一种慢病毒效价的浓缩检测试剂盒及浓缩检测方法与流程

本发明属于医学检测分析用具技术领域，具体涉及一种慢病毒效价的浓缩检测试剂盒及浓缩检测方法。所述慢病毒用于检测制备Car-T细胞。

背景技术：

以慢病毒为载体修饰T细胞是制备Car-T细胞的常用方法，在使用制备好的慢病毒感染T细胞之前，需要先检测所制备的慢病毒的效价，以此来计算需要使用的病毒量。此外，初步制备的慢病毒的效价较低，需要先进行浓缩以便高效制备Car-T细胞。

目前市面上还没有单独出售的同时兼具浓缩-检验慢病毒效价的一体式试剂盒。如宝生物的Lenti-XTM p24快速检测试剂盒，便是通过ELISA检测p24来测定慢病毒效价，试剂盒中主要包含有100μL10ng/ml的标准品、6ml的裂解液、12ml的一抗、12ml的二抗(辣根链酶)，以及ELISA常规的洗液、TMB显色液和终止液，只有检测的功能，没有浓缩的效果。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种慢病毒效价的浓缩检测试剂盒及浓缩检测方法。所述浓缩检测试剂盒，同时具有浓缩和检测两个功能，对于Car-T细胞的制备而言，更加实用便捷，同时能够更加准确地测量病毒的效价，还能在总体上降低成本。

本发明所采用的技术方案为：

一种慢病毒效价的浓缩检测试剂盒，包括盒体和试剂瓶，所述盒体的底部设置有固定层，所述固定层上开设有多个固定孔，所述试剂瓶设置在固定孔内，所述试剂瓶包括标准品试剂瓶、稀释液试剂瓶、一抗试剂瓶、二抗试剂瓶、裂解液试剂瓶、清洗液试剂瓶、浓缩液Ⅰ试剂瓶、浓缩液Ⅱ试剂瓶、显色液试剂瓶和终止液试剂瓶。

所述标准品试剂瓶中装有标准品溶液；所述稀释液试剂瓶中装有稀释液；所述一抗试剂瓶中装有一抗、所述二抗试剂瓶中装有二抗、所述裂解液试剂瓶中装有裂解液、清洗液试剂瓶中装有清洗液、所述浓缩液Ⅰ试剂瓶中装有浓缩液Ⅰ、所述浓缩液Ⅱ试剂瓶中装有浓缩液Ⅱ、所述显色液试剂瓶中装有显色液；所述终止液试剂瓶中装有终止液。

所述标准品为p24标准品；所述稀释液为磷酸缓冲盐溶液；所述一抗为Anti-p24抗原，所述二抗为链霉亲和素，所述浓缩液Ⅰ为NaCl溶液，所述浓缩液Ⅱ为PEG6000，所述显色液为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺显色液。

所述标准品的浓度为1ng/ml，所述标准品的体积为300μL；所述稀释液试剂瓶的数目为两个，每个所述稀释液试剂瓶中稀释液的体积为50ml；所述一抗试剂瓶的数目为三个，每个所述一抗试剂瓶中一抗的体积为4ml；所述二抗试剂瓶的数目为三个，每个所述二抗试剂瓶中二抗的体积为4ml；所述裂解液试剂瓶的数目为两个，每个所述裂解液试剂瓶中裂解液的体积为5ml；每个所述清洗液试剂瓶的数目为两个，每个所述清洗剂试剂瓶中清洗剂的体积为50ml；所述浓缩液Ⅰ试剂瓶的数目为五个，每个所述浓缩液Ⅰ试剂瓶中浓缩液Ⅰ的体积为10ml，浓缩液Ⅰ的浓度为5M；所述浓缩液Ⅱ试剂瓶的数目为五个，每个所述浓缩液Ⅱ试剂瓶中浓缩液Ⅱ的体积为10ml；所述显色液的体积为12ml；所述终止液的体积为12ml。

优选地，所述浓缩检测试剂盒还包括96孔板、96孔板架和封口胶板，所述96孔板、96孔板架和封口胶板均设置在所述盒体内部。

所述96孔板用于盛庄实验过程中的试剂，所述96孔板架用于安放所述96孔板，所述封口胶板上设有易撕虚线，在使用时，将所述封口胶板沿着所述易撕虚线撕为合适的大小，封堵所述96孔板的上的孔口。

所述浓缩检测试剂盒还包括避光袋，所述避光袋设置在所述盒体内部，所述避光袋用于存放实验过程中需要避光保存的试剂瓶或96孔板，方便使用者使用。

所述浓缩检测试剂盒还包括上盖板，所述上盖板覆盖在所有的所述试剂瓶的上方。所述上盖板和所述固定层均为泡沫制成，具有固定和保护所述试剂瓶的作用。

本发明还提供了一种使用所述浓缩检测试剂盒的慢病毒效价的浓缩检测方法，包括以下步骤：

A、将浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ混合均匀，并在3-5℃下预冷20-40min，得到预冷浓缩液；

B、将步骤A中得到的预冷浓缩液和病毒原液混合均匀，振荡静置后离心，离心后去除上液清，即得病毒浓缩液；

C、取标准品，加入不同体积的稀释液，得到不同浓度的标准品稀释液；

D、取病毒浓缩液，加入稀释液，得到病毒稀释液；

E、对标准品稀释液和病毒稀释液分别进行ELISA反应，ELISA反应结束后分别测量所述标准品稀释液和病毒稀释液的OD450值；

F、根据不同浓度的标准品稀释液的OD450值，绘制OD450值和标准浓度的关系曲线；依照所述关系曲线，根据所述PCR反应产物的OD450值，查得PCR反应产物的浓度；根据所述PCR反应产物的浓度，计算得到所述待测样品的浓度。

步骤B中，所述病毒原液与所述预冷浓缩液的体积比为1:2；在去除上清液之后，沉淀使用病毒原液1/100体积的磷酸缓冲盐溶液进行悬浮混匀，即得病毒浓缩液，并于-80℃以下保存。

步骤E中所述ELISA反应为：对所述标准品稀释液和病毒稀释液分别加入到覆盖有抗原的八联孔板中，胶板覆盖，依次进行孵育和清洗；然后在所述酶标版上加入一抗，胶板覆盖，依次进行孵育和清洗；然后在酶标版上加入二抗，胶板覆盖，依次进行孵育和清洗；孵育完成后，加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺，避光；最后加入停止液，终止反应后分别测量标准品稀释液和病毒稀释液的OD450值。

进一步地，步骤E中，所述覆盖有抗原的八联孔板中中预先加入有20μL裂解液。

本发明中检测的机理为：因治疗载体，是制备Car-T的常用载体。p24抗原是HIV-1病毒的蛋白质组分，而且不受基因型的限制，通过检测p24，可有效检测慢病毒的效价。酶联免疫吸附实验(ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起化学反应而呈现颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比，通过酶标仪检测吸光值，画出标准品吸光值-浓度曲线，便可根据样品的吸光值计算出所测样品的p24含量。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供了一种慢病毒效价的浓缩检测试剂盒，同时具有浓缩和检测两个功能，对于Car-T细胞的制备而言，更加实用便捷，同时能够更加准确地测量病毒的效价，还能在总体上降低成本。

2、本发明还提供了一种基于所述试剂盒的慢病毒效价的浓缩检测方法，所述方法结合所述浓缩检测试剂盒，操作简便，节省流程，提高了实验人员的工作效率。

附图说明

图1是本发明中浓缩检测试剂盒盒体内部的结构示意图；

图2是本发明中实施例2中OD450值和标准浓度的关系曲线图。

图中：1、标准品试剂瓶；2、稀释液试剂瓶；3、一抗试剂瓶；4、二抗试剂瓶；5、裂解液试剂瓶；6、清洗液试剂瓶；7、浓缩液Ⅰ试剂瓶；8、浓缩液Ⅱ试剂瓶；9、96孔板；10、96孔板架；11、封口胶板。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

如图1所示，本发明提供了一种慢病毒效价的浓缩检测试剂盒，所述盒体的底部设置有固定层，所述固定层上开设有多个固定孔，所述试剂瓶设置在固定孔内，所述试剂瓶包括标准品试剂瓶1、稀释液试剂瓶2、一抗试剂瓶3、二抗试剂瓶4、裂解液试剂瓶5、清洗液试剂瓶6、浓缩液Ⅰ试剂瓶7、浓缩液Ⅱ试剂瓶8、显色液试剂瓶和终止液试剂瓶。

所述标准品试剂瓶1中装有标准品溶液；所述稀释液试剂瓶2中装有稀释液；所述一抗试剂瓶3中装有一抗、所述二抗试剂瓶4中装有二抗、所述裂解液试剂瓶5中装有裂解液、清洗液试剂瓶6中装有清洗液、所述浓缩液Ⅰ试剂瓶7中装有浓缩液Ⅰ、所述浓缩液Ⅱ试剂瓶8中装有浓缩液Ⅱ、所述显色液试剂瓶中装有显色液；所述终止液试剂瓶中装有终止液。

所述标准品为p24标准品；所述稀释液为磷酸缓冲盐溶液；所述一抗为Anti-p24抗原，所述二抗为链霉亲和素，所述浓缩液Ⅰ为NaCl溶液，所述浓缩液Ⅱ为PEG6000，所述显色液为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺显色液。

所述标准品的浓度为1ng/ml，所述标准品的体积为300μL；所述稀释液试剂瓶2的数目为两个，每个所述稀释液试剂瓶2中稀释液的体积为50ml；所述一抗试剂瓶3的数目为三个，每个所述一抗试剂瓶3中一抗的体积为4ml；所述二抗试剂瓶4的数目为三个，每个所述二抗试剂瓶4中二抗的体积为4ml；所述裂解液试剂瓶5的数目为两个，每个所述裂解液试剂瓶5中裂解液的体积为5ml；每个所述清洗液试剂瓶6的数目为两个，每个所述清洗剂试剂瓶中清洗剂的体积为50ml；所述浓缩液Ⅰ试剂瓶7的数目为五个，每个所述浓缩液Ⅰ试剂瓶7中浓缩液Ⅰ的体积为10ml，浓缩液Ⅰ的浓度为5M；所述浓缩液Ⅱ试剂瓶8的数目为五个，每个所述浓缩液Ⅱ试剂瓶8中浓缩液Ⅱ的体积为10ml；所述显色液的体积为12ml；所述终止液的体积为12ml。本实施例中，所使用的试剂瓶均为行业通用的试剂瓶。

所述浓缩检测试剂盒还包括96孔板9、96孔板架10和封口胶板11，所述96孔板9、96孔板架10和封口胶板11均设置在所述盒体内部。

所述96孔板9用于盛庄实验过程中的试剂，所述96孔板架10用于安放所述96孔板9，所述封口胶板11上设有易撕虚线，在使用时，将所述封口胶板11沿着所述易撕虚线撕为合适的大小，封堵所述96孔板9的上的孔口。

所述浓缩检测试剂盒还包括避光袋，所述避光袋设置在所述盒体内部，所述避光袋用于存放实验过程中需要避光保存的试剂瓶或96孔板9，方便使用者使用。

所述浓缩检测试剂盒还包括上盖板，所述上盖板覆盖在所有的所述试剂瓶的上方。所述上盖板和所述固定层均为泡沫制成，具有固定和保护所述试剂瓶的作用。

实施例2

一种使用实施例1中所述浓缩检测试剂盒的慢病毒效价的浓缩检测方法，包括以下步骤：

1、浓缩液准备

每200ml的慢病毒原液，准备一管病毒浓缩液Ⅰ、一管病毒浓缩液Ⅱ、100ml无菌水，于无菌条件下混匀溶解，4℃预冷30min。

2、病毒原液的浓缩

取病毒原液1/2体积的已预冷浓缩液，于无菌条件下与病毒原液混匀；

4℃低速振荡30min；

冰上静置30min；

4℃3000g离心45min(预冷，升7降5)；升7降5指离心时升速设为7，降速设为5

抽吸去上清，沉淀用病毒原液1/100体积的PBS悬浮混匀，分装后-80℃可长期保存。

3、标准品准备

1ng/ml的标准品，取20μL，加380μL稀释液，稀释为50pg/ml；

取100μL上述50ng/ml的标准品，加400μL稀释液，继续稀释为10ng/ml；

取100μL上述10ng/ml的标准品，加400μL稀释液，继续稀释为2ng/ml；

取稀释液作为0ng/ml.

4、样品准备

未浓缩的病毒样品，用稀释液稀释10⁴-10⁶倍；

已浓缩100倍的病毒样品，用稀释液稀释10⁶-10⁸倍

5、清洗液准备

2ml的稀释液，加38ml蒸馏水；

6、向覆盖有抗原的8联孔板中加入20μL的裂解液。

7、加入200μL的标准品(0、2、10、50pg/ml)及样品，胶板覆盖，37℃孵育1h。

8、250μL 1×清洗液r洗3次。

9、加入100μL准备好的一抗，胶板覆盖，室温孵育1小时。

10、250μL 1×清洗液洗3次。

11、加入100μL准备好的二抗，胶板覆盖，室温孵育30分钟。

12、250μL 1×清洗液3次。

13、加100μL TMB，室温避光，20分钟，显示蓝色。

14、加100μL终止液，显示黄色，酶标仪检测OD450nm吸光值。

15.根据OD值画标准曲线，如下表：

根据上表做出标准曲线图，如图2所示。

16.根据标准曲线计算样品浓度，如下表：

从上述实施例能够看出，使用所述浓缩检测试剂盒的慢病毒效价的浓缩检测方法，能够简单快捷的实现浓缩和检测的功能。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。