一种单细胞蛋白检测系统及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，进一步涉及一种单细胞蛋白检测系统，以及应用该检测系统进行检测的方法。

背景技术：

癌症是由细胞增殖、凋亡机制失常而引起的疾病，严重威胁人类生命健康，仅2012年全球新增约1400万癌症患者，约有820万人死于癌症。肿瘤异质性是癌症治疗无法攻克的原因之一，即使是同一个体的肿瘤细胞之间也存在差异，故而单细胞分析在肿瘤异质性的研究中起着重要作用。

蛋白质是构成生物体的重要物质，具有催化功能、结构功能，运输功能，贮存功能，运动功能，防御功能，调节功能，信息传递功能，遗传调控功能等，是生命活动的主要承担着。其中细胞骨架蛋白是指真核细胞中的纤维网络结构蛋白，肿瘤细胞中的骨架蛋白在结构、组装和分布上存在异常，调控肿瘤细胞的过度繁殖、侵袭和迁徙。因此研究蛋白非常重要。

在细胞蛋白的研究中，传统定量检测手段为酶联免疫吸附法(ELISA)，其原理是采用抗原抗体特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量检测，此技术可以评估群体细胞的蛋白情况。而流式细胞术(flow cytometry)是单细胞蛋白分析的主要手段，其原理是通过荧光标记待测蛋白实现单个细胞多参数、快速的定量分析，通过表面荧光分子浓度可控的校准微球可以得到标准曲线，对比标准曲线可以得到蛋白浓度。

然而现有技术存在如下技术缺陷：

(1)ELISA只能检测群体细胞的蛋白情况，不能对单细胞的蛋白进行检测；

(2)流式细胞仪中使用的校准微球只能对细胞膜蛋白进行定量，而在校准微球内部进行荧光分子定量修饰方法尚不成熟，无法使用传统校准微球方法进行单个细胞内骨架蛋白表达的定量检测；

(3)已有一些基于微流控技术的单细胞蛋白检测方法也存在弊端，如微型流式细胞术，微腔微孔序列等，前者缺少校准手段，无法定量检测蛋白；后者通量低，操作复杂。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种单细胞蛋白检测系统及其使用方法，以解决以上所述的至少一项技术问题。

(二)技术方案

根据本发明的一方面，提供一种单细胞蛋白检测系统，包括微流控芯片模块、荧光激发及检测模块，以及压力控制模块，其中，所述微流控芯片模块包括一透明基底以及形成于所述基底上的压缩通道，所述压缩通道配置为其横截面积小于待测细胞的横截面积，以使细胞在压力作用下变形挤过所述压缩通道；所述荧光激发及检测模块，用于对进入压缩通道的细胞进行荧光检测；所述压力控制模块用于提供所述压力以使细胞变形通过压缩通道。

优选的，所述系统还包括中央控制模块，分别与所述压力控制模块和荧光激发及检测模块连接，用于控制所述压力控制模块和荧光激发及检测模块，并且对检测数据进行处理和分析。

优选的，所述压缩通道在基底一侧上还设置有一限光窗口，该窗口宽度小于细胞变形后的长度，以限定所述荧光激发及检测模块的接收光至限光窗口所在范围内。

优选的，所述荧光激发及检测模块包含激发光产生单元与荧光检测单元。

优选的，所述激发光产生单元和荧光检测单元共用光路，且光路与基底平面垂直；或者所述激发光产生单元产生的激发光光路位于基底平面，与荧光检测单元的光路垂直。

优选的，所述激发光产生单元包括激发光源，以激发待测细胞的荧光。

优选的，所述荧光检测单元包括光电倍增管(PMT)，以感应所述细胞受激发后产生的荧光并放大。

优选的，所述压力控制模块设置于所述压缩通道的入口侧，以增加进入所述压缩通道流体的压力；或者所述压力控制模块设置于所述压缩通道的出口侧，以降低流出所述压缩通道流体的压力；或者所述压力控制模块同时设置于所述压缩通道的入口侧和出口侧，以在入口侧增加进入所述压缩通道流体的压力，在出口侧降低流出所述压缩通道流体的压力。

优选的，所述压缩通道的截面为梯形、圆形或者矩形。

优选的，所述透明基底材料为玻璃或者石英。

根据本发明的另一方面，提供一种利用上述任意一种单细胞蛋白检测系统进行检测的方法，包括步骤：

制备经过免疫荧光试剂染色的细胞悬液；

在压力控制模块作用下，细胞悬液中的细胞通过微流控芯片模块的压缩通道；

在所述压缩通道内，细胞受激产生荧光，通过所述荧光激发及检测模块被逐一检测；

通过检测荧光亮度，并比对标准亮度，得到单细胞蛋白含量。

优选的，所述蛋白为骨架蛋白或者胞浆蛋白。

(三)有益效果

通过上述技术方案可得出本发明单细胞蛋白检测系统及其使用方法具有以下有益效果：

(1)本发明将微流控芯片技术与荧光检测技术结合，提出一种基于压缩通道的微型流式细胞术，实现单细胞内骨架蛋白的高通量(高速)定量采集，为细胞生物特性的表征提供可靠的方法和途径；

(2)本发明所使用的微流控芯片选取石英和聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)等材料基于微细加工方法，具有可批量化制造、一次性等特点；

(3)本发明需要的附属设备为常规的倒置显微镜，光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)和摄像头，可以在传统的生物实验室使用，具有可移植性高等优势。

附图说明

图1为本发明实施例的技术方法总流程图；

图2为本发明实施例单细胞蛋白检测系统设计示意图；

图3为本发明实施例单细胞蛋白检测系统中微流控芯片制作流程图；

图4为本发明实施例单细胞蛋白检测系统中微流控芯片制作过程图。

图5为应用本实施例的单细胞蛋白检测系统进行单细胞骨架蛋白检测流程图；

图6为本发明实施例数据处理原理示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。下述参照附图对本发明实施例的说明旨在对本发明的总体发明构思进行解释，而不应当理解为对本发明的一种限制。

微流控技术是指在微观尺寸下控制和检测流体的技术，由于其特征尺寸与细胞大小相匹配，适合单细胞的操纵与表征。本发明实施例将微流控芯片技术与荧光检测技术结合，提出一种基于压缩通道的微型流式细胞术。将骨架蛋白被荧光特异性标记的细胞在压力作用下变形通过横截面小于细胞横截面的压缩通道，此细胞被认为可等效为一段溶液，通过检测荧光亮度，并比对标准亮度，即可得到单细胞蛋白含量。而校准曲线可以通过直接在压缩通道中通入不同浓度的荧光分子溶液得到。此方法可用来高通量定量检测单细胞蛋白。

本发明实施例的具体实施情况如下：

本技术方法总流程包括系统设计(也即单细胞蛋白检测系统的设计)、芯片制作(也即单细胞蛋白检测系统中微流控芯片的制备方法)以及单细胞骨架蛋白检测(也即单细胞蛋白检测系统的应用)，其示意图如图1：

图1为本发明实施例的技术方法总流程图

步骤1，系统设计：

图2为本发明实施例单细胞蛋白检测系统设计示意图，整体单细胞蛋白检测系统包括微流控芯片模块、荧光激发及检测模块和压力控制模块。

微流控芯片的核心是基于聚二甲基硅氧烷的双层压缩通道，所述压缩通道的横截面积小于细胞的横截面积，细胞在压力的作用下变形挤过压缩通道。芯片底部有阻光窗口，用于限定光面积。微流控芯片模块包括一透明基底以及形成于所述基底上的压缩通道，所述压缩通道配置为其横截面积小于待测细胞的横截面积，以使细胞在压力作用下变形挤过所述压缩通道。

本领域技术人员应当知晓，双层通道的材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷，还可以是其它能够浇注后成型的材料；所述限光窗口的材料可以为金属，在窗口上受激光以及荧光不能通过，而在窗口内可以通过。

荧光激发及检测模块，荧光激发及检测模块包含激发光产生单元和荧光检测单元。其中激发光产生单元包含激发光源，用于激发所述细胞，细胞受激发后产生荧光，然后通过荧光检测单元进行检测。

其中，所述激发光产生单元和荧光检测单元共用光路，且光路与基底平面垂直；或者所述激发光产生单元产生的激发光光路路位于基底平面，与荧光检测单元的光路垂直。

所述荧光检测单元包括光电倍增管(PMT)，以感应所述细胞受激发后产生的荧光并放大。

荧光激发及检测模块以使特定波长的激发光分别激发细胞内被荧光分子标记的蛋白以及用于制定校准曲线时使用的不同浓度抗体溶液后产生荧光，被光电倍增管(PMT)(作为荧光检测单元)感应放大并记录。光源设置于所述透明基底上与压缩沟道相对的一侧，或者平行于基底平面，与检测光路垂直，用于激发染色细胞。光电倍增管设置于所述透明基底上与压缩通道相对的一侧，用于对进入压缩通道的细胞进行荧光检测。

压力控制模块，通过调节流体压强，使单个细胞连续通过压缩沟道内的金属窗口进行检测。压力控制模块用于提供压力以使细胞变形通过压缩通道。

单细胞蛋白检测系统还可以包括中央控制平台，基于自定义软件实现各模块的控制，并进行实验数据的处理与分析。该中央控制平台用于连接和控制所述压力控制模块和荧光激发及检测模块，并且对检测数据进行处理和分析。

步骤2，芯片制作：

制作流程包括SU 8-5种子层的制作，SU 8-5压缩通道层制作，SU 8-25细胞通道层制作，PDMS的浇注、翻模，铬的溅射，AZ 1500掩膜的制作，铬窗口的形成以及PDMS与石英的键合，而且本领域技术人员应当知晓，SU8-5、SU8-25以及AZ1500在本实施例中仅起到例示性作用，可以替代的选择其它的负性光刻胶进行制作。

为本发明实施例单细胞蛋白检测系统中微流控芯片制作流程图，流程包括：子步骤A2，SU 8-5种子层的制作：

载玻片在丙酮、乙醇和去离子水中依次清洗，烘干后表面均匀旋转涂敷一层SU-8 5，曝光形成种子层。

子步骤B2，SU 8-5压缩通道层制作：

种子层上再均匀涂敷一层SU 8-5，使用掩模板对准曝光，见图4中子图A。

子步骤C2，SU 8-25细胞通道层制作：

在SU 8-5上均匀涂敷一层SU 8-25，使用掩模板对准曝光，见图4中子图B；显影，见图4中子图C。

子步骤D2，PDMS的浇注、翻模：

在阳模上浇注PDMS，见图4中子图D，经固化、翻模得到有压缩沟道的PDMS层，在沟道两端打孔，见图4中子图E。

子步骤E2，铬的溅射

石英片在丙酮、乙醇和去离子水中依次清洗，烘干后表面均匀溅射一层铬，见图4中子图F。

子步骤F2，AZ 1500掩膜的制作

在溅射有铬的石英片上均匀涂敷一层AZ 1500，放上掩模板对准曝光，见图4中子图G；显影，见图4中子图H。

子步骤G2，铬窗口的形成

经腐蚀处理后，被AZ 1500覆盖的部分被保护，没有AZ 1500的区域被腐蚀掉，最后将多余的AZ 1500洗掉，形成带有铬窗口的石英衬底，见图4中子图I。

子步骤H2，PDMS与石英的键合：

将PDMS器件清洁后，与石英片键合，形成器件，见子图J。

步骤3.单细胞骨架蛋白检测

应用上述系统进行细胞检测检测，包括制备经过免疫荧光试剂染色的细胞悬液；在压力控制模块作用下，细胞悬液中的细胞通过微流控芯片模块的压缩通道；在所述压缩通道内，细胞受激产生荧光，通过所述荧光激发及检测模块被逐一检测；通过检测荧光亮度，并比对标准亮度，得到单细胞蛋白含量。

一般的，可以包括实验准备，数据采集和数据处理三个步骤，其中实验准备主要是准备浓度为10⁶个/ml的经过免疫荧光试剂染色的细胞悬液以及其他测量前的准备工作，数据采集包括细胞信号检测和校准曲线绘制，前者是将已被荧光标记骨架蛋白的细胞注入微流控器件入口，细胞在出口负压作用下吸入压缩通道，由于压缩沟道横截面小于细胞横截面，处于变形状态的细胞完全填充入压缩通道，并在经过铬窗口时被PMT逐一检测。后者是将已知浓度的荧光一抗试剂注入微流控器件入口，并使其充满整个沟道，荧光信号通过铬窗口后PMT检测。数据处理是将在线测量的原始数据在软件平台进行处理，并通过对比标准曲线，得到单细胞内骨架蛋白的浓度。

图5应用本实施例的单细胞蛋白检测系统进行单细胞骨架蛋白检测流程图，流程包括：

子步骤A3，实验准备：

首先进行样本制备，主要是准备浓度为10⁶个/ml的经过免疫荧光试剂染色的细胞悬液。细胞采用免疫荧光染色方法，染色步骤与参数包括：

染色子步骤1：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)制备细胞浓度为10⁶个/ml的细胞悬液100μl。

染色子步骤2：加入100μl4％多聚甲醛固定15分钟；

染色子步骤3：用含有0.2％吐温的PBS清洗3次，加入用PBS配置的含0.2％皂苷的透膜液100μl，透膜15分钟；

染色子步骤4：用含有0.2％吐温的PBS清洗3次，加入一抗：0.2％皂苷＝1∶100，4℃下避光保存过夜；

染色子步骤5：用含有0.2％吐温的PBS清洗3次，上样液重悬至细胞浓度为106个/ml。

荧光显微镜连接PMT和信号放大器，并将微流控器件装载在显微镜载物台上固定。检查器件沟道完整后将压缩通道部分中的铬窗口移到视野中心位置。从微流控器件的出口注入上样液填充器件沟道，除去沟道中的气泡，将压力控制器通过管子接入器件出口位置。

子步骤B3，数据采集

数据采集包括细胞信号检测和校准曲线绘制，前者是将已被荧光标记骨架蛋白的细胞悬液通过注射器注入沟道入口，调节压力控制器使细胞在出口负压作用下被吸入压缩通道，由于压缩沟道横截面小于细胞横截面，处于变形状态的细胞完全填充入压缩通道，并在经过铬窗口时被PMT逐一检测。后者是将已知一定浓度的荧光一抗试剂通过注射器注入沟道入口，并使其充满整个沟道，荧光信号通过铬窗口后被PMT检测。

子步骤C3，数据处理：

数据处理是将对子步骤B3原始数据在软件平台进行处理，细胞在压缩沟道内的长度L与铬窗口宽度W的关系为：

其中是细胞完全填充如压缩沟道后，从刚进入铬窗口到铬窗口被细胞完全覆盖的时间，t_上升对应PMT收集到的信号上升时间。是细胞从铬窗口被细胞完全覆盖到细胞刚要离开隔窗口的时间，t_保持对应PMT收集到的信号平台时间(如图6所示)。由此可以换算出细胞直径大小。再根据由标准曲线所得的荧光信号与蛋白浓度的关系，可以得到单细胞内骨架蛋白的浓度

此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如：

(1)压力驱动部分不局限于出口用负压抽，可以使用从入口泵入的正压方式，还可以使用重力、电致驱动等；

(2)细胞密度不局限于10⁶个/ml，可以用实验需求的细胞密度来代替；

(3)样品处理部分的试剂类型，浓度，时间等条件均可以用其他合适的参数进行替换；

(4)微流控器件中的压缩通道截面不局限为矩形，可以替换为梯形，圆形等结构沟道入口也不局限于圆形，可以替换为正方形、三角形等；

(5)检测对象不限于骨架蛋白，也可以其他可以被荧光染色的胞浆蛋白；

(6)通过增加不同类型的配套滤光片以及PMT，可以同时检测不同波段的荧光信号，做到多个蛋白的同时检测；

(7)限定激发区域的窗口不限于金属材料，也可以使用其他不透光材料，或者使用透镜会聚激发光束；

(8)激发光路与荧光光路不限于特定角度。

至此，已经结合附图对本实施例进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明基于微流控技术的单细胞蛋白检测系统有了清楚的认识。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。