一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法与流程

本发明涉及生物医学领域，具体是关于一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法。

背景技术：

免疫磁珠分离技术是一项基于抗原-抗体结合作用发展起来的免疫学技术。它主要是靠在磁珠表面修饰氨基，羧基，链霉亲和素等基团，利用这些基团可以和抗体共价或非共价偶联，可用于结合相应的抗原，在外加磁场的作用下可达到相应抗原物质的分离，广泛应用于核酸提取，膜结构物质分离如细胞分离领域。

外泌体（exosome）是一类直径为30-150nm的膜结构囊泡，广泛存在于血液，尿液，唾液等体液中。外泌体膜表面含有CD9，CD63和CD81标志蛋白，膜内含有核酸如microRNA。近年来研究发现，肿瘤患者体内血清外泌体分泌异常，具体表现为：（1）肿瘤患者体内血清外泌体膜表面除含有CD9，CD63和CD81标志蛋白外，还含有特定标记蛋白，如胰腺癌患者体内血清外泌体中特定表达GPC1蛋白；（2）肿瘤患者体内血清外泌体中microRNA表达异常，如肝癌患者体内血清外泌体中microRNA-221表达量明显高于正常人表达量。因此，血清外泌体的表达分泌情况可作为肿瘤早期诊断的依据。

目前，血清外泌体分离有离心法，色谱法，大分子聚合物沉降法，免疫磁珠试剂盒法。离心法对外泌体得率较高，但其耗时耗力，不适合大量样本操作。色谱法提取的外泌体纯度较高，但其分离易受杂蛋白干扰，操作稳定性差。大分子聚合物沉淀外泌体耗时短，缺点是所得外泌体纯度低。以上所述技术均只能对血清中总的外泌体进行分离，缺乏对特定标志物外泌体(如CD9⁺/CD63⁺外泌体)的分离，免疫磁珠试剂盒法可对特定标志物的外泌体进行分离，但该项技术仅为少数国际巨头公司如美国SBI公司，日本MBL公司所掌握，使用成本高昂。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种，操作简单，成本低，针对含有特定标志物外泌体分离方法。

本发明的具体技术方案是：一种使用免疫磁珠分离血清中外泌体的方法，该方法包括以下各步骤：

（1）预处理，室温下以新鲜血清，经离心分离，去除细胞碎片，取上清；

（2）取1倍体积链霉亲和素修饰磁珠悬液用100倍体积分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，100倍体积分离缓冲液悬浮；将上述悬浮液加入1倍体积CD9或CD63单克隆抗体孵育；孵育完成后用100倍体积分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，100倍体积分离缓冲液悬浮；

（3）将步骤（2）最终得到的磁珠悬浮液中加入2-10倍体积步骤（1）处理得到的血清上清，孵育；

（4）将步骤（3）孵育完成后用100倍体积磷酸缓冲盐溶液清洗，磁力架分离磁珠，即得分离有外泌体的复合物即磁珠-抗体-外泌体。

进一步的，上述步骤（2）中悬浮液加入1倍体积CD9或CD63单克隆抗体孵育30分钟。

进一步的，上述步骤（3）孵育2小时。

进一步的，上述步骤中磁力架分离磁珠，清洗三遍。

进一步的，上述分离缓冲液为含0.1%牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液。

进一步的，上述分离缓冲液以0.2微米滤膜过滤除菌。

进一步的，上述的孵育条件为：30℃，孵育器参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒。

附图说明

图1为免疫磁珠分离血清中CD9⁺外泌体的透射电镜效果图。其中A,B分别为偶联有/未偶联有生物素化CD9单克隆抗体的磁珠富集血清外泌体后的效果图。

图2为免疫磁珠分离血清中CD63⁺外泌体的透射电镜效果图。其中A,B分别为偶联有/未偶联有生物素化CD63单克隆抗体的磁珠富集血清外泌体后的效果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的基本思想是使用免疫磁珠分离血清中外泌体。

下述实施例中使用的主要仪器及试剂：链霉亲和素修饰Dynabeads® MyOne™ Streptavidin T1磁珠（Invitrogen公司，美国）；生物素修饰的鼠抗人CD9单克隆抗体（Ancell公司，美国）；生物素修饰的鼠抗人CD63单克隆抗体（Ancell公司，美国）；HulaMixer® Sample Mixer孵育器（Invitrogen公司，美国）;透射电子显微镜（Hitachi，日本）

实施例1.免疫磁珠分离血清中CD9⁺外泌体

一．方法

（1）收集新鲜血清，置于离心机中，室温2000g离心30分钟，弃细胞碎片沉淀，取离心上清液（若血清处于冰冻状态，需先26℃水浴解冻后再离心）。

（2）漩涡震荡链霉亲和素修饰Dynabeads® MyOne™ Streptavidin T1磁珠，待磁珠悬浮液均一后，取5微升磁珠悬液加入到500微升分离缓冲液中，悬浮清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍。清洗完成后，500微升分离缓冲液悬浮磁珠。

（3）取5微升Ancell公司生产的鼠抗人生物素化CD9单克隆抗体加入到上述方法（2）所得的磁珠悬液中，颠倒混合均匀，置于HulaMixer® Sample Mixer孵育器上孵育30分钟（参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒）；孵育完成，孵育液置于磁力架上5分钟，弃清液，磁珠用500微升分离缓冲液悬浮，悬浮清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍。清洗完成后，500微升分离缓冲液悬浮磁珠。

（4）取10微升方法（1）所得的血清加入到方法（3）所得的磁珠悬液中，颠倒混合均匀，置于HulaMixer® Sample Mixer孵育器上孵育2小时（参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒）；孵育完成，孵育液置于磁力架上，弃清液，磁珠用500微升分离缓冲液悬浮，悬浮清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍；清洗完成后，即得分离有CD9⁺外泌体的复合物即磁珠-抗体-CD9⁺外泌体。

二．结果

上述方法（4）所得到的磁珠-抗体-CD9⁺外泌体复合物经扫描电镜拍摄后得到附图1所示结果，显示磁珠表面

实施例2.免疫磁珠分离血清中CD63⁺外泌体

一．方法

（1）收集新鲜血清，置于离心机中，室温2000g离心30分钟，弃细胞碎片沉淀，取离心上清液（若血清处于冰冻状态，需先26℃水浴解冻后再离心）。

（2）漩涡震荡链霉亲和素修饰Dynabeads® MyOne™ Streptavidin T1磁珠，待磁珠悬浮液均一后，取5微升磁珠悬液加入到500微升分离缓冲液中，悬浮清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍。清洗完成后，500微升分离缓冲液悬浮磁珠。

（3）取5微升Ancell公司生产的鼠抗人生物素化CD63单克隆抗体加入到上述方法（2）所得的磁珠悬液中，颠倒混合均匀，置于HulaMixer® Sample Mixer孵育器上孵育30分钟（参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒）；孵育完成，孵育液置于磁力架上5分钟，弃清液，磁珠用500微升分离缓冲液悬浮，悬浮清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍。清洗完成后，500微升分离缓冲液悬浮磁珠。

（4）取10微升方法（1）所得的血清加入到方法（3）所得的磁珠悬液中，颠倒混合均匀，置于HulaMixer® Sample Mixer孵育器上孵育2小时（参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒）；孵育完成，孵育液置于磁力架上，弃清液，磁珠用500微升分离缓冲液悬浮，悬浮清洗，磁力架分离磁珠，清洗三遍；清洗完成后，即得分离有CD63⁺外泌体的复合物即磁珠-抗体-CD63⁺外泌体。

二．结果

上述方法（4）所得到的磁珠-抗体-CD63⁺外泌体复合物经扫描电镜拍摄后得到附图2所示结果，附图2中的A和B对比发现，A中未偶联有生物素化CD63单克隆抗体的磁珠富集血清外泌体后，磁珠表面未显示附着有外泌体，而B中偶联有生物素化CD63单克隆抗体的磁珠富集血清外泌体后，如图中箭头所示，磁珠表面显示有直径为30-150nm外泌体附着，表明本发明能够有效的富集血清样本中CD63⁺外泌体。