一种s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法及其应用的制作方法
【专利摘要】一种S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法，括如下步骤：将二氧化碳测定试剂R1混合试剂、R2混合试剂在1.5mL的EP试管进行混合，再添加腺苷甲硫氨酸，最后添加S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC)，得到总体积为1000ul的混合液，启动反应；将上述混合液在37℃的水浴中孵育反应1-30min后，再将该混合液转至200uL/孔的透明96孔板，利用酶标仪等仪器检测体系在340nm波长处的光吸收，对该混合物的反应活性进行检测。该方法操作简单，效果良好，只需要简单的光吸收检测，即可实现。该方法适用于快速进行AdoMetDC活性的检测和抑制剂的筛选与设计。
【专利说明】一种S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（s-adenosylmethionine decarboxylase ;AdoMetDC)，具体涉及人源S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶活性检测方法和及在药 物筛选上的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质是生物体的主要组成成分之一，是完成各种生命活动的主要物质。在各种 蛋白质中，蛋白酶对生命活动至关重要，几乎所有生物体内的生化反应过程都由蛋白酶进 行催化。生物体内各种蛋白酶的活性具有严格的调控机制，一旦其调控机制出现问题，造成 蛋白酶的活性过高、过低或者是完全失活，都会造成相应的各类疾病。因此，通过药物来调 控蛋白酶的活性，使其恢复和保持在正常水平，具有非常重要的理论意义和现实意义。以结 构为基础的药物设计，是设计以蛋白质为靶标的药物的一个非常重要的手段。
[0003] 多胺（polyamines)是一类从氨基酸代谢产生的带正电的阳离子小分子，在所 有生物体中都存在，对细胞生长、分化、存活及正常生物学功能等都不可缺少。多胺带多 正电荷的特性，使它们能通过与带负电荷的生物大分子（DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等）形 成静电作用，从而调控非常广泛的生物学过程，包括染色体结构形成、DNA合成与稳定、 DNA复制、转录和翻译、蛋白质磷酸化、核糖体生成、离子通道和膜表面受体的调控、自由 基清除等。天然的多胺有很多种。在哺乳动物中，天然存在的有三种，即putrescine(腐 胺），spermidine(精脒），spermine.(精胺），它们对哺乳动物正常生长和发育必不可少。 由于多胺具有重要的生物学功能，其细胞内水平受到严格的调控。在快速繁殖的细胞（如 肿瘤细胞）中，多胺水平也会上升和失调。多胺水平升高，伴随着细胞增殖加快、凋亡减少、 以及肿瘤浸润和转移相关基因的表达水平升高等。因此，多胺的调控，成为肿瘤治疗和药物 研发中的一个重要手段。
[0004] AdoMetDC是多胺体内合成的一个关键酶，对于精胺和精脒的合成至关重要，因为 精胺和精脒的氨丙基来源于AdoMetDC的脱羧反应。因此，合成AdoMetDC抑制剂，抑制精胺 和精脒的生成，是目前很受关注的一个肿瘤治疗途径。同时，由于病原微生物也需要维持正 常的多胺水平，因此AdoMetDC抑制剂也成为针对病原微生物的一个重要药物靶标。
[0005] 当前，AdoMetDC的抑制剂MGBG (米托胍腙）已经被用于临床中的抗白血病治疗和 癌症的化疗辅助药物。但MGBG会导致严重的线粒体损伤，因此毒副作用非常大。AdoMetDC 的抑制剂CGP 48664(SAM486A)已经进入I期和II期临床评估。因此，筛选和设计新的 AdoMetDC抑制剂具有重要意义和价值。
[0006] 在筛选和设计AdoMetDC抑制剂的过程中，一个很重要的评价指标是检测药物对 AdoMetDC的酶活性抑制能力。目前，检测AdoMetDC的活性和抑制剂效果，比较有效的是采 用C14同位素标记的腺苷甲硫氨酸（[ 14C00H]Ad〇Met)进行实验，通过检测14CO2的产生进行 评价。该方法虽然很灵敏和准确，但是由于涉及到同位素操作，需要特殊的设备和操作，药 品价格也比较昂贵，因此普通实验室难以使用，且无法用于高通量的AdoMetDC药物筛选。 因此，开发出价格低廉、操作简便、普适度高的AdoMetDC活性检测体系，具有重要价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是确定建立一个简便的、非放射性同位素标记的AdoMetDC活性检 测的方法，用于AdoMetDC的活性检测和抑制剂评价、筛选和设计。
[0008] 本发明的技术方案是，基于脱羧酶产生CO2的原理，利用二氧化碳测定的PEPC酶 法，通过调节有关组成成分，确定了一个能够进行AdoMetDC活性检测和抑制剂效果评价的 测活方法。该方法的Rl和R2试剂的主要组成如下：
[0009]
【权利要求】
1. 一种S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将二氧化碳测定试剂Rl混合试剂、R2混合试剂在I. 5mL的EP试管进行混合，再添 加腺苷甲硫氨酸，最后添加S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC)，得到总体积为IOOOuI的混 合液，启动反应； 2) 将上述混合液在37°C的水浴中孵育反应l_30min后，再将该混合液转至200uL/孔 的透明96孔板，利用酶标仪等仪器检测体系在340nm波长处的光吸收，对该混合物的反应 活性进行检测； 3) 在步骤1)、2)的基础上同时检测不加S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC)或不加腺 苷甲硫氨酸的混合液的反应活性。
2. 根据权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法，其特征在于：所述 的Rl的混合试剂为5. 5-10. 5mmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸及4. 6-10. 8mmol/L的氯化镁的 混合溶液；R2的混合试剂为360-450U/L的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，520-680U/L的苹果酸 脱氢酶，0. 35-0. 55mmol/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的混合溶液，所述的腺苷甲硫氨酸的浓 度为0. 01-500mM ;所述的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC)的浓度为0. 1-lOOuM。
3. 根据权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法，其特征在于：所述 的Rl的混合试剂为7. Ommol/L的磷酸烯醇式丙酮酸及8. Ommol/L的氯化镁的混合溶液；R2 的混合试剂为400U/L的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，600U/L的苹果酸脱氢酶，0. 45mmol/L的 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的混合溶液；腺苷甲硫氨酸的浓度为ImM ;S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 (AdoMetDC)的浓度为 luM。
4. 根据权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法，其特征在于：R1混 合试剂、R2混合试剂、腺苷甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC)的体积比为1 : 2. 8-3. 5 ：0. OOl-O. 003 ：0. 5-0. 8〇
5. 根据权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法，其特征在于：步骤 1)中所述的反应是在空气条件下或者在N2保护条件下进行。 6. S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活性检测方法在筛选抑制S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的抑制 剂上的应用。
【文档编号】G01N33/573GK104316682SQ201410530672
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】刘森, 廖陈曾, 王艳林, 占景琼 申请人:三峡大学