一种快速无损测定玉米单籽粒直链淀粉含量的方法与流程

本发明涉及玉米单籽粒直链淀粉含量测定技术领域，利用近红外光谱技术实现对玉米单籽粒直链淀粉含量的快速、无损检测。

背景技术：

利用高直链淀粉玉米生产生物可降解塑料有可能从根本上解决白色污染问题, 将为世界环保事业带来一次重大革命。开展高直链淀粉玉米育种, 发展高直链淀粉玉米生产和加工具有巨大的经济效益和社会效益。快速、准确地测定玉米籽粒直链淀粉含量对于开展高直链淀粉玉米选育非常必要，其中测定单籽粒直链淀粉的含量对玉米品质育种早代材料的筛选及玉米直链淀粉的生理和遗传研究尤为重要。测定玉米籽粒的直链淀粉含量, 我国主要参照GB7648-87 的碘比色法测定，该方法通常用在育种高代以多量的种子进行直链淀粉含量的测定, 但该方法费时费力，成本高，而且会破坏优良的籽粒，尤其是难以在保证种子萌发能力的前提下对早代的单籽粒种子的直链淀粉含量进行测定。因此研究一种可以快速无损而且准确的测定玉米单籽粒直链淀粉含量的方法对于玉米品质育种早代材料的筛选及玉米直链淀粉的生理和遗传研究具有重要意义。

近红外（Near Infrared，NIR）光的波长范围约为780～2500nm，是介于可见区与中红外区之间的电磁波，通过与物质中有机分子的含氢基团X-H键的作用，形成有机分子的倍频和合频吸收光谱。根据这些近红外吸收频谱出现的位置、吸收强度等信息特征，结合数理统计对该成分作定性和定量分析。与常规分析相比，该项技术需要更多的化学计量学算法与软件技术。随着计算机技术的发展、化学计量学研究的深入及近红外光谱仪器制造技术的日益完善，近红外光谱（Near Infrared Reflectance Spectroscopy，NIRS）分析技术得到飞跃发展。由于具有快速、无损、环保等特点而广泛用于农产品、食品、化学、医药、石油等领域。在玉米品质育种过程中，利用近红外技术进行定量分析可以减少对分离世代中大量样品的筛选工作，节约育种材料和时间，并且是无损鉴定，符合现代育种的需要。

技术实现要素：

为克服碘比色法难以应用在单籽粒直链淀粉含量测定上的局限，以及弥补其方法费时、高成本的不足，本发明提供了一个快速、无损测定玉米单籽粒直链淀粉含量的方法，即建立了玉米单籽粒直链淀粉含量的近红外定量分析模型。本发明通过以下技术方案得以实现：

步骤一：收集玉米单籽粒材料。收集单籽粒材料100份以上，为保证所建模型的稳定性，材料间粒型、颜色等应有所差异。

步骤二：采集样品近红外光谱。在采集光谱之前，所有材料应进行平衡水分处理。使用近红外谷物品质分析仪采集样品光谱，谱区范围950～1650 nm，分辨率2 nm。采用单籽粒镜面样品盘装载样品，籽粒需水平放置在样品盘中心，无胚一侧朝上。每个样品重复装样3次，每次装样扫描2次，保存平均光谱。仪器自身所带的具有NIRS收集、存储、处理功能的软件或其它公认统计软件处理光谱图，例如可采用多变量化学计量学分析软件The Unscrambler。

步骤三：用常规化学法测定样品直链淀粉含量。光谱采集完成后，将各样品浸泡于50℃、体积分数0.25%的亚硫酸溶液中60h，然后细磨、过滤、离心，去上清液，加入0.2%NaOH溶液，4h后用ddH₂O洗涤，再加入丙酮，静置，离心去丙酮，真空抽滤，风干得到玉米淀粉。双波长碘比色法测定样品直链淀粉含量，测定波长分别为620nm和510nm，样品按照化学值从小到大排列，每隔 3个取 1 个组成验证集用于模型验证，剩下的样品组成校正集用于建模。

步骤四：对步骤二所得近红外光谱进行预处理，消除干扰因素。原始光谱进行预处理方法包括一阶导数、二阶导数、多元散射校正、标准正交变量变换等。这些方法可单独使用或多个联合使用，以达到最佳预处理效果。

步骤五：建立玉米单籽粒的直链淀粉含量化学值与近红外光谱之间的校正模型并检验。建立NIRS光谱与化学值之间的校正模型的化学计量学方法包括：偏最小二乘法（PLS）、多元线性回归（MLR）、主成分回归（PCR）等。将样品化学值输入对应的样品，并与光谱数据对应，用偏最小二乘法或其它化学计量学方法建立玉米单籽粒直链淀粉含量的定量分析模型，以决定系数（R²）、交叉验证标准偏差（RMSECV）评价模型优劣。决定系数最大，标准差最小的模型，效果最佳。

决定系数（R²）和交叉验证标准偏差（RMSECV）：

；

式中Differ_i表示第i个样品的化学值和NIRS预测值之差，M为校正集样品数，y_i为第i个样品的化学值，y_m是m个样品NIRS预测值的平均值。

步骤六：对模型进行外部验证。用验证集样品考察模型能否定量样品，以预测标准差（RMSEP），以及用化学方法测定结果和NIR预测结果进行比较，检验两种方法的差异显著性，差异不显著的说明该模型可以取代传统方法。

预测标准差（RMSEP）：

式中Differ_i表示第i个样品的化学值和NIRS预测值之差，N为验证集样品数。

步骤七：采集待测样品的近红外光谱。待测样品的光谱采集方法同建模时采集光谱的方法，用建好的NIRS定量分析模型快速检测待测样品的直链淀粉含量。

本发明有以下有益效果：（1）本发明采用近红外光谱分析仪测定样品直链淀粉含量，具有分析速度快、无损伤、环保等优点。本发明克服了常规化学分析方法费时、高成本且难以用于测定单籽粒直链淀粉含量的不足，实现了对玉米单籽粒直链淀粉含量的快速无损分析。（2）利用漫反射近红外光谱分析技术分析玉米单籽粒直链淀粉含量，结合PLS等方法建立样品直链淀粉含量与近红外光谱的校正模型，通过预测未知样品，结果可靠、理想。因此，可以将该技术进行推广，应用于玉米品质育种中的单籽粒直链淀粉含量分析环节。

附图说明

图1为玉米单籽粒样品的近红外原始光谱图。

图2为验证集样品直链淀粉含量NIRS预测值与真实值之间的相关图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。

实施例1 玉米单籽粒近红外光谱图的采集

收集196份玉米单籽粒样品，在采集光谱之前，所有材料室温下平衡水分60d。使用Perten公司DA7200型近红外光谱仪采集样品光谱，谱区范围950～1650 nm，分辨率2 nm。采用单籽粒镜面样品盘装载样品，籽粒需水平放置在样品盘中心，无胚一侧朝上。每个样品重复装样3次，每次装样扫描2次，保存平均光谱（见图1）。

实施例2 玉米单籽粒直链淀粉含量NIRS模型

2.1 模型的建立

提取得到各样品总淀粉后，用双波长碘比色法测定各样品直链淀粉含量，测定波长分别为620nm和510nm，样品按照化学值从小到大排列，每隔 3个取 1 个组成验证集用于模型验证，剩下的样品组成校正集用于建模。采用多变量化学计量学分析软件The Unscrambler （9.8版）对实施例1采集的样品光谱进行一阶导数+标准正交变量变换（SNV）光谱预处理，采用PLS建立数学模型并做交叉验证。建模结果显示，校正集决定系数R²=0.8970, 交叉验证标准偏差RMSECV=1.805 。

2.2 模型的外部验证

用建立的模型对验证集样品直链淀粉含量进行预测，得到验证集样品直链淀粉含量的NIRS预测值与化学值的相关图（见图2）。预测决定系数R²_cal=0.7859，达到极显著水平（P<0.01）; 预测标准偏差RMSEP=2.017。配对t检验结果表明样品的NIRS预测值与化学值之间无显著差异。以上结果表明所建NIRS模型用于玉米单籽粒直链淀粉含量的测定是准确可靠的。

实施例3 预测待测样品的直链淀粉含量

对未知的玉米单籽粒样品进行扫描，比较未知样品与定标样品的近红外光谱，用上面建立的模型预测未知样品的直链淀粉含量。