本发明涉及酶传感器的制备技术领域，具体涉及一种基于过氧化氢酶固定在磷酸钙微球上结合流动注射对2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d）检测的抑制传感器。
背景技术：
2,4-d（2,4-二氯苯氧乙酸）是一种主要的除草剂，曾作为用于研究 微生物降解氯化芳香化合物的模型化合物，也是一种人工合成的植物激素，具有与 生长素（IAA）相似的生理效应。2,4-二氯苯氧乙酸类除草剂，可用作植物生长调节，是用于诱导愈伤组织形成的常用的生长素类似物的一种。但是，如过多地使用2,4-d，由于其吸附性强，残留微量药剂会造成一定的危害，为了确定食品的安全性，人们通常对植物中的2,4-d含量进行检测分析。
目前，检测2,4-d的方法主要有气相色谱、高效液相色谱、气质联用，这些方法具有复杂的样品前处理、昂贵的仪器、有毒的溶剂、以及需要经过专门培训的人才能操作等缺陷。
技术实现要素：
本发明目的是提出一种可用于方便检测2,4-d的的抑制传感器。
本发明包括以下步骤：
1）超声条件下，将磷酸钙微球分散于壳聚糖中，取得磷酸钙的壳聚糖溶液；
2）以去离子水溶解过氧化氢酶，取得酶溶剂；
3）将磷酸钙的壳聚糖溶液与酶溶剂混合，静置反应24±5小时，取得过氧化氢酶和磷酸钙微球复合材料；
4）将过氧化氢酶和磷酸钙微球复合材料滴涂于洁净的玻碳电极表面，于4℃冻干。
抑制传感器由于仪器相对实惠、样品不要复杂的前处理、操作简单等特点，受到越来越多的关注，研究(L.M.C. D. J. WORT, the effect of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid On phosphorylase, phosphatase, a.mylase, Catalase, and peroxidase activity In wheat, Plant Physiol, 28(1953) 135-9）表明，2,4-d对小麦中的过氧化氢酶具有抑制作用，因此将过氧化氢酶固定在磷酸钙微球上结合流动注射根据2,4-d对过氧化氢酶的抑制作用进行2,4-d的检测具有非常重要的意义。
进一步地，本发明所述磷酸钙微球和过氧化氢酶的混合质量比为0.5～1∶1。使抑制率达到最大，比例太低，即磷酸钙微球太少，则固定的过氧化氢酶就少，进而抑制率低，而比例太大，即磷酸钙微球太多，则阻碍了电子传递，抑制率也降低。
所述磷酸钙的壳聚糖溶液中磷酸钙的浓度为5mg/mL，使磷酸钙较好的分散于壳聚糖中。
所述酶溶剂中过氧化氢酶的浓度为8 mg/mL。此时，酶活力最大，浓度太低时，酶活力也低．浓度过大时，酶分子活性部位被掩盖，酶活力下降，而且加酶量过大也会出现包埋不稳定，酶容易泄露，导致酶活力下降．即最佳加酶量为8 mg/mL。
此外，本发明还提出了以上传感器应用于对2,4-二氯苯氧乙酸浓度的检测。
检测方法包括以下步骤：
1）将所述传感器固定于流动电化学池中；
2）将磷酸缓冲溶液以3 mL/min的速度注入流动电化学池中，采用电流-时间曲线方法检测，直到电流与时间关系曲线中电流基线走平；
3）将磷酸缓冲溶液和过氧化氢组成的混合溶液以3 mL/min的速度注入上述流动电化学池中直到峰电流稳定后，将磷酸缓冲溶液以3 mL/min的速度注入上述流动电化学池中，直到电流与时间关系曲线中基线再次走平，取得初始峰电流；
4）将磷酸缓冲溶液、过氧化氢和多组已知2,4-d 浓度的试样组成的混合溶液以3 mL/min的速度依次注入上述电化学池中直到峰电流稳定后，再将磷酸缓冲溶液以3 mL/min的速度注入上述流动电化学池中，直到电流与时间关系曲线中基线再次走平，分别取得加入已知2,4-d 浓度的试样后的峰电流I；
5）依据公式计算各已知2,4-d 浓度的试样的抑制率：
；
6）制作抑制率和2,4-d浓度的线性关系图；
7）先将磷酸缓冲溶液、过氧化氢和待测试样组成的混合溶液以3 mL/min的速度注入电化学池中直到电流-时间曲线方法检测中峰电流稳定后，再将磷酸缓冲溶液以3 mL/min的速度注入流动电化学池中，直到电流与时间关系曲线中电流基线走平，测试取得待测试样的峰电流Ix和待测试样的抑制率Inhx；由抑制率和2,4-d浓度的线性关系图查找取得待测试样的2,4-d 浓度值。
当通入过氧化氢和磷酸缓冲溶液的混合溶液时出现一个峰电流，加入2,4-d后，2,4-d能抑制过氧化氢酶的活性，使峰电流减小，随着2,4-d含量的增加抑制率逐渐增大，利用抑制率和2,4-d溶度的线性关系，可实现对2,4-d的检测。
本发明以磷酸钙微球作为载体，将过氧化氢酶吸附到磷酸钙微球上，壳聚糖包裹吸附了过氧化氢酶的磷酸钙微球，防止其从电极的表面脱落。
本发明具有以下优点：
1、本发明使用了过氧化氢酶，利用其高效催化过氧化氢的性质，另一方面磷酸钙微球具有高的比表面积，能够作为界面上的固定载体，固定更多的过氧化氢酶，从而构造更高效的传感器界面，此外，磷酸钙微球具有生物相容性好，原料易得，成本低廉等特点
2、本发明使用流动注射系统使得检测更加简便快捷。
另外，本发明电流-时间曲线方法检测时，电压值设置为-0.35V。该设置时，过氧化氢酶的活性最大。
附图说明
图1为采用本发明传感器制作的抑制率和2,4-d浓度的线性关系图。
具体实施方式
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
一、传感器制备步骤：
1、取10.0 mg磷酸钙微球分散于2 mL 0.5wt%壳聚糖中，超声至完全分散，取得5mg/mL磷酸钙的壳聚糖溶液。
2、取16.0 mg过氧化氢酶溶解于 2 mL去离子水中，取得过氧化氢酶的浓度为8 mg/mL的酶溶剂。
3、取50 μL磷酸钙的壳聚糖溶液和50 μL酶溶剂混合，静置反应24±5小时，取得过氧化氢酶和磷酸钙微球复合材料。
4、将5 μL过氧化氢酶和磷酸钙微球复合材料滴涂于洁净的玻碳电极上，于4℃冻干，即得传感器。
二、制作抑制率和2,4-d浓度的线性关系图：
1、传感器固定于流动电化学池中。
以下方法采用连续操作方法，连续地将不同溶液加入同一个流动电化学池中进行电流-时间曲线方法检测。
2、将磷酸缓冲溶液以3 mL/min的速度注入流动电化学池中，直到电流与时间关系曲线中电流基线走平。
3、以体积比为200∶1的比例，将磷酸缓冲溶液和过氧化氢组成混合溶液，并以3mL/min的速度注入流动电化学池直到峰电流稳定后，再改用磷酸缓冲溶液以3 mL/min的速度注入流动电化学池中，直到电流与时间关系曲线中基线再次走平，产生的化学信号初始峰电流值由电化学工作站检测并由电脑显示。
4、以体积比为1000 ∶5∶1000的比例，将磷酸缓冲溶液、过氧化氢和浓度分别为0.03、0.06、0.09、0.12、0.24、0.3、0.9、1.5、2.1、3μmol.L-1的2,4-d 试样分别组成不同的十组混合溶液。
将第一组混合溶液以3 mL/min的速度注入电化学池中直到峰电流稳定后，再改用磷酸缓冲溶液以3 mL/min的速度注入流动电化学池中，直到电流与时间关系曲线中基线再次走平，产生的化学信号反应的第一组混合溶液中2,4-d 浓度为0.03μmol.L-1的试样的峰电流I值由电化学工作站检测并由电脑显示。
将第二组混合溶液以3 mL/min的速度注入电化学池中直到峰电流稳定后，再改用磷酸缓冲溶液以3 mL/min的速度注入流动电化学池中，直到电流与时间关系曲线中基线再次走平，产生的化学信号反应的第二组混合溶液中2,4-d 浓度为0.06μmol.L-1的试样的峰电流I值由电化学工作站检测并由电脑显示。
依此方法，分别取得第三至第十组混合溶液中2,4-d 浓度分别为0.09、0.12、0.24、0.3、0.9、1.5、2.1、3μmol.L-1的试样的峰电流I值。
5、依据公式计算出各组混合溶液中已知2,4-d 浓度的试样的抑制率：
。
6、制作抑制率和2,4-d浓度的线性关系图，如图1所示。
三、试样检测：
为了考察该方法的实际可靠性，进行了豆芽菜样品的检测，由于豆芽菜中经检测不含2,4-d，因此，试验中采用加标回收的方法进行检测。
采用以上方法，在豆芽菜中分别添加0.30μM/mL、0.90μM/mL和1.60μM/mL的2,4-d，按本发明方法进行检测，分别取得待测试样的峰电流Ix和待测试样的抑制率Inhx；由抑制率和2,4-d浓度的线性关系图查找取得待测试样的2,4-d 浓度值，三个样品的2,4-d浓度检测值分别为0.31μM/mL、0.88μM/mL和1.63μM/mL，结果如下表所示：
由上表可见：采用本发明传感器，可以方便、准确地测定2,4-d浓度。本发明可克服传统检测2,4-d的仪器价格昂贵，且需要复杂的样品前处理等缺点，大大降低了检测费用，更加简便快捷。