，布鲁氏菌病的人畜疫情在世界范 围内均出现了回升势头，并呈持续增长态势，愈演愈烈。我国除澳门和台湾疫情未知外，所 有的省级单位均已报告或发现布病病例，并且一经发现，病例就会很快增加。近20年来， 我国的布病病例持续增加，1998年以后，人布鲁氏菌病疫情强势升高，发病人数逐年上升， 2013年报告新发病例，发病率3. 14/10万，较上一年同期上升18. 91 %。布病的主要流行区 集中于我国的"三北"地区，即东北、华北和西北，以内蒙古、新疆、黑龙江、吉林等地疫情尤 为严重。根据布鲁氏菌的细菌学特征和感染宿主的亲嗜性，传统上将布鲁氏菌属分为6个 种，即牛种布鲁氏困、羊种布鲁氏困、猪种布鲁氏困、犬种布鲁氏困、绵羊附辜种布鲁氏困和 沙林鼠种布鲁氏菌。
[0003] 布鲁氏菌病是一种全身性的疾病，感染后不及时的诊断和治疗多呈现疗程长，预 后差、劳动力损失大，卫生消费需求高等特点，给个人、家庭和社会造成极大的经济损失，甚 至由此造成的因病致贫，因病返贫现象非常突出，已成为威胁经济发展和社会稳定的重要 因素之一。由于布病患者临床表现无特异性，临床误诊很各易错过布病患者急性期最佳治 疗期，从而转变为很难治愈的慢性期，造成布病患者生活质量严重下降。目前，布病的诊断 主要依赖于实验室诊断，主要包括以下几种方法：①细菌培养法；②血清学诊断方法：虎红 平板凝集实验，缓冲平板凝集实验，补体结合实验，酶联免疫吸附实验，荧光偏振实验，乳汁 环状实验，布鲁氏菌素皮肤实验等。病原分离法虽精确，但耗时长，阳性检出率低，对分离环 境要求高。虎红平板凝集试验和试管凝集试验因操作简便、无需特殊设备，成为我国目前检 测人布病和家畜布病常用的方法，但是存在判定结果主观性强、易出现假阳性或漏检的等 不足。
[0004] 在我国边远地区的基层诊疗机构和畜牧兽医站缺少专业的检测仪器设备和技术 人员，因此，开发一种具有简单经济、方便快速的检测方式对该病控制治疗显得尤为重要。 胶体金免疫层析技术因简单快速、灵敏度高、特异性好、稳定性高、不需要专业的操作人员、 无需特殊的仪器设备且结果判断直接的优点而被广泛的应用于各类疾病检测中。因为简单 (试纸条的形式呈现）、快捷（一个测试仅仅需要5min)、经济并且易于使用，免疫层析检测 技术已经广泛应用于环境检测；动植物检疫；食品安全；临床诊断等方面。因此，免疫层析 技术是非常适宜于我国布鲁氏菌病高发地区的检测技术。
[0005] 近年来，应用于布鲁氏菌病的抗体检测中的诊断抗原有，最常见的就是布鲁氏菌 的LPS、外膜蛋白BP26、L7/L12蛋白等。但是在我们长期的应用实践中，我们发现布鲁氏菌 定位于细菌表面蛋白外侧VirB5蛋白是近年来对该病的研究热点；该蛋白是布鲁氏菌的IV 型蛋白分泌系统家族之一，VirB5对细菌在细胞内生存和繁殖具有重要意义。更重要的是 我们发现VirB5蛋白具有较高的免疫原性，作为该病的诊断抗原具有明显的优势：检测布 鲁氏菌抗体假阳性低、灵敏度高等特点，而且VirB5蛋白作为胶体金标记的免疫层析试纸 条的包被抗原，检测结果稳定，蛋白不易失活等优点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于满足我国边远地区对布鲁氏菌病防疫的要求，提供一种敏感、 特异性强，能够快速诊断布鲁氏菌病抗体检测试纸条。本发明首次利用布鲁氏菌IV型蛋白 分泌系统家族之一的VirB5蛋白作为诊断抗原包被在试纸条的硝酸纤维素膜上作为检测 线（T线）。同时，将重组大消化链球菌蛋白L(protein L)作为标记抗原标记在制备的胶 体金上，然后溶解在特制的缓冲液中喷涂在玻璃纤维上干燥制成金标垫。蛋白L源于细菌 Peptostreptococcus，是一种能和广泛的免疫球蛋白相结合的蛋白质，该蛋白只与抗体的k 链结合而不会影响抗体的抗原结合位点，这一特性使其与蛋白A或蛋白G相比，蛋白L不和 牛、绵羊的IgG类抗体结合，但是和人的五大类免疫球蛋白均有高亲和性。在反应膜上的质 控线包被的是与重组大消化链球菌蛋白L(protein L)结合的人IgG类抗体，将上样垫、金 标垫、包被有检测抗原的检测线和质控线的反应膜组装制成一种检测人血清中布鲁氏菌抗 体的检测试纸条。
[0007] 本发明的提供了以上的试纸条的制备方法的同时，为了实现人血清中布鲁氏菌抗 体的快速床边诊断的目的，本发明首先利用基因工程技术，克隆并高效表达布鲁氏菌布鲁 氏菌的IV型蛋白分泌系统家族之一的VirB5,并通过免疫学技术对其免疫原性及特异性进 行鉴定。实验表明，通过基因工程蛋白抗原的制备具有良好的特异性和灵敏度。进而，本发 明提供一种布鲁氏菌病抗体检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述的反应膜上包 被有VirB5蛋白作为检测线，将与重组大消化链球菌蛋白L(protein L)结合的IgG类抗体 作为指控线。其具体的操作步骤如下：
[0008] 通过基因工程手段制备布鲁氏菌VirB5蛋白。从布鲁氏菌基因组中扩增VirB5基 因，分别克隆到PMD-18T载体，将重组质粒双酶切，再亚克隆入表达载体pET-32a，构建重组 质粒pET-32a-VirB5,转化于大肠杆菌BL21(DE3)菌中，IPTG诱导表达，用亲和层析对重组 蛋白进行纯化，并用Western-blot检测其抗原性。
[0009] 将步骤（1)制备的布鲁氏菌VirB5蛋白作为检测线，将与重组大消化链球菌蛋白 LQrotein L)结合的IgG类抗体作为指控线包被在反应膜上。
[0010] 用柠檬酸三钠还原氯金酸制备30nm胶体金：用去离子水溶解1 %的氯金酸使其终 浓度为〇. 01 %，待溶液沸腾后快速加入〇. 浓度为1. 05 %的柠檬酸三钠水溶液，氯 金酸水溶液在约4min左右变为稳定的紫红色然后继续沸腾搅拌lOmin，反应停止后室温下 冷却，用去离子水恢复至溶液原体积，用0. 45 y m的滤器过滤。将烧制好的胶体金溶液应在 电镜下和紫外/可见光谱仪进行对粒径、分散性、形貌的表征。
[0011] 标记重组大消化链球菌蛋白L (protein L)及其钝化：在上述制备的30nm胶体金 溶液中调节pH值为6-10,室温下快速搅拌5min，快速一次性加入300ul重组大消化链球菌 蛋白L(lmg/mL)，搅拌5-60min，静止5-60min之后，磁力搅拌下加入1 % -10% BSA(含有 5%的小牛血清）和1% -30%聚乙二醇（分子量20000)各l-5mL，搅拌30min。将制备的 免疫金4°C、3000rpm低速离心IOmin,弃去凝聚的胶体颗粒形成的沉淀。然后在12000rpm 离心30min，轻轻弃上清，沉淀用胶体金复液，重悬成免疫胶体金，置于4°C备用。
[0012] 上样垫的制备及其金标释放垫的制备：将玻璃纤维膜裁剪成I. 7cmX 30cm，用上 样垫处理液浸泡20min，37°C烘干备用。将质地较密的玻璃纤维膜裁剪成0. 8cmX 30cm，将 上述免疫胶体金与胶体金缓冲液按1 : 9混合，用喷金划线仪按lul/cm的速度喷涂在裁剪 好的玻璃纤维膜上制备结合物释放垫，37°C晾干备用。将上述制备好的反应膜、结合物释放 垫、上样垫和吸水垫组装在支撑板上（如图1)，裁剪成一定规格的试纸条。
[0013] 本发明人畜布鲁氏菌抗体快速检测试纸条（胶体金法）具有以下优点：
[0014] 体现了快、边、便、易四个特点：快速，5-10分钟就能准确检测出结果；床边诊断； 方便简单适用于家庭自检；结果易于读取。
[0015] 特异性强：该检测试纸条仅对布鲁氏菌各种人或动物血清中标本呈阳性反应，而 对其他病原体感染的血清标本呈现阴性结果。
[0016] 对血清样本中抗体具有敏感性强和灵敏度高,保质期长等优点。
[0017] 本发明的试纸条利用胶体金标记的免疫层析技术，在基层医疗机构和畜牧兽医站 等缺乏大型检测设备和专业技术人员等恶劣条件下实现对该病的定性和半定量测定，可快 速筛查受感染患者和动物，对布鲁氏菌的控制流行起到非常重要的作用。同时，该检测方法 具有方便、快速、简捷，不需要特殊的仪器设备和不需要对检测人员专业培训，结果清晰易 于判读，操作简单方便推广，适合于现场检测和流行病学的调查。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是1. 2%琼脂糖检测VirB5基因及重组阳性质粒酶切鉴定
[0019] 图2是VirB5-32a双酶切鉴定的琼脂凝胶电泳检测（1-4泳道为VirB5-2酶切产 物；5泳道为质粒对照；6泳道标准分子10000)
[0020] 图 3 是 VirB5 蛋白 SDS-PAGE 分析（Lane M :蛋白 Marker ;Lane 1 :未经 IPTG 诱 导的DE3空菌Lane 2 :经IPTG诱导的DE3空菌；Lane 3 :未经IPTG诱导的pET28a空质粒 Lane 4 :经 IPTG诱导的 pET28a空质粒；Lane 5 :未经 IPTG诱导的pET28a-VriB5 质粒；Lane 6-10:经1?了6诱导211，311，411，511，611在大肠杆菌中表达的￥1池5蛋白1^116 11、12:纯化后 的VirB5蛋白）
[0021] 图 4 是纯化的 VirB5 蛋白及 western bloting 分析（Lane M :蛋白 Marker ;Lane I :纯化的 VirB5 蛋白；Lane 2 :western bloting 结果）
[0022] 图5是胶体金紫外-可见光谱图（UV-Vis)
[0023] 图6是布鲁氏菌病抗体检测试纸条组装结构图
[0024] 图7是试纸条的结果判定（1布鲁氏菌病阴性血清；2、3人布鲁氏菌病阳性血清）
【具体实施方式】：
[0025] 实施例1 :布鲁氏菌外膜蛋白BP26的原核表达及纯化
[0026] I. 1引物的设计与合成
[0027] 参照GenBank是上已经公布的羊种布鲁氏菌参考株16M的VirB5基因序列（登录 号：BMEII0029)，根据pGM-T克隆载体及pET-28a原核表达载体的特点，设计两端含有限制 性内切酶Xho I/EcoR I酶切位点的引物。引物序列见表1-1。
[0028] 表1-1弓丨物序列
[0029] Table 1-1 Primer sequences
[0030]
【权利要求】
1. 一种新型检测人布鲁氏菌病抗体试纸条，其包括：被检测抗体与特异性检测抗原的 反应膜和胶体金标记结合物释放垫、样品垫和吸水垫，其中所述的反应膜上包被有布鲁氏 菌特异性检测抗原作为检测线，以及可与标记抗原重组大消化链球菌蛋白L(pr〇tein L)发 生结合的抗体作为质控线。
2. 由权利要求1所述的检测人布鲁氏菌抗体试纸条其特征在于，其中所述的特异性检 测抗原为布鲁氏菌VirB5蛋白，这种VirB5蛋白是通过基因工程方法重组表达获得。
3. 由权利要求1所述的试纸条其特征在于，标记材料为10nm-70nm的胶体金，制备方法 采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方式获得。
4. 由权利要求1所述的试纸条其特征在于，其中所述的胶体金标记结合物释放垫为：制备的胶体金标记重组大消化链球菌蛋白Uprotein L)，溶解在免疫金工作液中，喷涂在 玻璃纤维膜、聚酯纤维膜等材质干燥后制备得到。
5. 如权利要求1所述的布鲁氏菌抗体检测试纸条，特征在于：所述反应膜为硝酸纤维 素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜、聚酯膜，或硝酸纤维素与醋酸纤维素的混合膜之一；所述结合 物释放垫的材质为玻璃纤维或聚酯纤维，上样垫的材质为玻璃纤维或聚酯纤维裁剪成型； 然后用上垫处理液浸泡，然后15°C到60°C烘干或冷冻干燥。
6. 根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述的反应膜的检测线为布鲁氏菌的 VirB5蛋白，该定位于细菌表面蛋白外侧且具有较高的免疫原性，能够准确指示出体液中的 布鲁氏菌抗体的存在；反应膜上的质控线为能与重组大消化链球菌蛋白Uprotein L)结 合的IgG类抗体。
7. 将制备好的反应膜以及结合物释放垫、上样垫、吸水垫和反应膜组装在支撑板上然 后裁剪成不同规格的试纸条，检测试纸条结合一定模具可制备成布鲁氏菌抗体检测卡和检 测试纸笔。
【文档编号】G01N33/569GK104360058SQ201410405061
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】石峰, 王远志, 陈创夫, 程婷婷, 钱红, 李志强 申请人:石河子大学