一株降解除草剂2,4-二氯苯氧乙酸的菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及“一株降解除草剂2,4-二氯苯氧乙酸的菌株及其应用”，属于环境工程和微生物工程【技术领域】。一株降解除草剂2,4-二氯苯氧乙酸的菌株（Cupriavidus?campinensis），命名为BJ71，保藏编号为CCTCC?M2014006。该菌株具有以2,4-二氯苯氧乙酸为唯一碳源和能源进行生长的能力，能够显著降低所在环境中2,4-二氯苯氧乙酸的浓度。实验证明该菌株21天对2,4-二氯苯氧乙酸的降解率达成92%以上，表明该菌株可以应用于被2,4-二氯苯氧乙酸污染土壤的生物修复。
【专利说明】—株降解除草剂2, 4- 二氯苯氧乙酸的菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境工程和微生物工程【技术领域】，尤其涉及一株降解除草剂2，4-二氯苯氧乙酸的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用。
【背景技术】
[0002]2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4-D)是一种活性极强的植物生长调节剂，低浓度时可促进植物生长、诱导愈伤组织形成；但高浓度时作为一种苯氧羧酸类除草剂，被广泛用于禾谷类作物(尤其是麦田和玉米田)、牧草及草坪草中阔叶杂草的防除。自20世纪40年代工业化生产以来已被广泛应用了 70年，我国农药市场先后有近百个除草剂产品，使用面积前20位的产品占到全国农田化学除草总面积75%左右，2，4- 二氯苯氧乙酸即为我国农药市场的主流品种之一，近年来我国对2，4- 二氯苯氧乙酸的年均需求量在5000吨以上。但是，2，4- 二氯苯氧乙酸大量使用会危害人类健康，其具有致癌性及神经毒性，WHO已经将其定为II级毒性的激素除草剂。该除草剂喷施进入土壤后，尽管半衰期相对较短，长期应用已经造成土壤及地下水的污染，修复除草剂2，4- 二氯苯氧乙酸污染土壤迫在眉睫。
[0003]微生物降解是2，4- 二氯苯氧乙酸在环境中的主要代谢途径。对于2，4- 二氯苯氧乙酸污染，国内外进行了大量降解微生物的筛选工作。到目前为止，已经分离出多个具有降解2，4-二氯苯氧乙酸能力的菌株，这些菌株主要存在于生长较快的β-和Y _型变形菌门中，如无色杆菌属(Achromobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、代尔夫特菌属(Delftia)、盐单胞菌属(Halomonas)、假 单胞菌属(Pseudomonas)、红育菌属(Rhodoferax)、多卩遼菌属(Variovorax)等。如专利“一种2，4_ 二氯苯氧乙酸丁酯农药残留降解菌及其生产的菌剂”(CN101402927B)分离了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.) Ldl,可使土壤中2，4-二氯苯氧乙酸丁酯的残留量降低70%以上,但目前还未有Cupriavidus campinensis降解2，4-二氯苯氧乙酸的专利报道。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术中2，4-二氯苯氧乙酸降解能力不足之处，提供一种降解2，4- 二氯苯氧乙酸的细菌菌株，该菌株21天对2，4- 二氯苯氧乙酸的降解率达成92%以上，实验表明该菌株可以应用于2，4- 二氯苯氧乙酸污染土壤的生物修复。
[0005]一株降解除草剂2，4-二氯苯氧乙酸的菌株Cupriavidus campinensis,命名为BJ71，保藏编号为 CCTCC M2014006。
[0006]上述菌株在被2，4- 二氯苯氧乙酸污染的土壤进行修复中的应用。
[0007]所述应用为将活化的Cupriavidus campinensis BJ71菌悬液加入到被2，4_ 二氯苯氧乙酸污染的土壤中，混合均匀，土壤上表面覆上黑膜遮盖，保持土壤温度25-30度。
[0008]所述BJ71菌的终浓度为1.0-9.0 X 107CFU/g 土壤，加水使土壤含水率保持在最大持水量的40-75%。
[0009]所述活化的(Cupriavidus campinensis) BJ71菌悬液制备方法为:从平板上选取一环菌落接入含有500mg/L2，4- 二氯苯氧乙酸的LB液体培养基中，摇瓶装液量为体积的40%、150rpm转速、30°C条件下过夜活化；吸取500 μ I活化的菌液，转接入相同成分的新鲜LB液体培养基中，相同条件下培养至OD6tltl为0.6左右；5000g离心5min收集菌体，用0.85%的生理盐水清洗两次后，悬浮于生理盐水中。
[0010]本申请从北京市顺义区木林镇施用除草剂2，4- 二氯苯氧乙酸多年的麦田土壤中米集距地表下5~29cm处表层土壤样本,加入到含有2，4- 二氯苯氧乙酸的MSM液体培养基中进行富集培养，然后将培养液稀释后涂布在含2，4- 二氯苯氧乙酸的MSM固体培养基上30°C恒温培养；将在含2，4- 二氯苯氧乙酸为唯一碳源的选择性培养基上长出的单菌落活化后分别接种于含有2，4- 二氯苯氧乙酸的MSM液体培养基中，30°C黑暗培养，最终筛选到培养2d时可降解2，4- 二氯苯氧乙酸约85%总量的BJ71菌株。菌株保存于含500mg/L2，4-二氯苯氧乙酸的LB培养基中。该菌于2014年I月6日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCCM2014006。
[0011]上述的菌株形态鉴定:该菌株为短杆菌，革兰氏染色阴性，无芽孢。在LB固体平板上生长菌落为圆形，淡黄色，微隆起，边缘整齐，湿润，光滑。生理生化鉴定:氧化酶、过氧化氢酶阳性；脲酶阳性；不发酵葡萄糖；硝酸盐还原阳性；不还原亚硝酸盐；反硝化作用阴性；酸性磷酸酶、碱性磷酸酶阳性。该菌株16SrDNA序列全长1390bp，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0012]结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性和分子鉴定结果，鉴定除草剂2，4-二氯苯氧乙酸降解菌株BJ71属于Cupriavidus campinensis。该菌株具有以2，4-二氯苯氧乙酸为唯一碳源和能源进行生长的能力，能够显著降低所在环境中2，4- 二氯苯氧乙酸的浓度。因此可以用于被2，4-二氯苯氧乙酸污染土壤的修复。
[0013]菌株名:Cupriaviduscampinensis BJ71
[0014]保减中心:中国典型培养物保减中心
[0015]地址:中国武汉武汉大学
[0016]保藏日期:2014年I月6日
[0017]保藏编号:CCTCCM2014006
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1BJ71菌株的形态，
[0019]左图为电镜图，右图为菌落形态图
[0020]图2图2BJ71菌株的系统发育树
[0021]图3BJ71菌株对土壤中2，4_D生物修复效果的动态监测。
【具体实施方式】
[0022]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
[0023]实施例1[0024]本发明提供的除草剂2，4- 二氯苯氧乙酸降解菌株BJ71的分离筛选方法。
[0025]从北京市顺义区木林镇施用除草剂2，4- 二氯苯氧乙酸多年的麦田土壤中采集距地表下5~29cm处表层土壤样本IOg,加入到含有500mg/L2, 4-二氯苯氧乙酸的100ml MSM液体培养基中进行富集培养；富集培养的条件为30°C 150rpm摇床振荡培养7天，将5%培养液转接到相同成分的新鲜培养基中，相同条件下进行培养，此过程重复4次；之后，吸取Iml第4次培养液倍比稀释后涂布在含500mg/L2，4- 二氯苯氧乙酸的MSM固体培养基上30°C恒温培养3~5天；将在含2，4- 二氯苯氧乙酸为唯一碳源的选择性培养基上长出的单菌落活化后分别接种于含有500mg/L2，4- 二氯苯氧乙酸的100ml MSM液体培养基中，150rpm摇床振荡30°C黑暗条件下培养，定时取样测定培养液中2，4-二氯苯氧乙酸的浓度(OD283),最终筛选到培养2d时可降解2，4-二氯苯氧乙酸约85%总量的BJ71菌株。菌株保存于含500mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸的LB液体培养基中，添加甘油浓度为15-30%。或者保存于含500mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸的LB斜面上。
[0026]该菌于2014年I月6日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCCM2014006。
[0027]上述2，4- 二氯苯氧乙酸降解菌生长的培养基配方为:
[0028](I )MSM液体培养基(/L):硫酸镁0.2g，硫酸铵0.5g，硫酸二氢钾0.5g，硫酸氢二钾1.5g，乙二胺四乙酸二钠0.12g，氢氧化钠0.02g，微量元素浓缩液Iml, ρΗ7.0,121。。20min灭菌。过滤除菌的10mg/ml2, 4-二氯苯氧乙酸母液在临用前加入使其终浓度为500mg/L。其中微量元素浓缩液(1000X) (/L)的配方为:硫酸锌4g，硫酸铜lg，硫酸钠0.lg，钥酸钠Ig7氯化钴0.1g,硫酸猛0.4g,硫酸0.5ml。
[0029](2)MSM固体培养基(/L):具体成分同MSM液体培养基，当中加入2%琼脂。过滤除菌的10mg/ml2, 4-二氯苯氧乙酸母液在倒平板前加入使其终浓度为500mg/L。
[0030](3) 10mg/ml2, 4_ 二氯苯氧乙酸母液:lg分析纯的2，4_ 二氯苯氧乙酸溶解于约80mlINNaOH溶液中，调节pH值至7.0,定容至100ml，0.22 μ m滤膜过滤除菌。临用前加入，使得2，4- 二氯苯氧乙酸在MSM培养基中的终浓度为500mg/L。
[0031](4)含500mg/L2，4_ 二氯苯氧乙酸的LB液体培养基(/L):胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,氯化钠IOg, 121 °C 20min灭菌。过滤除菌的10mg/ml2, 4- 二氯苯氧乙酸母液在培养之前加入使其终浓度为500mg/L。
[0032](5)含500mg/L2, 4_ 二氯苯氧乙酸的LB斜面(/L):胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化钠10g, 10mg/ml2, 4-二氯苯氧乙酸母液50ml, 20g琼脂。121°C 20min灭菌。
[0033]菌株BJ71的形态鉴定为:短杆菌，革兰氏染色阴性，无芽孢。在LB固体平板上生长菌落为圆形，淡黄色，微隆起，边缘整齐，湿润，光滑。菌落形态及镜下形态见图1。生理生化鉴定:氧化酶、过氧化氢酶阳性；脲酶阳性；不发酵葡萄糖；硝酸盐还原阳性；不还原亚硝酸盐；反硝化作用阴性；酸性磷酸酶、碱性磷酸酶阳性。
[0034]菌株BJ71的分子鉴定为:用细菌DNA提取试剂盒提取活化的菌悬液，采用细菌16SrDNA 通用引物(上海 Life Technologies 合成，27f/1492r)进行 16SrDNA 序列 PCR扩增。PCR产物的纯化和测序由上海Life Technologies完成，获得了长度为1390bp的16SrDNA序列(见SEQ ID N01)。进入EzTaxon-e服务器与细菌模式菌株进行比对，结合GenBank序列上比对结果构建系统发育树分析，表明菌株与Cupriavidus campinensis模式菌株WS2(T)同源性为100%。系统发育树见图2。[0035]扩增16SrRNA基因的引物序列为:
[0036]27f:5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ ，
[0037]1492r:5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。
[0038]PCR 体系为:l*premix rTaq, 0.4 μ m 引物 27f, 0.4 μ m 引物 1492r, 50ng DNA。
[0039]PCR 程序为:95 °C 预变性 lOmin，95 °C 变性 45sec，55 °C 退火 45sec，72 °C 延伸90sec, 35个循环；之后72°C延伸7min。
[0040]结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性和分子鉴定结果，鉴定除草剂2，4- 二氯苯氧乙酸降解菌株BJ71属于Cupriavidus campinensis。
[0041]实施例2
[0042]利用Cupriavidus campinensis BJ71菌株进行2，4_ 二氯苯氧乙酸污染土壤的生
物修复。
[0043]BJ3-71接种菌液的制备:从平板上选取一环菌落接入含有500mg/L2，4_ 二氯苯氧乙酸的LB液体培养基中，摇瓶装液量为40%( v/v)、150rpm转速、30°C条件下过夜活化；吸取500 μ I活化的菌液，转接入上述相同成分的新鲜培养基中，相同条件下培养至OD6tltl为0.6左右；5000g离心5min收集菌体，用0.85%的生理盐水清洗两次后，悬浮于少量生理盐水中备用。
[0044]土壤的处理:分为4个处理组。A.未灭菌土壤组:未灭菌土壤用500ppm2，4_D处理；B.未灭菌土壤+BJ71处理组:未灭菌土壤用500ppm2，4_D处理后，接种BJ71菌液；C.灭菌土壤+BJ71处理组:灭菌土壤用500ppm2，4_D处理后，接种BJ71菌液；D.对照组:灭菌土壤用500ppm2，4-D处理，以监测暗培养条件下是否存在其他降解作用。灭菌土的制备方法是:称取200g 土壤121°C 20min灭菌，一天之内反复处理3次，调节含水量和天然土壤相同。在500ml搪瓷杯中制备土壤微生态，每组3个重复。每个处理组均加入200g 土壤，添加10mg/ml2，4_D母液至土壤中使其终浓度为500ppm浓度，30°C孵育I天后，将新鲜制备的备用BJ71菌悬液加入，接种量为1.0-9.0X107CFU/g 土壤。未处理组加入相同量的生理盐水。加入少量水使土壤含水率保持在最大持水量的40-75%，放入恒温培养箱中30°C黑暗条件下培养，定时取样测定土样中2，4-D残留量。
[0045]土样中2，4-D残留量的测定方法:称取Ig 土壤，加入2ml蒸馏水中漩涡振荡，12000rpm离心IOmin后，吸取上清测定OD283值。
[0046]紫外分光光度法测定土壤中2，4- 二氯苯氧乙酸含量显示，与未接种菌液的未灭菌土壤相比，接种BJ71的灭菌土壤处理组以及土壤处理组的2，4-D降解效果明显；在处理后14天时，接种BJ71的未灭菌土壤处理组对500ppm2，4-D的降解效率已经高达92.17%(见图3)。表明该BJ71菌株可以有效去除土壤中的2，4-D污染，达到生物修复的目的。
【权利要求】
1.一株降解除草剂2，4-二氯苯氧乙酸的菌株(Cupriavidus campinensis),命名为BJ71，保藏编号为 CCTCC M2014006。
2.权利要求1所述菌株在被2，4-二氯苯氧乙酸污染的土壤进行修复中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，为将活化的(Cupriaviduscampinensis)BJ71菌悬液加入到被2，4-二氯苯氧乙酸污染的土壤中，混合均匀，土壤上表面覆上黑膜遮盖，保持土壤温度25-30度。
4.根据权利要求3所述的应用，所述BJ71菌的终浓度为1.0-9.0X107CFU/g土壤，加水使土壤含水率保持在最大持水量的40-75%。
5.根据权利要求3所述的应用，所述活化的(Cupriaviduscampinensis)BJ71菌悬液制备方法为:从平板上选取一环菌落接入含有500mg/L2，4-二氯苯氧乙酸的LB液体培养基中，摇瓶装液量为 体积的40%、150rpm转速、30°C条件下过夜活化；吸取500 μl活化的菌液，转接入相同成分的新鲜LB液体培养基中，相同条件下培养至OD_为0.6左右；5000g离心5min收集菌体，用0.85%的生理盐水清洗两次后，悬浮于生理盐水中。
【文档编号】B09C1/10GK103740622SQ201410014994
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】赵德刚, 韩丽珍 申请人:贵州大学