检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒，其特别适于蔬菜、水果和茶叶中毒死蜱含量的检测。

背景技术：

毒死蜱(Chlorpyrifos)，化学名称O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，商品名为毒死蜱、乐斯本、白蚁清等，是甲胺磷和甲基对硫磷等高效农药的新型高效、低毒替代品种，属于广谱型有机磷酸酯类杀虫剂，可用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。毒死蜱是农产品与食品中农药残留监测的重要目标物之一，不仅在农作物中的残留日益严重，而且可以通过代谢等途径向环境中转移，对人类健康构成潜在威胁，它会影响大脑发育，对甲状腺系统产生作用，导致血液甲状腺素浓度降低，过量摄取可能会引起痉挛以及眩晕，尤其对儿童健康危害较大。

有鉴于此，发达国家对毒死蜱的使用进行了严格的规定，并不断提高毒死蜱在农产品中的残留限量。欧盟对菠菜中毒死蜱的最高限量为0.05mg/kg；日本对毒死蜱的国家标准最为严格，其2002年4月公布的农残限量标准表中，其菠菜的毒死蜱限量为0.01mg/kg；国际食品法典委员会(CAC)对菠菜中毒死蜱残留限量为0.05mg/kg。我国最高残留限量国家标准为：粮食0.1mg/kg；梨果、叶菜1mg/kg；棉籽油0.05mg/kg。

因此，为了预防和应对毒死蜱残留引起的环境和食品污染问题，有必要建立一种灵敏、简便、快速的毒死蜱检测方法。目前毒死蜱的残留检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用法(GC-MS)。采用这些分析方法需要昂贵的仪器和专门的技术人员，样品前处理过程复杂且花费高、费时长，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有简便快速、特异灵敏、样品容量大、分析成本低的特点，可以简化甚至省去样品净化步骤，在大量样本和现场样本快速筛选检测中显示出独特优势，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作，极具发展潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带的用于毒死蜱检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样本筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有毒死蜱偶联抗原的酶标板、毒死蜱单克隆抗体、酶标记抗抗体、毒死蜱标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液；所述毒死蜱偶联抗原是由毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原，所述毒死蜱半抗原是由毒死蜱原药在碱性条件下与氨基丁酸在吡啶环上与邻近氮原子的氯进行亲核取代反应得到，分子结构式为：

所述毒死蜱单克隆抗体是以毒死蜱偶联抗原作为免疫原制备获得。

所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。

所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括毒死蜱标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述毒死蜱标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L和48.6μg/L。

所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

所述复溶液优选为pH值为7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μL封闭液，37℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

在微孔条上预包被毒死蜱偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入毒死蜱单克隆抗体溶液，样本中的毒死蜱与酶标板上包被的毒死蜱偶联抗原竞争毒死蜱单克隆抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与毒死蜱的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样本中毒死蜱的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样本中毒死蜱残留量的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测毒死蜱的方法，它包括步骤：

(1)样本前处理；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样本中毒死蜱的含量；对样本的前处理要求低，样本前处理过程简单，能同时快速检测大批量样本；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样本筛选的定性、定量检测。

附图说明

图1：毒死蜱半抗原合成路线图

图2：毒死蜱半抗原核磁共振氢谱图

图3：试剂盒标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1试剂盒组分的制备

1、毒死蜱半抗原的合成(合成路线见附图1)及鉴定

1.0g毒死蜱原药用30mL乙醇溶解，加氢氧化钠0.41g，加氨基丁酸0.35g，回流反应3h，检测，原料全部反应完成。蒸干乙醇，加水-乙酸乙酯萃取，水相，调节pH值到3，乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，用二氯甲烷和正己烷重结晶，即得到毒死蜱半抗原产物。

取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，结果见附图2。图谱中化学位移在11.0ppm处的羧基信号峰，2.30ppm、1.89ppm及3.35ppm处的亚甲基信号峰，证明毒死蜱半抗原结构正确。

2、毒死蜱偶联抗原的合成及鉴定

免疫原制备——毒死蜱半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。

取9mg半抗原，溶解于1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取30mg碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2mL水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取BSA 50mg，使之充分溶解在3.8mL CB(pH9.0)中，将反应液A逐滴缓慢加入到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液；分装，于-20℃保存备用。

包被原制备——毒死蜱半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到免疫原。

取9mg半抗原，溶解于1mL DMF中；取30mg EDC和NHS用0.2mL水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取OVA 50mg，使之充分溶解在3.8mL CB(pH9.0)中，将反应液A逐滴缓慢加入到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液；分装，于-20℃保存备用。

按合成毒死蜱偶联抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。偶联物毒死蜱半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与毒死蜱半抗原、载体蛋白的最大吸收峰相比发生了明显的变化，表明毒死蜱半抗原-载体蛋白的合成是成功的。

3、毒死蜱单克隆抗体的制备

(1)杂交瘤细胞的获得

1)首次免疫：将毒死蜱半抗原-BSA偶联物(免疫原)与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2mL；

2)加强免疫两次：从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫；

3)最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时进行如下末次免疫：腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1mL，三天后处死小鼠，取其脾脏与骨髓瘤细胞融合；

4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌毒死蜱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。

(2)单克隆抗体的制备

1)细胞复苏：取出毒死蜱单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

2)制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到毒死蜱单克隆抗体溶液(-20℃保存)。

(3)单克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1:(100000～150000)。

间接竞争ELISA方法：用毒死蜱半抗原-OVA偶联物包被酶标板，加入毒死蜱标准品溶液、毒死蜱单克隆抗体溶液和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体溶液，25℃反应30min，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，用吸水纸拍干；加入底物显色液，25℃反应15min后，加入终止液终止反应；设定酶标仪于波长450nm处测定每孔吸光度值。

(4)单克隆抗体特异性的测定

抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。

本实验将毒死蜱、甲基毒死蜱、二嗪农、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、对硫磷做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC₅₀，然后按下式计算交叉反应率：

结果显示各类似物的交叉反应率为：毒死蜱100％、甲基毒死蜱7.08％、二嗪农＜1％、甲基对硫磷＜1％、杀螟硫磷＜1％、马拉硫磷＜1％、对硫磷＜1％。本发明抗体对甲基毒死蜱、二嗪农、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、对硫磷等其他农药无交叉反应，只针对毒死蜱有特异性结合。

4、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。

5、酶标记抗抗体的制备

将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4:1，由于辣根过氧化物酶在强氧化作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

(1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；

(2)降低辣根过氧化物酶与抗体的摩尔浓度比率至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失减少。

6、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被原(毒死蜱半抗原-OVA偶联物)稀释成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测毒死蜱的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被毒死蜱偶联抗原的酶标板；

(2)毒死蜱标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L和48.6μg/L；

(3)毒死蜱单克隆抗体工作液；

(4)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(5)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L硫酸；

(7)洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠的0.1～0.3mol/L磷酸盐缓冲液；

(8)复溶液为pH值为7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

实施例3蔬菜、水果和茶叶样本中毒死蜱的检测

1、样本前处理

称取1.0g±0.05g样本至10mL聚苯乙烯离心管中，加入5mL甲醇，用涡旋混合仪涡动2min，混匀；3000g室温(20～25℃)离心5min，取50μL上层清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入950μL复溶液，涡动20s；取50μL用于分析。

2、用试剂盒检测

向包被有毒死蜱偶联抗原的酶标板微孔中加入毒死蜱标准品溶液或经前处理的样本溶液50μL/孔，然后加入毒死蜱单克隆抗体工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应30min；倒出孔内液体，每孔加入250μL洗涤液充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体100μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应30min，取出重复洗板步骤；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μL，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光显色15min，每孔加入终止液2mol/L硫酸50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3、检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以毒死蜱标准品浓度(μg/L)的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，如图3所示。用同样的办法计算样本溶液的百分吸光度值，相对应每一个样本的毒死蜱含量则可从标准曲线上读出。

实施例4毒死蜱酶联免疫试剂盒技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，试剂盒标准曲线最低点为0.6μg/L，标准曲线的范围为0.6～48.6μg/L，IC₅₀(50％抑制浓度)浮动范围为1.0～2.0μg/L；对空白白菜、苹果、茶叶样本各20份进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对蔬菜、水果、茶叶样本的检测限为100μg/kg。2、样本精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，以重复测定某一浓度样本的检测结果相对标准偏差(RSD％)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(％)＝实际测定值/理论值×100％，其中理论值为样本的添加浓度；相对标准偏差RSD％＝SD/X×100％，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。

按100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg三个浓度毒死蜱对空白白菜、苹果、茶叶样本进行添加回收测定，每个样本做4个平行，用三批不同试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度结果见下表。

表1精密度及准确度试验

以100、200、400μg/kg三个浓度的毒死蜱对空白白菜、苹果、茶叶样本进行添加，平均回收率在70％～110％之间；批内、批间相对标准偏差均小于15％。

3、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、毒死蜱添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。