一种自组装三层膜电极及其制备方法和用途与流程

本发明属于电化学技术领域，具体涉及一种自组装三层膜电极及其制备方法和用途，更具体地，涉及一种自组装hrp/l-asp/l-cys/cu膜电极及其制备方法和用途。

背景技术：

自组装单分子膜(self-assembledmonolayers，sams)的形成是近20年来发展起来的一种新型有机超薄膜技术。单分子膜的生成是一个自发的过程，将金属或金属氧化物浸入含活性分子的稀溶液中，活性分子通过化学键自发吸附在异相界面上而形成的有序分子组装体系，早在1946年zisman等就报道了表面活性物质在洁净金属表面上吸附而形成单分子膜的现象，sams制备方法简单且具有高的稳定性。

辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp，ec1.11.1.7)是一种含铁卟啉作为强键合辅基的分子量约为44000的糖蛋白，其上有2个底物结合位点。室温下很稳定，且容易得到，价格便宜，是商品化较早、应用较为广泛的一种酶制剂。可用于废水中胺的去除、芳香族聚合物的合成和芳香族化合物的手性氧化，因此对其进行固定化研究有较为广阔的应用前景。但由于hrp的氧化还原活性中心深埋在酶分子内，其与电极表面间的距离超过了电子能以足够快的速率进行转移的距离，在通常情况下，难以在电极间进行直接电子转移，因而获得hrp直接电子转移反应良好伏安峰形的报道较少。hrp修饰电极制作的关键是如何把酶电极固定化形成感应膜。目前研究最多的是金电极，银电极，玻碳电极，铂电极，而对铜电极却研究很少。金属铜是一种地壳含量相对较丰富，相对较便宜的金属，而且工业上应用广泛，因此研究铜的自组装膜对研究第三代生物传感器具有重要价值和实际意义。

l-半胱氨酸(l-cys)是20种天然氨基酸中唯一具有巯基(-sh)基团的化合物，利用其特殊的生物兼容性和化学活性，能够组装到铜电极表面。因而对l-cys在铜电极表面的吸附和电化学特性研究具有特别重要的意义。

目前已经有将含有-sh基的l-半胱氨酸作为连接层，利用分子间相互作用进一步连接hrp制得的cu/l-cys/hrp自组装双层膜，并且利用该双层膜电极电催化苯二酚，结果表明对苯二酚在上述双层膜中有电催化行为。

胺类物质由于具有毒性和难于降解而严重污染环境。邻苯二胺(o-phenylenediamineopd)是一种重要的有机化工原料，广泛地应用于农药及染料工业中。每生产1吨邻苯二胺约排放4～5吨高浓度的邻苯二胺废水，以此推算，全国每年约排放该种废水达50万吨左右，这对我国的生态环境及人民身体健康构成了严重威胁。邻苯二胺废水是多组分水体，其中许多物质，如邻苯二胺、邻硝基苯胺、邻硝基氯苯等物质都属有毒和致癌物质。为了保护水资源和生态环境，对该废水进行净化处理十分重要。

目前采用溶液中酶催化法来进行水中邻苯二胺的去除已有文献报道，但存在去除效率较低，不易分离等问题。

由于邻苯二胺具有电化学活性，容易被氧化，因此能用电化学方法去除，而且，固定化酶的方法使得污染物很容易从溶液中分离，能够达到深度去除。

hrp直接吸附铜表面上会导致酶的变性而失去活性，我们考虑在铜和hrp之间加入氨基酸层，以保持hrp的结构和生物活性。双层膜电极hrp/l-cys/cu对邻苯二胺略有去除作用，但是去除效果不理想。因此，需要一种新的去除邻苯二胺的方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺陷，本发明的发明人设想进一步构建生物分子三层膜。在l-cys/cu上试验了丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸等多种氨基酸，均没有达成目标。最终意外地发现l-天冬氨酸(l-asp)可以实现三层膜的组装，因此，构建了hrp/l-asp/l-cys/cu电极。本发明的发明人还意外地发现，邻苯二胺在构建的上述三层膜上有显著的电催化行为，其电催化行为远优于现有的其他自组装膜电极。

l-天冬氨酸(l-asp)，又称天门冬氨酸，化学名称为l-(+)-氨基丁二酸，分子式为c4h7no4，分子量为133.10，等电点为2.77。本品为白色结晶或白色结晶性粉末，味微酸，在热水中溶解，在水中微溶，在乙醇中不溶，在稀盐酸及氢氧化钠溶液中易溶。它的分子式如下所示：

因此，本发明的一个目的是提供一种自组装三层膜电极。本发明的另一个目的是提供上述自组装三层膜电极的制备方法。本发明的又一个目的是提供上述自组装三层膜电极的用途。

本发明的上述目的是采用如下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种自组装三层膜电极(辣根过氧化物酶/l-天冬氨酸/l-半胱氨酸/cu，hrp/l-asp/l-cys/cu)，该电极以铜电极为基底，依次覆盖有l-半胱氨酸层(l-cys)、l-天冬氨酸层(l-asp)、辣根过氧化物酶层(hrp)。

另一方面，本发明提供一种上述自组装三层膜电极的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)铜电极的预处理

将铜电极打磨至光亮后，以去离子水清洗，在酸中浸泡，再依次用无水乙醇和去离子水清洗，得到预处理后的铜电极；

(2)l-半胱氨酸自组装膜电极(l-cys/cu)的制备

将步骤(1)制备得到的预处理后的铜电极放入1ⅹ10^-3-1ⅹ10^-6mol/l，ph为5-11的l-半胱氨酸水溶液中浸泡0.5-24小时，即得l-半胱氨酸自组装膜电极；

(3)l-天冬氨酸/l-半胱氨酸自组装膜电极(l-asp/l-cys/cu)的制备

将步骤(2)制备得到的l-半胱氨酸自组装膜电极，清洗，晾干，放入1ⅹ10^-3mol/l-1ⅹ10^-6mol/l，ph为4.0-7.0的l-天冬氨酸水溶液中浸泡1-24小时，即得l-天冬氨酸/l-半胱氨酸自组装膜电极；

(4)辣根过氧化物酶/l-天冬氨酸/l-半胱氨酸自组装膜电极(hrp/l-asp/l-cys/cu)的制备

将步骤(3)制备得到的l-天冬氨酸/l-半胱氨酸自组装膜电极，放入0.1mg/l-1.0mg/l，ph值为5-10的辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液(pbs缓冲溶液)中浸泡2-10小时，即得辣根过氧化物酶/l-天冬氨酸/l-半胱氨酸自组装膜电极。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(1)中，所述酸为无机酸，选自盐酸、硫酸、硝酸、高氯酸，优选为硝酸。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(1)中，在所述酸中浸泡的时间为5秒-30秒，优选为10秒。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(2)中，所述l-半胱氨酸水溶液的浓度为1×10^-3mol/l。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(2)中，在所述l-半胱氨酸水溶液中浸泡的时间为2-3小时。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(2)中，所述l-半胱氨酸水溶液的ph值为7。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(3)中，所述l-天冬氨酸水溶液的浓度为1×10^-5mol/l。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(3)中，在所述l-天冬氨酸水溶液中浸泡的时间为1-3小时。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(3)中，所述l-天冬氨酸水溶液的ph值为7。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(4)中，所述辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.6mg/l。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(4)中，所述辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液的ph值为7。

优选地，在上述制备方法中，在步骤(4)中，在所述辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液中浸泡的时间为3小时。

又一方面，本发明提供一种上述自组装三层膜在邻苯二胺降解中的应用。

优选地，应用时，使用ph为7的pbs缓冲溶液作为底液。

与现有技术相比较，本发明具有以下优异的技术效果。

本发明的自组装膜致密性好，还原氧化的可逆性良好，并且制得的hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极对邻苯二胺有显著的电催化作用。

附图说明

图1为不同浓度的l-天冬氨酸对hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极的电化学行为的影响，其中a的浓度(c)为1×10^-6mol/l，b的浓度为1×10^-5mol/l，c的浓度为1×10^-4mol/l，d的浓度为1×10^-3mol/l，e的浓度为1×10^-2mol/l；

图2为不同ph的l-天冬氨酸水溶液对hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极的电化学行为的影响，其中a为ph＝5.0，b为ph＝6.0，c为ph＝7.0，d为ph＝8.5，e为ph＝10.5；

图3为不同组装时间对hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极的电化学行为的影响，其中，a为10小时，b为3小时，c为2小时，d为1小时；

图4为不同自组装膜在ph＝7.00的pbs缓冲溶液中的电化学表征，其中，a为hrp/l-asp/l-cys/cu，b为hrp/cu，c为l-cys/cu，d为裸铜(裸cu，barecu)；

图5为hrp/l-asp/l-cys/cu膜电极在邻苯二胺溶液及ph＝7.00的pbs缓冲溶液中的循环伏安(cv)曲线，其中a为在邻苯二胺溶液中的曲线，b为在ph＝7.00的pbs缓冲溶液中的曲线；

图6为hrp/l-cys/cu膜电极在不同浓度的邻苯二胺溶液及ph＝7.00的pbs缓冲溶液中的循环伏安(cv)曲线，其中a为在5×10^-5mol/l邻苯二胺溶液中的曲线，b为在5×10^-4mol/l邻苯二胺溶液中的曲线，c为在5×10^-3mol/l邻苯二胺溶液中的曲线，d为在5×10^-2mol/l邻苯二胺溶液中的曲线，e为在ph＝7.00的pbs缓冲溶液中的曲线；

图7为裸铜电极(cu)和hrp/ala/l-cys/cu、hrp/val/l-cys/cu、hrp/leu/l-cys/cu、hrp/gly/l-cys/cu的循环伏安图，其中a为裸铜，b为hrp/ala/l-cys/cu，c为hrp/val/l-cys/cu，d为hrp/leu/l-cys/cu，e为hrp/gly/l-cys/cu。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

以下实施例使用的试剂及电化学仪器如下：

1、试剂

k2hpo4(分析纯，上海化学试剂总厂所属上海试剂二厂)，kh2po4(分析纯，天津市光复科技发展有限公司)；l-半胱氨酸(纯度≥98.5﹪，北京奥博生物技术有限责任公司；l-天冬氨酸(纯度≥10.4，上海蓝季科技发展有限公司)；邻苯二胺(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；辣根过氧化物酶(hrp)等电点为7.2(rz>3)；无水乙醇；实验用水均为三次去离子水；其他试剂均为分析纯。

2、仪器

电化学工作站(chi660b，上海辰华仪器有限公司)；三电极体系：cu电极(铜电极用纯度为99％紫铜棒制成，环氧树脂密封，砂纸打磨之光亮)为工作电极，饱和甘汞电极(sce)为参比电极，铂电极为对电极；电子天平；ph酸度计；水砂纸(500^#、2000^#号)。

3、测试方法

上海辰华仪器有限公司的chi660b电化学工作站，三电极系统：cu电极为工作电极，用99.9％纯铜棒制成，环氧树脂密封，饱和甘汞电极(sce)为参比电极，铂片为对比电极。所有电化学测试均在三室电解池中进行。在0.4～-0.4v之间，以0.01v/s的扫描速率，在pbs缓冲溶液中进行循环伏安曲线测试。

实施例1l-cys/cu自组装膜修饰铜电极的制备

将铜电极依次500^#、2000^#水砂纸上打磨之光亮，以去离子水清洗，在6mol/lhno3溶液中浸泡10秒，再依次尽可能快地在无水乙醇和去离子水中浸洗2次，立即将电极放入1×10^-3mol/ll-cys溶液中自组装一定时间(3h)，即制得l-cys/cu自组装膜修饰铜电极。

实施例2hrp/cu自组装膜电极的制备

将铜电极依次500^#、2000^#水砂纸上打磨之光亮，以去离子水清洗，在6mol/lhno3溶液中浸泡10秒，再依次尽可能快地在无水乙醇和去离子水中浸洗2次，立即将预处理后的铜电极放入0.6mg/l辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液中浸泡3小时即得辣根过氧化物酶自组装膜电极。

实施例3hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜修饰铜电极的制备

用水砂纸将铜电极打磨好，以去离子水清洗，在6mol/lhno3溶液中浸泡10秒，再依次尽可能快地在无水乙醇和去离子水中浸洗2次，立即将电极放入1×10^-3mol/l，ph为7的l-cys溶液中自组装3h，再将自组装膜修饰铜电极取出，用水洗净，晾干，放入1×10^-5mol/l，ph为7的l-asp溶液中自组装3h，然后放入0.6mg/l、ph＝7.0的hrp的pbs缓冲溶液中自组装3h，即制得hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜修饰铜电极。

实施例4hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜修饰铜电极的制备

用水砂纸将铜电极打磨好，以去离子水清洗，在6mol/lhno3溶液中浸泡10秒，再依次尽可能快地在无水乙醇和去离子水中浸洗2次，立即将电极放入1×10^-6mol/l，ph为11的l-cys溶液中自组装24h，再将自组装膜修饰铜电极取出，用水洗净，晾干，放入1×10^-6mol/l，ph为7的l-asp溶液中自组装24h，然后放入1.0mg/l、ph＝10的hrp的pbs缓冲溶液溶液中自组装10h，即制得hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜修饰铜电极。

实施例5hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜修饰铜电极的制备

用水砂纸将铜电极打磨好，以去离子水清洗，在6mol/lhno3溶液中浸泡10秒，再依次尽可能快地在无水乙醇和去离子水中浸洗2次，立即将电极放入1×10^-3mol/l，ph为5的l-cys溶液中自组装0.5h，再将自组装膜修饰铜电极取出，用水洗净，晾干，放入1×10^-3mol/l，ph为4的l-asp溶液中自组装1h，然后放入0.1mg/l、ph＝5的hrp的pbs缓冲溶液中自组装2h，即制得hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜修饰铜电极。

实施例6不同浓度的l-天冬氨酸对hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极的电化学行为的影响

根据实施例3的制备方法制备本发明的hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极，其中采用了不同浓度的l-天冬氨酸溶液，其余条件与实施例3相同。l-天冬氨酸溶液的浓度分别为1×10^-2mol/l，1×10^-3mol/l，1×10^-4mol/l，1×10^-5mol/l，1×10^-6mol/l。其循环伏安图(cv)见图1所示。

由图1可知，l-asp水溶液的浓度太大，如浓度为1×10^-2mol/l时，曲线氧化电流和还原电流都较大，说明不能形成致密的三层膜，当l-asp水溶液的浓度降低到1×10^-3-1×10^-5mol/l时，氧化电流与还原电流都明显降低，说明该浓度下hrp分子大量的吸附于双层膜上，增大了电子在电极与溶液之间的传质阻力，而且氧化还原的可逆性明显变好；继续降低l-asp水溶液的浓度为1×10^-6mol/l，峰电流虽然略有增大，但与1×10^-2mol/l的峰电流相比，仍然很小。因此1×10^-3-1×10^-6mol/l为构建三层自组装膜的合适的l-asp浓度范围。当l-asp水溶液的浓度为1×10^-5mol/l时，峰电流最低，因此，该浓度是最佳浓度。

实施例7不同ph值的l-天冬氨酸水溶液对hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极的电化学行为的影响

根据实施例3的制备方法制备本发明的hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极，其中采用了不同ph值的l-天冬氨酸溶液，其余条件与实施例3相同。l-天冬氨酸溶液的ph值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.5、10.5。其循环伏安图(cv)见图2所示。由于ph＝4和5的峰形相似，所以图中只展示ph＝5的cv曲线。

由图2可知，ph值对hrp/l-asp/l-cys/cu电极的电化学行为有影响，在ph＝4-7范围内表现为一种电化学行为，当ph值大于8.5时，表现为另一种电化学行为。本发明选择ph范围为4-7。ph值为7时为中间值，且与hrp的等电点接近，因此，优选ph值为7。

实施例8不同组装时间对hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极的电化学行为的影响

根据实施例3的制备方法制备本发明的hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极，其中在hrp的pbs缓冲溶液中采用了不同的自组装的时间，其余条件与实施例3相同。自组装时间分别为10小时、3小时、2小时和1小时。其循环伏安图(cv)见图3所示。

如图3所示，修饰时间为1h时，因时间太短，电极表面吸附的hrp量未达到饱和，电极不稳定。当组装膜时间为2h时，hrp/l-asp/l-cys/cu膜电极表面形成了一层较致密的薄膜，降低了电极表面和缓冲液间的电子转移速率，且随时间增加膜覆盖度增大。当组装时间为3h时，峰电流最低。但当组装时间超过3h时，峰电流随组装时间的进一步延长下降不明显。因此3h为最佳组装时间，组装膜的致密度达到最佳。合适的时间可以为2-10小时。

实施例9不同自组装膜在pbs＝7.00的缓冲溶液中的电化学表征

将自组装膜电极hrp/cu(由实施例2制备而来)，l-cys/cu(由实施例1制备而来)，hrp/l-asp/l-cys/cu(由实施例3制备而来)分别置于ph＝7.00的pbs缓冲溶液中，测其循环伏安(cv)曲线。结果见图4。

图4中cv曲线表明，hrp/cu、l-cys/cu、hrp/l-asp/l-cys/cu膜电极分别在ph＝7.0的pbs缓冲溶液中，于电位-0.4～0.4v间扫描有氧化还原峰。与相同条件下用裸铜(barecu)电极扫描相比，hrp/cu膜电极cv曲线还原电流增加，氧化电流有所增加，说明hrp在铜电极表面不能形成致密的单分子层薄膜。l-cys/cu膜电极cv曲线电流明显降低，这是因为l-半胱氨酸(l-cys)在铜电极表面形成了单分子层,降低了电极表面和缓冲溶液间的电子转移速率。hrp/l-cys/l-asp/cu膜电极cv曲线电流更加明显降低，说明通过层层自组装进一步加大了薄膜的厚度，从而加大了电子在溶液和电极表面之间的传质阻力，因而使峰电流进一步减小。

实施例10hrp/l-cys/cu膜电极和hrp/l-asp/l-cys/cu膜电极在邻苯二胺降解中的应用

将制好的hrp/l-asp/l-cys/cu膜电极(由实施例3制备而成)在ph＝7.00、浓度为1×10^-3mol/l的邻苯二胺溶液及ph＝7.00的pbs缓冲溶液中测其循环伏安(cv)曲线。结果见图5。

从图5可知，当向pbs缓冲溶液中加入邻苯二胺溶液后，hrp催化邻苯二胺溶液的氧化还原电流明显增大，说明hrp/l-asp/l-cys/cu自组装膜电极对邻苯二胺有显著的电催化作用。

用水砂纸将铜电极打磨好，以去离子水清洗，在6mol/lhno3溶液中浸泡10秒，再依次尽可能快地在无水乙醇和去离子水中浸洗2次，立即将电极放入1×10^-3mol/l，ph为7的l-cys溶液中自组装3h，然后迅速取出将该电极置于15mg/l，ph＝7.0的辣根过氧化物酶的pbs缓冲溶液溶液中自组装3h，取出后迅速以去离子水洗涤，即制得hrp/l-cys/cu自组装膜修饰铜电极。

将以上制好的hrp/l-cys/cu膜电极在ph＝7.00、浓度分别为5×10^-5mol/l、5×10^-4mol/l、5×10^-3mol/l、5×10^-2mol/l的邻苯二胺溶液及ph＝7.00的pbs缓冲溶液中测其循环伏安(cv)曲线。结果见图6。

从图6可知，hrp/l-cys/cu对邻苯二胺略有电催化作用(其氧化峰单位为μa)。而hrp/l-asp/l-cys/cu的氧化峰(其氧化峰单位为ma)增加了1000倍，所以说电催化作用显著。而且，制备双层膜hrp/l-cys/cu所需的hrp浓度为15mg/l，而制备三层膜所需的hrp浓度仅为0.6mg/l。这说明本发明的三层膜与hrp/l-asp/cu双层膜电极相比较，效果异常优越。

实施例11采用不同的氨基酸自组装形成的膜电极

为了构建生物分子三层膜。发明人在l-cys/cu上试验了丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、甘氨酸(gly)。其制备方法与实施例3相同，区别仅在于使用的氨基酸种类不同。形成的循环伏安图如图7所示。

从图7可以看出，使用丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)和甘氨酸(gly)的氧化还原峰电流没有明显下降，说明没有构成致密的自组装三层膜。而使用l-天冬氨酸(l-asp)的氧化还原峰电流明显下降(见图4)，说明可以构成致密的自组装三层膜。

上述实施例用于解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。