一种光子晶体微球流式芯片及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种用于检测致病菌的探针，所述探针是根据致病菌的基因设计的探针，并在5'端标记氨基和poly(T)15。本发明还公开了一种光子晶体微球流式芯片及其制备方法和应用。本发明通过随机引物对样本核酸进行扩增，提高灵敏度；利用编码小球增加检测通量；有利于未知复杂样本的检测；采用一条通用引物代替多重PCR的多条特异性引物扩增致病菌的基因组DNA，能够扩增出样品中的大量未知病原菌，有助于借助芯片进行高通量分析；替代玻璃芯片，避免空间因素的限制，使其产生较强的杂交信号；采用甲酰胺杂交缓冲液、较高的杂交温度、较短的杂交时间和PBS多次洗涤来提高杂交特异性；避免多重PCR扩增条件的摸索。
【专利说明】一种光子晶体微球流式芯片及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种光子晶体微球流式芯片检测致病菌的方法。
【背景技术】
[0002]病原微生物的准确检测和鉴定在临床医学、食品安全、环境监督中的作用日益凸显，传统的食源性疾病的检测方法都要经过分离培养、生化鉴定等步骤，存在操作较为耗时繁琐、检测灵敏度低和容易出现假阴性等缺点，在应对突发性食品安全公共事件上，不能满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求。
[0003]随着分子生物学的发展，以PCR为基础的核酸扩增技术越来越成为生物检测和鉴定的最有效方法，特别是基于PCR的基因芯片技术，可以对样品中病原微生物做到一次性鉴定种属、毒力因子和基因多态性分析，这对致病菌检测提供了方便快速的方法。
[0004]虽然基因芯片技术在微生物检测方面有很多独特的优势，但还有不少问题和缺陷亟待解决。目前主要有以下几个问题制约了基因芯片技术的应用和发展:1)基因序列信息的缺乏远不能满足实际检测与诊断的需要；2)基因芯片相关技术专利的限制，减慢了基因芯片技术的普及；3)基因芯片技术是一项多学科交叉的技术，仍有很多技术问题需要改进和提高；4)目前基因芯片的制备和检测费用都很高，只能在大型实验室研究，极大地限制了其开发进展；5)无论是PCR还是基因芯片技术，均需要对目的DNA扩增，不可避免的要求在扩增目的基因前设置合适的引物，特别是多重PCR，对引物设计要求更为严格，扩增条件更为苛刻。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种用于扩增致病菌基因组DNA的通用引物。
[0006]本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种高灵敏度、成本低、检测时间快、特异性好的光子晶体微球流式芯片。
[0007]本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种光子晶体微球流式芯片的制备方法。
[0008]本发明最后所要解决的技术问题是提供光子晶体微球流式芯片检测致病菌的方法。
[0009]本发明的原理为:光子晶体微球(编码小球)表面用双氧水:浓硫酸溶液进行羟基化修饰，用Y-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)环氧基修饰，然后与5端经氨基修饰的特异性探针偶联，牛血清蛋白(BSA)封闭。偶联的探针与5端经FAM荧光素标记的通用引物扩增所得的扩增产物特异性结合。用荧光显微镜拾取微球的荧光信号，用微球的反射光谱的有无和强弱来判断检测样本中是否存在某种致病菌以及含量的多少。
[0010]技术方案:为解决上述技术问题，本发明公开了一种用于检测致病菌的探针，所述探针是根据致病菌的基因设计的探针，并在5’端标记氨基和poly (T) 15。
[0011]一种光子晶体微球流式芯片，它包含上述的探针。
[0012]一种光子晶体微球流式芯片的制备方法，包括以下步骤:
O光子晶体微球的制备；
2)光子晶体微球表面的修饰；
3)探针偶联:将上述的探针偶联于经步骤2)表面修饰的光子晶体微球表面得到光子晶体微球流式芯片。
[0013]其中，上述步骤I)具体步骤为:首先将甲基硅油倒入培养皿中，175°C加热lOmin，然后冷却至室温备用。内装二氧化硅单分散乳液的I号注射器和内装甲基硅油的2号注射器中的液体通过三通管连接，利用两蠕动泵分别将甲基硅油和二氧化硅单分散乳液混合包裹进入已经处理好的盛有甲基硅油培养皿，在界面力的作用下二氧化硅单分散乳液会形成球状结构；以不同纳米二氧化硅颗粒自组装技术制备上述的粒径相同的光子晶体微球，各微球具有不同的光反射光谱；将制备好的微球放入70°C烘箱中加热9h，其中的水分完全蒸发的同时也会使纳米微球进一步组装。微球成型后，使用正己烷多次清洗小球，每次冲洗前先浸泡lOmin，接着用无水乙醇冲洗3次，然后再放入马弗炉中进行煅烧，升温(2°C /min)至 300°C后恒温 3h,降温(1.5°C /min)。
[0014]其中，上述步骤2)包括以下步骤:将步骤I)得到的光子晶体微球置于体积比1:5飞:I双氧水与浓硫酸中对微球表面进行羟基化修饰，再用0.01%-20% Y -缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)的甲苯溶液对微球表面进行环氧基修饰；具体步骤如下:将光子晶体微球置于食人鱼洗液中(浓硫酸:双氧水=2:1体积比)6h，利用去离子水清洗微球3次，并用氮气吹干；然后置于5 % GPTMS甲苯溶液，常温过夜；利用甲苯清洗3次，乙醇清洗3次，灭菌水清洗3次，去除残留硅烷，氮气吹干。
[0015]其中，上述步骤3)探针偶联与封闭具体步骤如下:将洗净后的光子晶体微球与5μ Κ?ΟΟμΜ)的探针4°C偶联过夜，10 X PBS清洗3次，去离子水清洗2次，氮气吹干。
[0016]将微球置于5% BSA的PBS buffer (PBS,0.05 M,pH 7.4)溶液中，室温血液混匀器振荡30min，PBS清洗3次，去离子水清洗2次，晾干，准备5份微球，用于金黄色葡萄球菌DNA的杂交。
[0017]上述的一种光子晶体微球流式芯片在检测致病菌方面的应用。
[0018]一种检测致病菌的方法，将上述的光子晶体微球流式芯片对待测样品进行检测，然后用荧光显微镜对实验结果进行检测并观察。
[0019]其中，上述对待测样品进行检测步骤为:准备多个光子晶体微球流式芯片，与致病菌基因组DNA扩增杂交，杂交后进行洗涤和镜检。
[0020]其中，上述杂交步骤具体如下:将致病菌基因组DNA PCR扩增产物置于95°C下热变性5min，90°C下热变性lmin，取变性后的扩增产物4.0ul与16.0 μ I 4Χ SSC于PCR反应管中，将PCR反应管置于包被有锡箔纸的离心管中置于血液混匀器上45°C混匀杂交lh。
[0021]洗涤与镜检:
取20 μ I 10XPBS缓冲液加入上述PCR管中，缓慢摇匀洗涤2min，每管重复洗涤3次，将杂交后的光子晶体微球置于薄片上，荧光显微镜拍照检测。
[0022]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下: 1)通过随机引物对样本核酸进行扩增，提高灵敏度；同时利用编码小球增加检测通量；有利于未知复杂样本的检测；
2)采用一条通用引物代替多重PCR的多条特异性引物扩增病原微生物的基因组DNA，能够扩增出样品中的大量未知病原菌，有助于借助芯片进行高通量分析；
3)替代玻璃芯片，避免了空间因素的限制，使其产生了较强的杂交信号；
4)采用甲酰胺杂交缓冲液、较高的杂交温度、较短的杂交时间和PBS多次洗涤来提高杂交特异性；
5)无需设计多对特定引物，节约了实验成本，避免了多重PCR扩增条件的摸索。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图l、phi29 DNA聚合酶恒温扩增金黄色葡萄球菌基因组DNA ; 4和M分别表示金黄色葡萄球菌、marker DL2000 ；
图2金黄色葡萄球菌DNA基于phi29 DNA聚合酶恒温扩增杂交结果。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:扩增反应 UDNA的提取
取ImL生理盐水稀释的LB培养基上生长48h的金黄色葡萄球菌菌落于1.5mLEP管中，12000r/min 离心 1min,弃上清，向沉淀中加入 100 μ I I XTE buffer, 10CTC煮沸 1min 后冰浴5min, 12000r/min离心5min后取上清进行扩增。
[0025]2、试剂
金黄色葡萄球菌来源于ATCC，DNA聚合酶购自深圳华因康基因科技有限公司。其它试剂为国产分析纯。
[0026]3、引物和探针的合成
phi29DNA聚合酶和随机扩增所采用的引物均为随机十聚体，并在引物5’端标记FAM荧光素，引物序列为:5’ -FAM-N*NNNNNNNNN-3’ (其中N为随机核苷酸)；根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因设计探针，并在5’端标记氨基和poly (T) 15，探针序列为:
5’ -NH2-TTTTTTTTTTTTTTTCGTTGTCTTCGCTCCAAAT-3’
弓I物探针由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0027]4、引物的扩增反应
phi29DNA聚合酶扩增PCR反应管中加入如下组分，各基因组DNA 2.0 μ 1，10XPhi29反应缓冲液2.5 μ 1，100 μ M随机引物2.0μ1，去离子双蒸水16.75μ1。95°C变性5min，冰浴冷却 5min 后加入 dNTP (1mM each ), 100XBSA 0.25 μ l，phi29DNA 聚合酶 0.5 μ I。35°C反应15h后65°C终止15min，用2%琼脂糖凝胶电泳测扩增效果。(参见图1)
由图1可知:基于phi29 DNA聚合酶恒温扩增方法能成功扩增出金黄色葡萄球菌的基因组DNA，phi29 DNA聚合酶恒温扩增产生单一高分子量DNA，分子量大于2000bp，绝大多数DNA滞留于胶孔内。
[0028]实验所使用的DNA Marker为Takara公司的DL2, 000 DNA Marker,图1中第一孔道为 DNA Marker，从上往下依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp。
[0029]实施例2:
1.光子晶体微球的处理与杂交
亲水处理:将光子晶体微球置于食人鱼洗液中(浓硫酸:双氧水=2:1体积比)6h，利用去离子水清洗微球3次，并用氮气吹干；然后置于5% GPTMS甲苯溶液，常温过夜；利用甲苯清洗3次，乙醇清洗3次，灭菌水清洗3次，去除残留硅烷，氮气吹干。
[0030]探针的偶联:将洗净后的光子晶体微球与5μ1(100μΜ)的探针4°C偶联过夜，10XPBS清洗3次，去离子水清洗2次，氮气吹干。
[0031]封闭:将微球置于5% BSA的PBS buffer (PBS, 0.05 M, pH 7.4)溶液中，室温血液混匀器振荡30min，PBS清洗3次，去离子水清洗2次，晾干，制备5份微球，用于金黄色葡萄球菌DNA扩增产物的杂交。
[0032]杂交:将金黄色葡萄球菌DNA扩增产物置于95°C下热变性5min，90°C下热变性lmin，取各变性后的扩增产物4.0μ I与16.0 μ I 4 X SSC于上述PCR管中，将PCR反应管置于包被有锡箔纸的离心管中置于血液混匀器上45°C混匀杂交lh。
[0033]洗涤与镜检:取20 μ I 10XPBS缓冲液加入上述PCR管中，缓慢摇匀洗涤2min，每管重复洗涤3次，将杂交后的光子晶体微球置于薄片上，荧光显微镜拍照检测。参见图2，
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种用于检测致病菌的探针，所述探针是根据致病菌的基因设计的探针，并在5’端标记氨基和poly(T) 15。
2.一种光子晶体微球流式芯片，其特征在于，它包含权利要求1所述的探针。
3.权利要求2所述的一种光子晶体微球流式芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: O光子晶体微球的制备； 2 )光子晶体微球表面的修饰； 3)探针偶联:将权利要求2所述的探针偶联于经步骤2)表面修饰的光子晶体微球表面得到光子晶体微球流式芯片。
4.根据权利要求3所述的一种光子晶体微球流式芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤2)包括以下步骤:将步骤I)得到的光子晶体微球置于体积比1:5飞:I双氧水与浓硫酸中对微球表面进行羟基化修饰，再用0.01%-20%y-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液对微球表面进行环氧基修饰。
5.权利要求2所述的一种光子晶体微球流式芯片在检测致病菌方面的应用。
6.一种检测致病菌的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的光子晶体微球流式芯片对待测样品进行检测，然后用荧光显微镜对实验结果进行检测并观察。
7.根据权利要求6所述的一种检测致病菌的方法，其特征在于，所述对待测样品进行检测步骤为:准备多个光子晶体微球流式芯片，与致病菌基因组DNA扩增杂交，杂交后进行洗涤和镜检。
8.根据权利要求7所述的一种检测致病菌的方法，其特征在于，所述杂交步骤具体如下:将致病菌基因组DNA PCR扩增产物置于95°C下热变性5min，9(TC下热变性lmin，取变性后的扩增产物4.0ul与16.0 μ I 4X SSC于PCR反应管中，将PCR反应管置于包被有锡箔纸的离心管中置于血液混匀器上45°C混匀杂交lh。
【文档编号】G01N21/64GK104390949SQ201410724752
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】张春东, 韩东成, 周其洋, 黄宝福, 淳林 申请人:南京普朗医疗设备有限公司