萃取和浓缩装置的制作方法
本发明涉及一种用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置。
背景技术：
本说明书中对任何先前出版物(从其获得的信息)或任何已知的事物的引用不是也不应被视为确认或承认或任何形式的建议，即先前的出版物(或从其获得的信息)或已知事物构成本说明书所涉及的努力领域的常见一般知识的一部分。
为了改善全球健康，需要访问诊断和/或分析装置，以便促进直接从生物样品中快速准确地分析。定性和定量的这些分析在如治疗药物监测、取证和诊断的广泛领域中特别有益。它也可以扩展到涵盖兽医、食品安全和环境分析的应用。
用于生物样品的传统分析系统包括液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)和免疫测定。尽管与免疫测定相比，lc-ms/ms具有增强的灵敏度和特异性，但是该技术被更多地涉及，需要更长时间并且需要昂贵的非便携式设备，这些设备必须由专业培训的人员操作。免疫测定法较便宜并且可携带，但是它们倾向于存在特异性和灵敏性问题。
近来，消费者诊断装置在市场上已经变得流行并且容易获得，例如血糖计和妊娠检验。从生物流体直接分析的其他实例包括诊断纸微流体(见a.w.martinez,s.t.phillips,g.m.whitesidesande.carrilho,analyticalchemistry,2009,82,3-10)和用于谷胱甘肽分析的电泳装置(见,z.long,d.liu,n.ye,j.qinandb.lin,clinicalchemistry,2007,53,117-123)。此外，以前提出的用于小分子的微流体采样/答录装置是medimate，其用于定量情绪稳定剂锂(见,e.x.vrouwe,r.luttgeanda.vandenberg,electrophoresis,2004,25,1660-1667；e.x.vrouwe,r.luttge,w.olthuisanda.vandenberg,electrophoresis,2005,26,3032-3042；e.x.vrouwe,r.luttge,i.vermesanda.vandenberg,clin.chem,2007,53,117-123)。
然而，这样的装置通常局限于分析某些分析物。在生物样品中存在大的疏水性分子，如蛋白质和脂质，干扰了分析。在medimate中，虽然使用表面涂层减少了蛋白质的吸附，但并没有消除，因此排除了设备更广泛的测量其他分析物的适用性。
因此，虽然消费者诊断装置变得越来越普遍，但现有装置存在一个或多个缺点，包括低灵敏度和/或分辨率，冗长和/或复杂的样品制备，高和/或复杂的仪器和培训要求，冗长的工艺，制造成本高等。
技术实现要素：
本发明意欲改善与现有技术相关的一个或多个问题和/或提供可行的替代方案。
在一个广泛的形式中，本发明意欲提供一种用于从含有多个目标分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置，所述装置包括：
a)接收样品的样品通道；
b)分离通道；
c)废物通道；
d)在所述样品通道和所述分离通道之间的第一接头，其中，根据第一接头的第一自由输送区的尺寸，所述第一接头选择性地将第一组分析物从所述样品通道输送至所述分离通道，所述第一组包含至少一些目标分析物并且是所述样品中多个目标分析物的子集；和
e)在所述分离通道和所述废物通道之间的第二接头，其中，根据第二接头的第二自由输送区的尺寸，所述第二接头选择性地将第二组分析物从所述分离通道输送至所述废物通道，所述第二组是第一组的子集，以便浓缩所述分离通道中的一些目标分析物。
通常，所述第一接头包括至少一个在所述样品通道和所述分离通道之间延伸的第一接头通道，并且其中，所述第一自由输送区的尺寸至少部分地取决于至少一个第一接头通道的尺寸和至少一个第一接头通道内双电层重叠的程度中的至少一种。
通常，所述第二接头包括所述分离通道和所述废物通道之间延伸的至少一个第二接头通道，并且其中，所述第二接头自由输送区的尺寸至少部分地取决于至少一个第二接头通道的尺寸和至少一个第二接头通道内双电层重叠程度中的至少一种。
通常，在所述第一接头中的选择性输送是根据所述第一组中各分析物的电荷和尺寸中的至少一种。
通常，在所述第二接头中的选择性输送是根据所述第二组中各分析物的电荷和尺寸中的至少一种。
通常，所述装置包括在所述样品通道中的至少一个第一电极，和在所述废物通道中的至少一个第二电极，以由此在所述第一和第二接头上施加第一电位，以便通过所述第一和第二接头选择性地输送分析物。
通常，施加所述第一电位，从而在分离通道的区域内锐化浓缩的目标分析物。
通常，所述装置包括在所述分离通道中的第三和第四电极以由此沿着所述分离通道施加第二电位，以便在所述分离通道内选择性地输送来自第一组分析物的分析物。
通常，基于分析物的尺寸、电荷比和电泳迁移率中的至少一种，使用所述分离通道中的电位使目标分析物以一定的速率迁移。
通常，所述装置包括检测器，其在使用中检测所述分离通道内的目标分析物的浓度。
通常，第一和第二接头中的至少一种包括以下的至少一种：
a)多个通道；
b)单个通道，具有延长的横断面面积；
c)水凝胶；和，
d)膜。
通常，所述第一接头和所述第二接头沿着分离通道的长度形成分支。
通常，所述样品通道和所述废物通道中的至少一种是以下的至少一种：
a)朝向所述分离通道逐渐变细；
b)基本上“v”形；和，
c)基本上“u”形。
通常，所述样品通道包括两个样品通道臂，每个臂接近第一端具有各自的第一电极，并且所述第一接头设置紧邻第二相对端。
通常，所述废物通道包括两个废物通道臂，每个臂接近第一端具有各自的第二电极，并且所述第一接头设置紧邻第二相对端。
通常，根据电泳迁移率、电渗流(eof)和离子浓度极化中的至少一种至少部分地控制在所述第二接头中的选择性输送。
通常，所述装置包括沿着所述分离通道间隔开的多个第二接头，并且其中，每个第二接头用于除去各自的分析物，从而使多个不同目标分析物在所述分离通道内被萃取和浓缩。
在另一个广泛的形式中，本发明意欲提供用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩一些目标分析物的仪器，根据本发明的广泛的形式，所述仪器包括一些装置，每个装置适合于萃取和浓缩各自的分析物，并且其中，上游装置的废物通道是与下游的样品通道流体连通并形成其一部分中的至少一种。
在另一个广泛的形式中，本发明意欲提供一种从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的方法，所述方法包括：
a)在样品通道中装载所述样品；
b)根据第一接头的第一自由输送区的尺寸，通过第一接头选择性地将包含至少一些目标分析物的第一组分析物输送到分离通道，所述第一组是所述样品中多个分析物的子集；和
c)根据第二接头的自由输送区的尺寸，通过第二接头选择性地将第二组分析物输送至废物通道，所述第二组是所述第一组的子集，以便浓缩所述分离通道中的多个目标分析物。
通常，所述方法包括在所述样品通道中的至少一个第一电极和所述废物通道中的至少一个第二电极之间施加第一电位，以便通过所述第一和第二接头选择性地输送分析物。
通常，所述方法包括在所述分离通道中的第三和第四电极之间施加第二电位，以便在所述分离通道内选择性地输送来自第一组分析物的分析物。
附图说明
现在，将参考附图描述本发明的实例，其中：
图1是用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置的第一个实例的示意图；
图2是从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的方法的第一个实例的流程图；
图3是制造用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置的方法的第一个实例的流程图；
图4是用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置的另外的实例的示意图；
图5是从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的方法的另外的实例的流程图；
图6a是显示用荧光胺标记的带负电荷的牛血清白蛋白浓缩在示例装置的样品通道的尖端的实验结果的图；
图6b是显示荧光素(类似于目标分析物的小阴离子)从装置的样品室电动地输送到示例分离通道内的实验结果的图；
图6c是显示硫氰酸根离子通过第二接头电动地从示例装置的分离通道输送到废物通道内的实验结果的图；
图7a是样品基质离子强度随时间不同浓度的图示；
图7b是使用不同浓度的羟丙基甲基纤维素(pmc)改变样品基质粘度的图示；
图7c是在分离通道中背景电解质的离子强度的图示；
图8是在相同条件下比较用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置的实例与常规的挤压注入的电泳图的图示；
图9a和9b是将使用9μa的电流限制产生的纳米孔获得的结果与5μa的优化电流限制产生的纳米孔获得的结果进行比较的电泳图的图示；和
图10是用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置的另外的实例的示意图。
具体实施方式
现在，将参考图1和2描述用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置的实例。
在该实例中，装置100包括样品通道110、分离通道120和废物通道130。第一接头150设置在样品通道110和分离通道120之间，并且第二接头160设置在分离通道120和废物通道130之间。
在使用中，从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的方法包括，在步骤200中，将所述样品装载到样品通道110中。在步骤210中，所述方法包括，根据第一接头150的第一自由输送区的尺寸，选择性地将第一组分析物通过所述第一接头150从所述样品通道110输送至所述分离通道120，所述第一组是所述样品中多个目标分析物的子集，并且包含至少一些目标分析物。
在步骤220中，所述方法进一步包括，根据第二接头160的第二自由输送区的尺寸，选择性地将第二组分析物通过第二接头160从分离通道120输送至废物通道130，所述第二组是所述第一组的子集，以便浓缩分离通道120中的一些目标分析物。
因此，装置100和方法有助于使用一系列具有不同尺寸的自由输送区的接头从样品中萃取和浓缩目标分析物。这种安排是有利的，因为其允许简单且容易地进行目标分析物的同时提取和浓缩，并且在一些实例中，不需要样品制备、稀释、浓缩等。特别有利的是，由于装置100可以用作使用者分析或诊断的装置，如片内设备或其他采样/答录装置，其向用户、使用者和/或临床医生提供及时和精确的信息。
此外，根据第一和第二自由输送区各自的尺寸，装置100和/或方法可以应用于任意适合的目标分析物，例如，制药或非法药物、诊断标记、dna、蛋白质、病原体、其他生物标记等，并且这将在下面更详细地描述。因此，装置100和/或方法可以用于任意适合的流体样品，如全血、尿、唾液、乳汁、废水等。
现在，将描述一些其他特征。
在一个实例中，第一接头150包括至少一个在所述样品通道和所述分离通道之间延伸的第一接头通道，并且其中，所述第一自由输送区的尺寸至少部分地取决于第一通道的平均孔径、特别是宽度(或高度)或半径和所述第一通道内双电层(edl)重叠的程度中的至少一种。类似地，在另一个实例中，第二接头160包括至少一个在所述分离通道和所述废物通道之间延伸的第二接头通道，并且所述第二自由输送区的尺寸至少部分地取决于第二接头160的平均孔径和第二接头160的双电层重叠的程度中的至少一种。
例如，在第一和/或第二接头150、160基本上用电解质填充的情况下，edl在第一和/或第二接头150、160的内表面周围形成的液固界面处发展。edl的厚度至少部分地取决于电解质的离子强度，使得降低离子强度增加edl厚度。在电泳力的第一和/或第二接头150、160上提供足够高的电场以克服来自内表面的静电吸引力的情况下，如用于带负电的表面的阳离子或用于带正电的表面的阴离子的反离子携带电流，而通常排除共离子。因此，在第一接头150和/或第二接头160中的选择性输送分别根据所述第一组和/或第二组中的每种分析物的尺寸和/或电荷。应当注意的是，中性分析物还可以使用带电的“载体”(如胶束)输送。在这点上，这种机制依赖于携带分子到所述接头、断裂和释放中性分子的胶束，因为其通过所述第二接头。
所述第一和/或第二自由输送区还受各自的通道的物理尺寸(如第一通道和/或第二通道的半径)影响，因为只有半径小于所述自由输送区的分析物可以被选择性地输送。在这点上，所述自由输送区通常相当于第一通道和/或第二通道的平均孔径，小于其中edl的厚度。
尽管所述第一和/或第二接头可包括单个通道，但是所述接头也可包括多个通道，例如以束提供。一个或多个通道可具有基本圆形的横断面面积，或者可包括细长的横断面面积，例如具有有限高度(如10nm)的单个通道，从而控制自由输送尺寸，同时基本上更宽(如2mm)，允许多个分析物通过其输送。宽通道或多个通道的使用允许自由输送尺寸被控制，同时提供高带宽从而增加通过量。所述接头还可包括水凝胶和/或薄膜以进一步控制分析物的输送。在一个实例中，所述薄膜包括亲水聚碳酸酯径迹蚀刻(pcte)膜，如可从sterlitech公司(美国，华盛顿)购买的那些。
装置100通常包括在样品通道110中的至少一个第一电极111，和在废物通道130中的至少一个第二电极135，从而在第一和第二接头150和160上分别施加第一电位。在这点上，第一和第二电极111、135使上述选择性输送通过接头150、160，导致所选择的分析物的同时萃取、浓缩和纯化。该步骤通常称为注入步骤。
在注入步骤中，可以施加电位，从而在分离通道120的区域内锐化浓缩的目标分析物。如下面将进一步讨论的，施加电位超过预定时间的时间可导致离子浓度极化(icp)的发生，其中，耗尽区和富集区至少促使分离通道120中的目标分析物进入该区域。在一些实例中，所述区域朝向第二接头160。如在下面更详细的讨论，通常所述区域是横跨分离通道120的基本上窄的带，因此在所述目标分析物随后经过电泳分离的情况下其更有利。
尤其是，将理解的是，通过第一和/或第二接头150、160的电泳输送至少部分地取决于与各自的电渗流(eof)相比在接头150、160中分析物的电泳迁移率的方向和大小。在这点上，接头150、160的表面电荷密度，接头150、160内电解质的离子强度和edl重叠的程度决定了eof的大小，而表面电荷(正或负)决定了它的方向。
在完成所述注入步骤之后，施加的电压可以切换成开始可选的电泳分离。在这点上，装置100包括在所述分离通道中的第三和第四电极121、122，从而沿着所述分离通道施加第二电位，以便在所述分离通道内选择性地输送来自第一组分析物的分析物。具体地，分离通道120内的目标分析物以由它们的大小、电荷比和电泳迁移率中的一个或多个确定的速度沿着分离通道120输送。所述分离通道可包括检测器，使得所述目标分析物被输送通过所述检测器，使将要被检测的样品中的目标分析物浓缩，并且这将在下面详细描述。
然而，将理解的是，可能不需要电泳分离并且在分离通道内的浓缩的分析物可以以其他方式使用。例如，可以加入反应物使得反应进行。或者，可以从所述分离通道中萃取分析物，使得所述分析物随后进行设备的远程分析。
在一些实例中，样品通道、分离通道和废物通道110、120、130可以是任意适合的形状、尺寸和/或各自的方向。在这点上，样品通道110和/或废物通道130可以朝向所述分离通道120变细。更典型地，所述样品通道和所述废物通道通常是基本上具有两个通道臂的“v”或“u”形。在该实例中，通常设置双电极，相应的电极紧邻每个臂的第一端，并且设置接头紧邻每个臂的第二相对端。这使得例如样品中目标分析物的输送率更高。应当注意的是，样品通道110的“v”型设计限制了面积，其中第一接头150可在样品通道110和分离通道120之间形成，并且因此“u”型安排可能是优选的。
在一些实例中，第一接头150和第二接头160位于分离通道120的相对侧，然而这不是必须的，并且可以使用在所述分离通道周围的任意适合位置。通常，第一接头150和第二接头160沿着分离通道的长度形成分支。这在分离通道120中的目标分析物的带变窄中可能是特别有益的，例如，这反过来又可以改善电泳分离。尤其是，如下面进一步讨论的，形成分支使得离子通过第一接头150输送，并且最小化来自由第二接头160产生的离子浓度极化(icp)的干扰。
在另外的实例中，在第二接头160中的选择性输送根据电泳迁移率、eof、edl重叠和/或离子浓度极化(icp)至少部分地控制，并且这将在下面进一步讨论。
在一些实例中，样品通道110、分离通道120和废物通道130中的至少一个基本上用电解质溶液填充。在这点上，电解质溶液的类型和浓度将基于目标分析物的性质决定。在一些实例中，一个或多个通道中的电解质溶液在第一和/或第二接头150、160的形成和使用期间可以是相同的，然而这不是必须的，并且在另一些实例中，所述电解质溶液在形成和使用期间可以是不同的。
在上述实例中，设置单个第二接头和废物通道。然而，这不是必须的，并且所述装置可包括沿着所述分离通道间隔开的多个第二接头，并且其中每个第二接头用于除去各自的分析物，从而允许多个不同目标分析物在所述分离通道内被萃取并浓缩。在该实例中，分析物从所述分离通道逐渐除去，允许多路传输以更容易地靶向多种候选分析物。
在另一个实例中，仪器可以由顺序排列的多个装置形成。在该实例中，所述仪器可以用于从流体样品中萃取和浓缩多个目标分析物，每个装置适合于提取和浓缩相应的分析物，并且其中上游装置的废物通道与下游装置的样品通道流体连通或部分流体连通，使得目的分析物依次通过每个装置接连地萃取和浓缩。
现在，将参考图3描述制造用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地萃取和浓缩目标分析物的装置的方法的实例。
在该实例中，所述方法包括在步骤300中设置其间具有第一绝缘体的样品通道和分离通道。这可以以任意适合的方式实现，并且在一个实例中包括在片内设置所述样品通道和输出通道，该片基本上由聚二甲硅氧烷(pdms)、玻璃、调色剂等中的一种或多种组成。在这点上，所述第一绝缘体基本上可以由pdms、玻璃、调色剂等中的一种或多种组成。
在一些实例中，如本领域技术人员将理解的是，所述样品通道和/或分离通道基本上填充有电解质溶液，如1mm磷酸氢二钠、10mm磷酸盐缓冲液、50mm氯化钾或任意其他适合的电解质溶液和/或它们的浓缩物。
此外，所述样品通道和/或分离通道可以以任意适合的形状和/或方向设置。在一个特定的实例中，所述样品通道设置为隔室，其朝向所述分离通道变细，例如，基本上为“v”型隔室。此外，所述样品通道可以设置为“u”型隔室，其中，底部朝向所述分离通道。然而，在其他实例中，所述通道可以是任意适合的形状、尺寸或方向。
此外或另外，所述样品通道和/或分离通道可以相对于彼此以任意适合的接近度设置。例如，所述样品通道和所述分离通道之间的距离通常大于或等于大约10μm，更优选大约50μm并且最优选小于或等于大约1000μm。如将要理解的是，所述通道之间的距离可以根据通道的相对形状和方向而变化，并且因此上述距离仅作为实例提出。
在步骤310中，所述方法包括在所述第一绝缘体上施加电场，其中所述电场超过第一绝缘体的介电强度，从而形成至少一个第一接头。在这点上，所述第一接头在所述样品通道和所述分离通道之间延伸。如稍后将讨论的，这可以以任意适合的方式实现，并且在一个实例中，包括将电极定位在每个样品通道和分离通道中，和使用具有预设电流限制的电源在所述电极之间施加电位。
在这点上，选择所施加的电位以便超过所述第一绝缘体的介电强度，并且因此通常至少部分地基于所述介电强度和所述通道之间的距离来选择。例如，2.2kv的电位可以在pdms绝缘体上施加(介电强度21v.μm-1)，其将所述样品通道和所述输出通道分离约100μm。
在步骤320中，所述方法包括在至少一个第一接头的形成之后向下调节或停止电场，从而至少部分地控制第一接头的孔径。这可以以任意适合的方式实现，并且在一个实例中，包括监测来自电源的返回电流。在这方面，在第一接头形成之前，当施加电位时将没有电流被检测到，然而随着时间的推移，当第一个通道形成时，检测到的电流将根据所述第一接头中通道的横断面(也称为孔径)逐渐增加。因此，通过当电流达到阈值时下调或停止电位，将返回电流保持在预定阈值以下，允许至少部分地控制第一接头的平均孔径。在这方面，当可以在步骤310中选择超过所述介电强度的任意适合电位，则通常恰好高于介电击穿的电位允许更好的控制，因为电流的升高比用较高的电场慢，给电源调整时间，而不会引起不必要的孔径扩大。
因此，返回电流的预定阈值通常将根据所需应用决定。例如，如果使用下调施加响应返回电流的电压的电源和1mm磷酸氢二钠，则在将所述样品通道和所述分离通道分离约100μm的pdms绝缘体(介电强度21v.μm-1)上施加2.2kv的电位时，5μa的阈值通常将产生第一接头通道的孔径，这样防止例如红细胞(6-8μm的尺寸)从所述样品输送到所述分离通道，同时允许输送荧光胺标记的牛血清白蛋白(bsa)。3μa的阈值通常将产生允许输送阴离子5-(和-6)-羧基萘酚荧光素(cnf)而不是bsa的第一接头。2μa的阈值产生允许输送阳离子染料若丹明6g(r6g)并限制cnf的第一接头。1μa的阈值产生限制bsa、cnf和r6g的输送，但允许输送小离子、铁(iii)和硫氰酸盐的第一接接头。
因此，预定电流阈值影响所得第一接头的平均孔径，从而影响通过所述第一接头的选择性输送，如关于在此所述的任意一个实例所讨论的，并且因此可以用于目标分析物的萃取和浓缩。应当注意的是，以上概述的电流对于一个实例情景是特别的，并且不同的电流限制可能适用于不同的情况。例如，如果电源发生变化，可能会获得不同的结果，因此与停止电压的情况相比下调电压的电源可能会产生不同的结果。并且，根据电解质种类和离子强度，所述电流将不同。
在步骤330中，所述方法包括设置废物通道，其中，第二绝缘体设置在所述分离通道和所述废物通道之间。如前所述，这可以以任意适合的方式实现，如在具有分离通道和样品通道的芯片上设置所述废物通道。类似地，所述芯片和/或第二绝缘体可以由任意适合的材料组成，如上关于第一绝缘体所述。在这点上，所述第一和第二绝缘体可以由相同材料或不同材料形成。
并且，如上所述，与所述样品通道相关，所述废物通道可以以任意适合的形状、尺寸和/或方向安排。在一个实例中，所述废物通道朝向所述分离通道变细，并且通常所述废物通道基本上是“v”型隔室。此外，所述废物通道可以设置为“u”型隔室，其中底部朝向所述分离通道。在进一步的实例中，所述样品通道和所述废物通道设置在分离通道的相对侧，并且在这点上，任选地，所述样品通道和所述废物通道可以在所述相对侧上形成分支。
在一些实例中，如本领域技术人员将理解的，所述废物通道基本上填充有电解质溶液，如1mm磷酸氢二钠、10mm磷酸盐缓冲液、50mm氯化钾或任意其他适合的电解质溶液和/或它们的浓缩物。
在步骤340中，所述方法包括在所述第二绝缘体上施加电场，其中，所述电场超过第二绝缘体的介电强度，从而形成至少一个第二接头。这可以以任意适合的方式进行，包括关于在所述第一绝缘体上施加电场的上述任意实例。
所述方法进一步包括在形成至少一个第二接头之后，下调或停止所述电场，在步骤350中，从而至少部分地控制第二接头通道的孔径。这个步骤还可以以任意适合的方式进行，如关于所述第一接头的上述任意实例。在一些实例中，可能需要所述第一和第二接头通道的相对尺寸不同，并且因此，通常，下调或停止施加在所述第二接头上的电场的预定返回电流阈值，也称为第二预定电流阈值，将与施加于所述第一接头上的电流阈值，也称为第一预定电流阈值不同。更典型地，第二预定电流阈值将小于第一预定电流阈值，使得所得第二接头通道的平均孔径小于第一接头通道的平均孔径。在任意情况下，这将在下面更详细地描述。
另外，所述第一和/或第二接头可以使用薄膜形成，并且这可以例如代替利用绝缘体的介电击穿来实现。在一个特定的实例中，所述膜包括亲水聚碳酸酯径迹蚀刻(pcte)膜，其可以是pvp涂布的并且具有最低的非特异性结合。通常，该实例的膜厚度大约是6μm，由于其降低了与pdms结合问题的风险因此是特别有利的。在该实例中，所述接头通常在直径10nm至几百纳米的范围内。然而，这种特定类型的膜不是必需的，并且在其它实施例中可以使用任何适合的膜。
虽然以特定顺序描述了上述方法步骤，但是应当理解的是，所述步骤可以以任意适合的顺序进行。例如，第二接头的形成可以在形成第一接头之前，提供样品、分离和废物通道可以同时或以任意顺序等发生。
然后，如图4和5所示，包括通过上述方法产生的合适接头的装置可以用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地提取和浓缩目标分析物。具有与上述实例的那些类似的特征已经被相应地分配相似的附图标记。
在该实例中，装置400包括样品通道410、分离通道420和废物通道430。如图所示，分离通道420在中间，样品通道410和废物通道430设置在分离通道420的相对侧。此外，样品通道410基本上垂直于分离通道420，并且朝向分离通道420变细，废物通道430类似地安排在分离通道420的相对侧上。第一绝缘体设置在样品通道410和分离通道420之间，并且第二绝缘体设置在分离通道420和废物通道430之间。该实例中的样品通道、分离通道和废物通道410、420、430也基本上用电解质溶液填充。在这点上，电解质溶液的类型和浓度，并且此外，所述通道之间的绝缘体的类型和尺寸可以基于目标分析物的性质来确定。
在步骤500中，所述方法包括形成预定第一平均孔径的第一接头450，其在样品通道410和分离通道420之间延伸。这可以以任意适合的方式实现，如在以上实例中所描述的。如在此所讨论的，所述方法进一步包括形成预定第二平均孔径的第二接头460，其在分离通道420和废物通道430之间延伸，并且如上所述，这可以以任意适合的方式进行。在该实例中，第一接头450的平均孔径大于第二接头460的平均孔径，并且这将在下面更详细地讨论。
接头的第一和第二预定平均孔径通常取决于所述目标分析物，并且在一些实例中取决于流体样品的性质。在这点上，通常第一接头的自由输送区将超过目标分析物的尺寸，而第二接头的自由输送区将相当于或小于目标分析物的尺寸。此外，应当理解的是，所述第一和第二接头可以在任意适合的时间形成，如在使用之前，制造期间等。
在步骤520中，所述方法包括将样品s装载在样品通道410中。这可以以任意适合的方式实现，并且通常涉及将流体样品例如血液、尿液、唾液等转移到样品通道410中的受试者和/或临床医生。如图4所示，该实例中的样品s包括不同尺寸和电荷的多个分析物。
在步骤530中，在第一和第二接头450、460上施加电位，以便将第一组分析物g1从样品通道410同时输送至分离通道420，将其浓缩并通过第二接头460将不需要的称为第二组g2的小离子从分离通道420输送到废物通道430中。如上所述，基于多个因素来实现第一组g1的选择性输送，其包括第一接头450的尺寸、第一组分析物g1各自的电荷、电解质浓度、edl厚度、第一接头450的自由输送区、eof大小和方向等。在第二接头460上的电位选择性地将第二组g2从分离通道420输送至废物通道430。如上所述，基于多个因素(其包括第二接头460的尺寸、第二组分析物g2各自的电荷、电解质浓度、edl厚度、第二接头460的自由输送区、eof大小和方向等)实现的第二组g2的选择性输送。在该特定的实例中，所述第二组g2包括比目标分析物t更小的离子，并且因此通过第二接头460的选择性输送有效地将目标分析物t浓缩在输出通道420中。
在步骤540中，允许注入步骤530在目标分析物t的离子输送停止后继续足够长时间，使得离子浓度极化(icp)由第一接头450产生，从而在第一接头450的阳极侧的耗尽区将第一组g1推向与由第二接头460产生的eof方向相反的第二接头460。如将理解的，icp对应于在阴极和阳极侧上形成富集区和耗尽区。这可以以任意适合的方式实现，并且在一个实例中包括等待预定时间，同时在第一接头450上施加电位。在这点上，通常icp的起始的预定时间比第二接头460发展成icp需要的长，并且取决于第一接头的尺寸、电解质溶液的离子强度、eof改性剂的存在和第一接头的净表面电荷。
因此，在将第一组g1输送到分离通道420之后，icp的开始将分离通道420内的第一组g1注入塞锐化成较窄的带，这在电泳分离期间是有利的。在一个实例中，这可以通过在第一接头450的阳极侧上，在分离通道420上缓慢膨胀，将注入的组推向第二接头460的耗尽区来实现。
在步骤550中，所述方法包括向分离通道420施加电场，以确保第一组g1的电泳分离，其中每个组分以由其尺寸/电荷比确定的速度沿着分离通道420迁移，也称为电泳迁移率，并通过检测器以提供其浓度的指示，其包括目标分析物t浓度。这可以以任意适合的方式实现，并且在该实例中使用电泳分离来实现。
在任意情况下，以上提供了来自样品的目标分析物t的片内同时提取、浓缩和纯化的实例，其利用可根据目标分析物t的性质以及任选的流体样品的性质来调整的装置。这可以通过平均孔径不同并且作为一个系统工作的两个接头450、460的存在来实现。
实施例-血氨苄青霉素浓缩
现在将参考实验结果和图6a至10来描述用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地提取、浓缩和纯化目标分析物的装置的另一个实施例。在该实施例中，样品包括全血，目标分析物为氨苄青霉素，并且使用串联的两个不同孔径接头的组合来产生分子大小和输送率阱(smt)1000以从全血中选择性地浓缩氨苄青霉素。
氨苄青霉素是用于治疗败血症的第一线抗生素的实例，并且被选为本工作的目标分析物。当身体对感染的反应损害其自己的组织和器官时，败血症就会出现，并且对于所有患者的30％至50％是致命的。败血症的住院率在过去十年中翻了一番以上，而且在许多国家，每年有更多的人因败血症而不是心脏病发作住院。在美国，2008年花了146亿美元用于败血症的住院治疗，而在德国，典型的败血症发作的成本在过去十年中增加了一倍多，从25,000到55,000欧元。在治疗败血症方面，由于血液动力学改变，药物的药代动力学行为显著改变，剂量的选择尤其重要，但难以确定。
在该实施例中，图10所示的装置1000接收约40μl的血液，其通常相当于约一滴血液，并且在约3分钟内提供血氨苄青霉素浓度以通知给药。这样的装置1000是特别有利的，因为它有助于护理提供者做出及时和知情的决定，这又可以拯救生命。
通过通道的离子传输自然发生。当具有带电表面的通道充满电解质时，在固-液界面处形成电双层(edl)。对于带负电荷的表面，阳离子的stern或固定层更接近表面形成，并且离子具有一些迁移率的阴离子和阳离子的扩散层更远离形成。中性表面不会发展edl。通过降低通道中的电解质离子强度，edl的厚度增加。当跨越通道施加足够高的电场时，电泳力克服来自表面的静电吸引力，并且stern层中的阳离子将朝向阴极迁移，产生阴极或正常电渗流(eof)。
在通道中，edl厚度与通道尺寸相当，产生两个离子输送场景。如果通道尺寸接近edl厚度的两倍，则edl重叠导致孔的选择渗透性，有利于edl中的抗衡离子(在带负电荷的表面的情况下为阳离子)，同时排除共离子。通道的尺寸也很重要，因为只有足够小以迁移通过edl的抗衡离子才能被输送。相反地，当edl不重叠时，可以在通道中区分两个区域：围绕中心的自由输送区的固-液界面附近的静电相互作用区域。抗衡离子的尺寸变得很重要，因为该自由输送区域的物理尺寸可能足以允许小离子，但是由于其大小而阻碍了大生物分子的输送。
与eof相比，通过纳米孔的电泳输送还取决于离子的电泳迁移率的方向和幅度。通道中的表面电荷密度、离子强度以及edl重叠程度决定了eof的大小，而表面电荷(正或负)确定其方向。考虑到这些因素允许调整接头的渗透性以选择性地在大小和输送率范围内输送离子。使用通过电介质击穿产生的接头控制选择性离子输送，这提供了一种用于在两个微流体通道之间形成接头的简单且成本有效的技术。
在该实施例中，设备1000包括“v”形样品通道和废物通道1010、1030，每个具有位于“v”的臂的第一端处的相应的双电极1011、1035，具有通过电介质击穿在臂的第二端形成的接头1050、1060，通常可以实现混沌过程，其通过设定电流限制来控制，一旦达到电流阈值即可下调或停止施加的电压，并产生孔径。具体地，我们使用两个连续的接头1050、1060来形成尺寸和迁移率阱(smt)1000以萃取、浓缩和纯化目标分析物。这允许小药物(如氨苄青霉素)通过具有较大孔的第一接头1050的尺寸选择性电萃取，随后使用在包含较小孔的第二连接头1060处产生的电泳迁移率和离子浓度极化(icp)的差异进行其浓缩和脱盐。
该实施例的装置1000(也称为smt1000)是不可逆密封的pdms/玻璃装置，其具有“v”形样品通道与废物通道1010、1030的尖端之间的100μmpdms绝缘体，和50μm宽的分离通道1020(通过其形成接头1050、1060)。在这点上，pdms预聚物和固化剂从以贸易名称dowcorning(sylgard184)交易的组织购买。用于荧光跟踪的荧光素购自西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrichco.)。
为了固化pdms预聚物，将10:1硅氧烷弹性体和固化剂的混合物倒在根据制造商的程序制备的su-8模板上，并在60℃下放置1小时。用于制备微流体装置1000的模板具有两个宽度为500μm和高度为30μm的v形通道1010、1030。两个通道1010、1030的尖端沿着分离通道1020的长度放置在距中间分离通道1020的任一侧的100μm处，并且彼此相距500μm。分离通道1020的宽度为50μm，高度为30μm。固化后，将pdms与模板分离。在氧等离子体处理15秒后，微流体pdms层和载玻片不可逆地结合。
来自样品和废物“v”形通道1010、1030的接头1050、1060定位在分离通道1020的相对侧上并且距500μm形成分支。在使用该装置之前，所有通道1010、1020、1030都填充有10mm磷酸盐缓冲液，ph11，并且将2200v的击穿电压施加到样品v-通道1010，同时保持分离通道1020接地并将电流限制设定为5μa。
产生将样品v-通道1010连接到分离通道1020的接头，其具有5μa电流限制，以产生阻止细胞、血浆蛋白质和其它大分子输送同时允许通过自由输送区域输送较小离子(分子量<1000da)，不被edl占用的孔。在稍后的注入步骤中，接头两侧的高离子强度和hpmc的使用屏蔽了表面电荷，其延迟了icp的发展，并允许注入小的阴离子。
接下来，具有常见输入的双电极1035连接到废物“v”通道1030，并且将电流限制设置为1μa。由于使用相对低的电压，没有观察到气泡形成。然后，清洁通道1010、1020、1030并用实验溶液重新填充。对于击穿后的第一次使用，以1000v在第一接头施加相反的极性直到达到5μa的电流，然后设置用于实验的适当电压。
在形成接头1050、1060之后，将样品置于填充有背景电解质(bge，100mm磷酸盐缓冲液，ph11.5，和0.5％羟丙基甲基纤维素(hpmc)，除非另有说明)的样品“v”通道1010和分离通道1020中，而废物v-通道1030填充有10mm磷酸盐缓冲液，ph11.5。pdms表面在生理和碱性ph下带负电荷。
图6a至6c显示了使用上述smt的3个不同实验的结果。通过跟踪在样品“v”通道1010中添加的荧光染料分子来观察离子耗尽/富集区。使用与尼康ccd摄像机整合的反相荧光显微镜(ti-u，尼康，东京，日本)获得流动运动和离子传输图像并且使用pmt记录荧光强度。使用dc电源通过连接到铂电极的接口向每个通道施加电位。
在这点上，smt包括样品通道610、分离通道620、废物通道630以及第一和第二接头。这些实验结果显示出，在图6a中，用荧光胺标记的带负电荷的牛血清白蛋白(分子量～66.5kda)浓缩在样品v-通道610的尖端处，但被排除在通过第一接头输送到分离通道620之外，因为它的大小超过可用的自由输送区。
荧光素，类似于目标分析物的小阴离子，从样品v-通道610电动输送到分离通道620中，然而如图6b所示，荧光素被捕获在分离通道620中。在这点上，当icp在第一接头开始发展时，注入塞或第二组分析物浓缩在与第一接头相对的分离通道620中，然后朝向第二接头转移位置。
为了可视化用于脱盐的小的无机阴离子的输送，将硫氰酸根离子从分离通道620通过第二接头电动输送到废物v-通道630中，由图6c中废物v-通道630中存在的酸性铁溶液形成红色络合物表明。虽然也期望电泳转运铁离子到硫氰酸盐储存器中，但是由于该通道610中的高ph，在样品v-通道610中没有观察到红色着色。
在这点上，荧光素的转运表明没有edl重叠。选择注入时间以尽可能多地注入，然后使用稍后发展的icp将注入塞锐化成电泳分离理想的窄带。耗尽区在接头的阳极侧的分离通道上缓慢扩张，并将注入塞推向第二接头。
在废物v-通道630和分离通道620之间的接头以0.5μa电流限制产生，以限制小的有机分子的输送，但允许输送小的无机离子来帮助脱盐样品，同时提供小分子浓缩的最佳eof。通过将分析物电泳迁移率与eof通过第二接头平衡来形成阱，因为hpmc未添加到废物v-通道630中，并且使用较低离子强度缓冲液用来填充通道630。废物v-通道630中较低的离子强度允许施加相对较高的电压，而不会有第二接头的平均孔径的二次击穿的风险和随后的变化。
这两个接头一起产生尺寸和迁移率阱(smt)，其中具有规定尺寸/迁移率范围的分子可以被萃取和浓缩，而较小的无机离子通过浓缩接头输送到废物中，使分离通道中的浓缩分析物区域脱盐。
发现基质离子强度和粘度影响输送离子的量，如图7a至7c所示，其显示出作为注射时间的函数的浓缩荧光素区的演变。在这点上，图7a显示随时间的基质离子强度(0、1、10和50mm磷酸盐缓冲液，ph11.5)。图7b显示使用不同浓度(0、1、3和0.5％)的羟丙基甲基纤维素(hpmc)改变的基质粘度。图7c涉及分离通道中背景电解质的离子强度(2、10和50mm磷酸盐缓冲液，ph11.5，含有0.25％hpmc的)。在所有实验中使用0.2ppm荧光素，使用第一分离通道电极1021，样品通道电极1010，第二分离通道电极1022和废物通道电极1030，施加的电压分别为-100、-500、-100和+300v。
当处理恒定基质(如血液)的样品时，基质离子强度和粘度对输送离子量的影响不是问题，然而可能需要内标准来从唾液或尿液进行定量测量。在这方面，随着样品的离子强度和粘度增加，离子输送迅速降低。为了避免片外样品预处理或稀释，优化分离通道620中的bge，从而注入足够的分析物。能斯脱-普朗克方程描述了通过通道的离子传输与电场梯度之间的关系。
其中d、z和c分别是扩散系数、渗透物质的电荷和浓度；
和veo(x)是电渗速度。
式(1)右手侧的三项分别表示扩散、电输送和电渗流的贡献。因此，当处理诸如血液的高离子强度样品时，在分离通道620中使用高离子强度的bge(100mm)增加来自样品v-通道610的离子通量。
接头之间的目标分析物的浓度是两种现象的组合。来自第二个浓缩接头的eof将分析物推回到第一个萃取接头，防止分析物区域穿过分离通道扩散。一段时间后，icp在第一个提取接头建立，形成耗尽区将分析物推向第二接头。这两个力导致窄带，对电泳分离是理想的。与使用挤压注入的常规十字形几何相比，使用smt的注入导致荧光素浓缩为100倍，并且如图8所示。
在这点上，图8显示出在相同条件下将smt710与挤压注入720相比较的电泳图。使用曙红和荧光素在水中的混合物(每个0.05ppm)，通过smt实现100倍的增强因子。分离通道中的背景电解质(bge)是具有0.5％hpmc的100mm磷酸盐缓冲液，ph11.5，并且在废物v-通道中是10mm磷酸盐缓冲液，ph11.5。用于smt的施加电压为-100、-300、-100和+500v，持续60秒，并且在第一分离通道电极1021、样品v-通道电极1010、第二分离通道电极1022和废物v通道电极1030处，用于分离的分别为-200、+100、+1500和+100v。对于挤压注入，所有通道用具有0.5％hpmc的100mm磷酸盐缓冲液(ph11.5)填充。在缓冲液、样品、缓冲废物和样品废水池中用于注射的施加电压分别为-60、-240、-100和+400v，并且分离电压与smt的相似。
smt用于分析掺有氨苄青霉素的血液样品，用荧光胺标记用于荧光检测。荧光胺以其质子化形式与伯胺反应以在数秒内产生荧光化合物，同时过量的反应物水解成非荧光产物。将装置制造并存储长达3个月。在使用之前即刻，通过介电击穿产生接头，并且装置填充有标记的样品和bge。
为了证明优化孔径的重要性，图9a和9b中的电泳图将使用由9μa的电流限制产生的过滤接头获得的结果与5μa的优化电流限制产生的结果进行比较。尽管较宽的孔径导致氨苄青霉素的输送增加，但它们的选择性较差，并且大的生物分子干扰了分析，阻止了定量。当在使用5μa的最佳电流限制的情况下用smt装置进行分析时，将荧光素标记的氨苄青霉素与其他荧光产品进行基线分离，从而进行定量。所提出的方法显示2.5-20μg/ml氨苄青霉素的线性范围，涵盖推荐的10μg/ml氨苄青霉素血液水平用于治疗新生儿败血症，这是新生儿死亡的主要原因之一。
在进一步的实施例中，在此所述任意实施例的装置和/或方法可以应用于作为目标分析物的dna。在一个实验中，在注入期间，施加到第一、第二、第三和第四电极的电压分别为-500伏、+200伏特、-100伏特和-100伏特，持续200秒。在分离期间，施加到第一、第二、第三和第四电极的电压分别为+60伏特、浮动、-60伏特和+1500伏特，持续200秒。分离通道包括100mm磷酸盐缓冲液，ph6.5和0.5％hpmc，并且废物通道包括10mm磷酸盐缓冲液，ph6.5。
观察到本实验中样品基质的变化影响分离通道中浓缩dna的荧光强度，其中强度根据dna浓度而变化。例如，样品通道中10mm磷酸盐缓冲液中的50nmdna探针导致分离通道中dna浓度高于当100mm磷酸盐缓冲液包括在样品通道中时的dna浓度。在进一步的实验实施例中，将血液直接施用于样品通道，并且在分离通道中dna的所得荧光与样品中使用100mm磷酸盐缓冲液的量相似。根据dna探针的浓度，包含血液中的短dna探针(基本上为20个碱基对)的样品显示分离通道中dna的所得浓度的变化。尤其是，使用500nm探针获得的实验结果以比50nm探针更高的强度发荧光，其又高于12.5nm探针。在涉及500nmdna探针的一些实验中，本发明提供了超过挤压注入的荧光的80倍改善，也被称为增强因子。
在另一个实施例中，在此所述的任意实施例的装置和/或方法可以应用于作为目标分析物的一种或多种蛋白质。在实验实施例中，制备单独的蛋白质溶液，其包括在50mmnahco3中的5mg/ml的胰岛素(5.8kda,pi＝5.3)，水中的10mg/ml的β-乳球蛋白(18.4kda,pi＝5.1)，水中的20mg/ml的卵清蛋白(44.3kda,pi＝4.54,4.9)，水中的20mg/ml的bsa(66.4kda,pi＝4.7,4.9)。在各个小瓶中，将20μl各种蛋白质溶液(40μl用于胰岛素)与120μl(60μl用于胰岛素)的100mmnahco3混合，然后用60μl(30μl用于胰岛素)的新鲜制备的荧光胺(3mg/ml在丙酮中)标记。将等体积的标记蛋白质和sds样品缓冲液混合，然后使用加热块加热至100℃6分钟。sds样品缓冲液包括100mmtris，2％sds，4％二硫赤藓糖醇(dtt)，用hcl调节ph至6.8。每个溶液用缓冲液稀释至所需浓度。缓冲液包括50mmtris-磷酸(ph8.3)，30mmsds，2.25％poptm。筛分矩阵，poptm，被添加到连接注入点到缓冲废物(bw)的分离通道中的缓冲液(1:3)中。样品废物(sw)v-通道填充有50mmtris-磷酸盐(ph8.3)。
在根据本文所述的任意一个实施方式的一些实施例中，可能需要至少部分地涂布所述装置，并且更典型地，需要至少部分地涂布样品通道。在这点上，涂层可以影响分离通道中所得目标分析物的浓度，其可以根据所得目标分析物的荧光强度实验性地观察。在一个实施例中，涂层包括二乙氧基(3-缩水甘油氧基丙基)甲基硅烷(dgpms)。在一个实验实施例中，当与未涂布的通道(其中两种情况下的击穿电压相同，即4μa)比较时，使用dgpms涂覆的样品通道实现分离通道(来自200μg/ml样品)中bsa的较高荧光强度。在上述蛋白质实施例中，在具有dgpms:丙酮(1:1)的涂层的分离通道中实现了较高的胰岛素、β-乳球蛋白、卵白蛋白和bsa的实验浓度(并且因此具有较高的荧光强度)。
因此，在单个步骤中显示出具有不同孔径的两个接头的组合以实现从全血样品中提取、浓缩和脱盐小的有机分子。所述方法用于分析抗生素氨苄青霉素，一种具有伯胺基团的可用于用荧光胺标记的药物化合物。通过使用击穿电流限制调节接头的孔径，可以针对其他分析物类别(包括生物标记、蛋白质或dna)优化类似的装置。接头的制造是快速、简单的，并且提供足够的孔径控制，而不增加制造成本，使其适合于一次性装置。此外，电动装置不依赖于泵或阀，使操作简单。
因此，上述用于从含有多个分析物的流体样品中至少部分地提取和浓缩目标分析物的装置和方法的实施例可以根据目的目标分析物进行调整，提供简单和及时的结果，可以容易地制造等。
此外，所述装置的提取、浓缩和纯化目标分析物的能力取决于如孔径和材料的物理特性的组合，以及所使用的电解质溶液，并且因此特定的装置和溶液组合可以用于靶向特定的分析物。因此，这允许生产便宜的装置，其可以精确和可靠地测量具体的目标分析物，使其适合用作点护理装置。
除非上下文另有要求，否则在整个本说明书和权利要求书中，词语“包含”和变体(如“包括”或“含有”)将被理解为暗示包含所述整数或整数组或步骤，但不排除任意其他整数或整数组。
本领域技术人员将理解的是，许多变化和修改将变得显而易见。应当认为对于本领域技术人员显而易见的所有这些变化和修改都落入在描述之前广泛出现的本发明的精神和范围内。因此，例如，应当理解的是，在适当的情况下，可以互换地使用来自上述不同实施例的特征。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！