一种黄曲霉毒素b1免疫亲和柱的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，属于免疫亲和层析及真菌毒素残留检测【技术领域】。黄曲霉毒素B1免疫亲和柱包括柱管1、上筛板2、下筛板3、黄曲霉毒素B1免疫亲和凝胶填料4，上筛板2和下筛板3设于柱管内部，黄曲霉毒素B1免疫亲和凝胶填料4填充于上筛板2和下筛板3间，柱管1底部设有收窄部分，黄曲霉毒素B1免疫亲和柱还设有下堵头6。本实用新型采用重组蛋白A琼脂糖凝胶作为固相载体，载体上的重组蛋白A与AFB1抗体IgG的Fc段定向结合，再通过双功能结合剂二甲基庚二亚胺二盐酸盐(DMP)将其交联，形成亲和介质。因此，亲和柱的负载量更大，产品更加稳定，成本相对较低。
【专利说明】一种黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，属于免疫亲和层析及真菌毒素残留检 测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一组结构类似的代谢物，其毒性属 于剧毒，具有致畸、致癌、致诱变作用，而黄曲霉毒素 B1 (AFB1)的毒性和致癌性最强，被称为 第一大类致癌物，能诱发人和动物的肝癌。
[0003] 目前，对于黄曲霉毒素的检测方法有薄层层析法、酶联免疫吸附法、免疫亲和 柱-高效液相色谱法、免疫亲和柱-荧光光度法等。其中薄层层析法耗时长、灵敏度低，实 验操作需接触大量标准品，既不利于操作者健康又不环保。酶联免疫吸附法适合大量样本 的快速筛选，定量确定还需依靠高效液相色谱等仪器分析方法，而这往往需要复杂的样品 净化过程。
[0004] 国家标准GB/T18979-2003采用的方法是免疫亲和柱层析柱-高效液相色谱法和 荧光光度法，该法特异性高，快速、灵敏、准确。因此，制备性能稳定、结果可靠的黄曲霉毒素 免疫亲和柱乃是当务之急。目前，免疫亲和柱载体的制备方法有溴化氰法、过碘酸钠法等。 当采用溴化氰活化的琼脂糖作为载体时，其中凝胶载体与抗体的偶联为随机偶联，若建合 位置靠近抗体的结合位点指向有碍与待测物结合的空间时，则抗体的结合能力下降，为制 备高载量的亲和介质，则所需抗体的纯度高且用量大，或制备较大的柱床体积，增加非特异 性吸附的风险，成本居高不下，产品不稳定。若利用过碘酸钠法直接活化琼脂糖获得开环醛 基，直接与抗体偶联，存在问题与上述溴化氰活化后偶联相似。陈光宇等专利报道过碘酸钠 法使用NaKVlf IgG Fc片段特有的单糖氧化，开环成醛，带有醛基的Fc段直接与CNBr/己 二酰二肼活化的基质偶联，生成稳定的腙衍生物（无需还原）。但是当糖含量较少，游离氨 基较多，氧化时易发生本身聚合，此法常见于酶标记抗体中使用。此外，过碘酸钠氧化抗体 法步骤繁琐，活化时间较长、氧化过程复杂。
[0005] 制成的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱还存在诸多不便，装料不平，不方便使用等问题 实用新型内容
[0006] 本实用新型的目的在于克服现有技术中存在的一个或多个问题，提供一种黄曲霉 毒素 B1 (AFB1)免疫亲和柱。本实用新型特别适用于性能稳定、结果可靠的黄曲霉毒素免疫 亲和柱中。
[0007] 根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，黄曲霉毒素 B1免疫亲 和柱包括柱管、上筛板、下筛板、黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料，黄曲霉毒素 B 疫亲和 柱顶部还设有有凸缘，上筛板和下筛板设于柱管内部，黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料填 充于上筛板和下筛板间，柱管底部设有收窄部分，所述黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱还设有下 堵头。本实用新型可以采用重组蛋白A琼脂糖凝胶（r proteinA-Sepharose CL-4B)作为 固相载体；与经过辛酸-饱和硫酸按纯化的八?81单克隆抗体定向偶联的免疫亲和柱中。生 产工艺简单，过程温和易控制，亲和介质稳定。上筛板和下筛板压平黄曲霉毒素 B1免疫亲 和凝胶填料结果稳定。
[0008] 根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，黄曲霉毒素 B1免疫亲 和凝胶填料其固相载体为重组蛋白A琼脂糖凝胶，重组蛋白A琼脂糖凝胶定向偶联黄曲霉 毒素 B1单克隆抗体。
[0009] 根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，柱管直径为7. 5mm，柱 管内径为5. 0mm，柱管长为66. 0mm，黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料填充量为250ul，上筛 板和下筛板存在于柱体管内部，黄曲霉毒素&免疫亲和柱顶部还设有凸缘可以方便定位黄 曲霉毒素 B1免疫亲和柱。此规格使样品过柱时可达到所需流速且稳定，黄曲霉毒素 B i免疫 亲和凝胶填料填充量为250ul效率高。
[0010] 根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，柱管底部收窄部分的 管长为10mm，体管底部收窄部分上部为倒锥型下部为直径4mm直管。方便下接导管
[0011] 根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，柱管顶部还设有有凸 缘的上盖，上盖内部为管状，上盖内部管状下端封闭，柱管底部还设有下堵头。上盖内部为 管状下部封闭方便保存时管内装料不泄漏，使用时剪通管道可做连接导管的套头。
[0012] 根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，柱体管为透明PE塑 料，有凸缘的上盖为柔性塑料。方便观察，方便使用。
[0013] 根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，柱管内壁设有环槽， 上筛板设于环槽内。上筛板设于环槽内防止出现上筛板浮起，没有压平黄曲霉毒素 B1免疫 亲和凝胶填料，使填料上表面不平出现松散出现缝隙影响结合效率与可靠性的情况。
[0014] 根据本实用新型的一方面提供的黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，柱管内壁设有限位 环，所述上筛板设于所述限位环下。上筛板设于环槽内防止出现上筛板浮起，没有压平黄曲 霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料，使填料上表面不平出现松散出现缝隙影响结合效率与可靠性 的情况。
[0015] 本实用新型黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱中黄曲霉毒素 B i免疫亲和凝胶填料可以使 用市售黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶材料。
[0016] 为了更好的发挥本实用新型效果，黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料可以使用如下 方法制备：
[0017] (1)固相载体的准备：将保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓冲液洗涤 后，用PBS缓冲液悬浮；
[0018] (2)抗体与固相载体的偶联：
[0019] a、将AFB1单克隆抗体与步骤（1)中得到的固相载体重组蛋白A琼脂糖凝胶室温 下在垂直混匀器上混合l-3h ;
[0020] b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3?4倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，以除去未 结合的抗体及其他杂蛋白；
[0021] c、然后在步骤b所得反应物中加入0. 2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和二甲基庚 二亚胺二盐酸盐DMP固体粉末，室温下，在垂直混匀器上混匀l-3h ;
[0022] d、反应结束后，用10?30mL的0. 2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次，并用 20?40mL、50mmol/L的三乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混勾器上混勾4? 6min，以终止联接反应；
[0023] e、用20?40mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入5?IOmL 50mmol/L，pH3. 0的甘 氨酸-HCL溶液，室温下，在垂直混匀器上混匀4?6min，以除去未结合的抗体；
[0024] f、反应结束后，用10?30mL的质量浓度为20%乙醇-水洗涤两次，最后用等体积 的20%乙醇-水重新悬浮，得到混悬液，沉降得黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料；
[0025] 此方法制备的黄曲霉毒素&免疫亲和凝胶填料中重组蛋白A经改造含有一 C末 端半胱氨酸，单一位点偶联于琼脂糖；八?81单克隆抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到 重组蛋白A琼脂糖凝胶，AFB 1单克隆抗体抗原结合部位充分暴露。净化效率和方法的灵敏 度提高。
[0026] 按照本实用新型提供的技术方案，本实用新型采用重组蛋白A琼脂糖凝胶（r proteinA-Sepharose CL-4B)作为固相载体；与经过辛酸-饱和硫酸按纯化的AFB1单克隆 抗体定向偶联，使用这种纯化方案，该方法经济，更重要的是能保证IgG与proteinA高效 结合，杂蛋白不被结合，洗涤后，通过双功能结合剂二甲基庚二亚胺二盐酸盐（DMP)将其交 联，取制备的混悬液进行装柱，过夜沉降使柱体积为〇. 25mL，安装上筛板，20%乙醇-水密 封，4°C保存，得到AFB1免疫亲和柱。制备的免疫亲和层析柱，可提高样品的净化效率和方 法的灵敏度，尤其适合复杂样品的前处理。
[0027] 该方法制备的黄曲霉毒素&免疫亲和凝胶填料有如下有点：
[0028] (1)载体上重组蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可单一位点偶联于琼脂 糖上，降低了空间位阻，增加了与IgG的结合能力；
[0029] (2)将抗体的非结合活性区域Fc端定向偶联到重组proteinA琼脂糖凝胶上，更好 地保持了抗体的活性，使抗体上的抗原结合部位充分暴露，提高了抗体的有效利用率，较小 的柱床体积下完成净化过程，减小了非特异性吸附。
[0030] (3)生产工艺简单，偶联过程对单抗的纯度要求不高，过程温和易控制，亲和介质 稳定。
[0031] 本实用新型与现有技术相比，本实用新型具有以下显著优点：
[0032] 体积小，黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料压填平整，不松弛不出现不平有缝隙的 情况影响精度，安装使用方便，利于操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为本实用新型一实施方式结构示意图；
[0034] 图2为本实用新型一实施方式局部结构示意图；
[0035] 图3为本实用新型一实施方式局部结构示意图；
[0036] 图4为本实用新型AFB1IOppb标准品HPLC图谱；
[0037] 图5为本实用新型AFB1柱容量HPLC图谱；
[0038] 图6为本实用新型柱容量随时间变化（2_8°C )图。
[0039] 图7为本实用新型应用原理示意图。
【具体实施方式】
[0040] 实施例I
[0041] 结合图1至图3说明，一种黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱，黄曲霉毒素 B i免疫亲和柱 包括柱管1、上筛板2、下筛板3、黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料4,上筛板2和下筛板3 设于柱管内部，为过盈配合，黄曲霉毒素&免疫亲和凝胶填4料填充于上筛板2和下筛板3 间，柱管1底部设有收窄部分，黄曲霉毒素 B1免疫亲和柱还设有下堵头6。
[0042] 黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料4其固相载体为重组蛋白A琼脂糖凝胶，重组蛋 白A琼脂糖凝胶定向偶联黄曲霉毒素 B1单克隆抗体。
[0043] 柱管1直径为7. 5mm，柱管1内径为5. 0mm，所述柱管1长为66. 0mm，所述黄曲霉毒 素 B1免疫亲和凝胶填料4填充量为250ul，上筛板2和下筛板3存在于柱管1内部，黄曲 霉毒素&免疫亲和柱顶部还设有有凸缘5,凸缘5用于使用中固定免疫亲和柱，凸缘5还可 设有孔洞用于进一步固定，。
[0044] 柱体1管底部收窄部分的管长为10mm，柱管1底部收窄部分上部为倒锥型下部为 直径4mm直管。
[0045] 柱管1顶部还设有凸缘的上盖7,上盖7内部为管状，上盖7内部管状下端封闭，使 用时将上盖下端封闭处切掉，可以用作连接注射器的接头，上盖7下端还可设有预切环这 样使用时可以直接用手掰开方便使用，不用剪开或切开。
[0046] 柱管1为透明PE塑料便于观察，凸缘上盖7为柔性塑料。
[0047] 柱管1内壁设有环槽8,上筛板2设于所述环槽8内，在先使用中上筛板2可能被 顶起使凝胶上表面不平，影响精确性，所以设置环槽8来安装上筛板2,防止出现未压实的 情况。
[0048] 柱管内壁设有限位环9,上筛板2设于所述限位环9,由此防止防止出现未压实的 情况。
[0049] 黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料4可使用市售获得。
[0050] 黄曲霉毒素 B1免疫亲和凝胶填料4也可以通过以下方法获得：
[0051] AFB1单克隆抗体的制备
[0052] ⑴抗体的制备：
[0053] a、取10-12周龄或产后的雌性BALB/c小鼠，石蜡油或降植烷每只0. 5-lmL或石蜡 与弗氏不完全佐剂混合液〇. 4-0. 6mL预刺激，分笼做标记。
[0054] b、选取处于生长期的细胞（稳定分泌抗AFB1单抗的杂交瘤细胞株），去掉培养 液，换成无血清DMEM培养基或无菌生理盐水，将贴壁细胞吹下，置入50mL灭菌离心管中， 800-1000rpm离心5-8min，去掉上清重新用DMEM悬起细胞，再离心去上清，加入DMEM培养 基，调整细胞数量为IX 106/mL。每只小鼠细胞注射剂量为0. 5-1. OmL ;
[0055] c、接种后小鼠在7-10天会出现腹部膨大，在10-13天左右采集腹水，采用分步骤 引流收集或一次性收集，腹水4000rpm离心l-5min去细胞碎片，-20°C保存备用。
[0056] ⑵抗体的纯化：
[0057] a、取AFB1腹水，解冻后，4°C 10000-14000r/min，离心10-30min，去沉淀，记录腹水 体积；
[0058] b、用3-4倍的腹水体积的醋酸钠缓冲液稀释，pH控制在4. 2-4. 6,温度保持在 2-8°C，边搅拌边缓慢滴加正辛酸，添加量为按未稀释腹水计40 μ L/mL ;
[0059] c、继续搅拌 15-30min，2-8°C静置 2-4h，4°C下以 10000-14000r/min 的速度离心 2〇-30min ；
[0060] d、收集上清液，弃去沉淀，过0. 45 μ m的滤膜；
[0061] e、记录上清液体积，加入10倍浓缩的PBS缓冲液，加入量为上清液体积的1/10， 2-8°C预冷，按277g/L上清液的量缓慢加入硫酸按研磨粉末；
[0062] f、加完继续磁力搅拌器，搅拌20-30min，2-8°C静置2-4h或静置过夜；4°C下以 8000-12000r/min的速度离心15-20min，收集沉淀，弃去上清液；
[0063] g、在沉淀中缓慢加入150mmol/L的PBS溶液，加入量为步骤f搅拌完毕后总体积 的25% -50% ;将溶解的抗体溶液转移置透析袋中，用100-200倍体积的PBS溶液在2-8°C 磁力搅拌透析；
[0064] h、每2-4h更换透析液，至少3-4次，得到纯化后的抗体；用0· Olmol/L ρΗ7· 4的磷 酸盐缓冲液PBS稀释，得到AFB1单克隆抗体，单抗浓度在2. 0-5. Omg/mL。
[0065] 黄曲霉毒素 B1免疫亲和填料的制备
[0066] (1)固相载体的准备：将在乙醇中保存的重组蛋白A琼脂糖凝胶抽干后，用PBS缓 冲液洗涤2次后，再用PBS缓冲液悬浮；
[0067] (2)抗体与固相基质的偶联：
[0068] a、将AFB1单克隆抗体与步骤（1)得到的固相载体重组蛋白A琼脂糖凝胶室温下 在垂直混匀器上混合l-3h ;其中重组蛋白A琼脂糖凝胶：AFB1单克隆抗体：PBS缓冲液按体 积2 :3 :3配比混合；
[0069] b、反应结束后，用步骤a溶液总体积3-4倍的PBS缓冲液洗涤并抽干，除去未结合 的抗体及其他杂蛋白；
[0070] C、然后在步骤b所得反应物中加入0. 2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液和二甲基庚 二亚胺二盐酸盐DMP固体粉末，室温下，在垂直混匀器上混匀l-3h ;反应时的重组蛋白A琼 脂糖凝胶：三乙醇胺-硼酸溶液：DMP按2mL: 20mL: IOOmg配比；
[0071] d、反应结束后，用10-30mL的0· 2mol/L的三乙醇胺-硼酸溶液洗涤一次，并用 20-40mL、50mmol/L的乙醇胺-硼酸溶液重新悬浮，室温下，在垂直混勾器上混勾4_6min，以 终止联接反应；
[0072] e、用20-40mL的PBS缓冲液洗涤后，抽干，加入5-10mL 50mmol/L，pH3. 0的甘氨 酸-HCL溶液，室温下，在垂直混匀器上混匀4-6min，以除去未结合的抗体；
[0073] f、反应结束后，用10_30mL的质量浓度为20%乙醇-水洗涤两次，最后用等体积的 20%乙醇-水重新悬浮，得到混悬液，沉降得黄曲霉毒素&免疫亲和填料。
[0074] 本黄曲霉毒素&免疫亲和柱使用方法及可以达到的性能参数
[0075] (1)黄曲霉&免疫亲和柱柱容量测定
[0076] a.标准对照液制备
[0077] 用移液管准确移取I. OmL的储备液到IOmL锥形试管中，用氮气将溶液吹干，然后 用45%的甲醇水将残渣重新溶解，定容至1〇1^容量瓶，振摇1511^11，配成浓度为1〇1^/1^ 的AFB 1标准对照品液，过0. 22 μ m水相微孔滤膜后进样。
[0078] b.测试工作液制备
[0079] 用移液管准确移取5. OmL的储备液到IOmL锥形试管中，用氮气将溶液吹干，然后 用10%甲醇^^3将残渣重新溶解，定容至1〇1^容量瓶，振摇151^11，配成浓度为5〇1^/1^ 的AFBJ〗试工作液。
[0080] c.样品过亲和柱净化
[0081] 将亲和柱上方堵头7取出后剪断，再插回亲和柱；将一次性20mL注射器连接于亲 和柱上部，用IOmL pH7. 4PBS缓冲液平衡柱子，可以1滴/秒通过亲和柱；准确移取标准液 5mL注入注射器中，可以1滴/2秒的速度缓慢通过亲和柱；用20mL水冲洗亲和柱，可以流 速2滴/秒，弃去流出液，直至2-3mL空气通过柱体，保证柱内无残余液体；准确加入I. OmL 甲醇（B. 2.1)洗脱，可以流速1滴/2-3秒，直至2-3mL空气通过柱体。收集全部洗脱液，取 适量用甲醇水稀释10倍，测定AFB 1含量。
[0082]
【权利要求】
1. 一种黄曲霉毒素B i免疫亲和柱，其特征在于，所述黄曲霉毒素B i免疫亲和柱包括柱 管（1)、上筛板（2)、下筛板（3)、黄曲霉毒素&免疫亲和凝胶填料（4)，所述上筛板（2)和下 筛板（3)设于柱管（1)内部，所述黄曲霉毒素&免疫亲和凝胶填料（4)填充于上筛板（2) 和下筛板（3)间，所述柱管（1)底部设有收窄部分，所述黄曲霉毒素&免疫亲和柱还设有 下堵头（6)。
2. 根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素B i免疫亲和柱，其特征在于，所述黄曲霉毒 素&免疫亲和凝胶填料（4)其固相载体为重组蛋白A琼脂糖凝胶。
3. 根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素8 i免疫亲和柱，其特征在于，所述柱管（1) 直径为7. 5mm，所述柱管（1)内径为5. Omm，所述柱管长为（1)66. Omm,所述黄曲霉毒素1^免 疫亲和凝胶填料（4)体积为250ul，所述上筛板（2)和下筛板（3)存在于柱管内部，所述黄 曲霉毒素&免疫亲和柱顶部还设有凸缘（5)。
4. 根据权利要求3所述的一种黄曲霉毒素1免疫亲和柱，其特征在于，柱管（1)底部 收窄部分的管长为l〇mm，所述柱管（1)底部收窄部分上部为倒锥型下部为直径4mm直管。
5. 根据权利要求4所述的一种黄曲霉毒素B i免疫亲和柱，其特征在于，所述柱管顶部 还设有上盖（7)，所述上盖（7)内部为管状，所述上盖（7)内部管状的下端封闭。
6. 根据权利要求5所述的一种黄曲霉毒素1免疫亲和柱，其特征在于，柱管（1)为透 明PE塑料，所述上盖（7)为柔性塑料。
7. 根据权利要求1?6任一所述的一种黄曲霉毒素B i免疫亲和柱，其特征在于，所述 柱管（1)内壁设有环槽（8)，所述上筛板（2)设于所述环槽（8)内。
8. 根据权利要求1?6任一所述的一种黄曲霉毒素B i免疫亲和柱，其特征在于，所述 柱管内壁设有限位环（9)，所述上筛板（2)设于所述限位环（9)下。
【文档编号】G01N30/60GK204214826SQ201420752120
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】张东升, 袁艺, 杨婷婷, 张海涛, 龚燕, 匡群, 叶进, 诸建国 申请人:江苏省苏微微生物研究有限公司