一种利用酶偶联连续监测法测定谷丙转氨酶的多层膜干化学试剂条的制作方法

本发明涉及临床体外检测技术领域，具体涉及谷丙转氨酶的测定方法。

背景技术：

谷丙转氨酶(ALT)又称丙氨酸氨基转移酶，催化L-丙氨酸和L-谷氨酸之间氨基的转移。ALT广泛存在于人体各种组织、器官、肌肉、骨骼中，以肝脏细胞的细胞浆中最多，是肝脏的特异性酶，并被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。ALT临床意义就在于对急性乙型肝炎、慢性肝炎、HBV携者、重型肝炎以及肝硬化、肝癌等一系列病毒性肝炎的诊断和分析，ALT的升高只表示肝脏可能受到了损害。

ALT检测方法众多，临床上测定谷丙转氨酶的试剂可分为液体试剂和干化学试纸两类。同液体试剂相比，化学试剂条具有方便、灵活、污染小、操作简便等优点。

目前，检测谷丙转氨酶的干化学试纸多为国外产品，有的生产工艺复杂，需要专门的技术；有的可能存在某些缺陷，如加样和测定在同一侧可能会造成干扰。而且与其配套的干式生化分析仪多为大中型设备，它将若干个生化项目集中在一台仪器上测定。在测定单一的丙氨酸氨基转移酶项目时，如流动采血车等场合，其功能和速度会受到限制。本发明旨在提供易于携带的试剂条配合独立的小型机，更适合谷丙转氨酶的大规模快速筛查和家庭使用。

技术实现要素：

本发明的内容在于提供一种使用方便、灵敏的可定量测定人体全血、血清或血浆中的谷丙转氨酶(ALT)的干化学试剂条。

本发明提供的定量测定ALT的干化学试剂条，为长条形，一端为手持区，另一端为测试区，其结构如图1和2，它由上支持层1，下支持层2，扩散膜3，滤血膜4、5和反应膜6组成。在上支持层1的测试区开有加样孔7，下支持层2的对应位置开有测试孔8。

本发明中试剂条外壳上支持层1和下支持层2采用高分子聚合材料制成，厚度为0.5mm，上层大小为22×10mm，下层大小为45.5×10mm。上下支持层上的加样孔和测试孔为圆形，内径相同，为4mm。加样孔7用于滴加样品，测试孔8用于观察和测定反应区颜色和吸光度的变化。

本发明中，扩散膜3用来接受样品并向下扩散，优选反应区面积能容纳大约10-30μL血液，通过两层滤血膜，并能将大约6-20μL可测样品转运至底层反应膜。

本发明中，采用的反应方案是酶偶联连续监测法，连续反应方式如下：

在此偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，在340nm处监测吸光度的下降率，从而得出ALT的活性单位。

本发明中，反应试剂包括缓冲体系，TRIS缓冲液，浓度250mM，pH为7.5；底物为L-丙氨酸和α-酮戊二酸钠，其中L-丙氨酸的浓度为1M-1.5M；α-酮戊二酸钠的浓度为50mM-150mM；乳酸脱氢酶(LDH)的浓度为>2KU/L；NADH的浓度>2mM；酶的稳定剂为牛血清白蛋白，在体系中的重量浓度为0.1％-0.25％；Triton X-100和叠氮化钠重量浓度为0.01％。

为定量测定ALT活性，发明人单位还研制了反射式分光光度计(另案申请专利)，与本发明试剂条配套使用。10-30μL血样滴加于试剂条上，反应温度控制在室温，测试在3-5分钟内完成，由仪器自动报告和存储实验结果。

本发明的有益效果是：本发明采用干式试剂条的技术检测谷丙转氨酶(ALT)，操作简单方便，有利于临床的应用和家庭式的推广；本发明以酶偶联的连续检测法为基础，该检测方法普遍认可度高，反应可靠灵敏；本发明中还添加了牛血清白蛋白，保护LDH的活性基团不被破坏，能够有效地提高LDH生化试剂的稳定性。

附图说明

图1为本发明的干化学试剂条图示。

图2为本发明的干化学试剂条解析图示。

图中标号：1为上支持层，2为下支持层，3为扩散膜，4为快速玻璃纤维滤膜，5为混合纤维膜，6为LP反应膜，7为加样孔，8为测试孔。

具体实施方式

在图2的下支持层2上，按顺序由上至下重叠扩散膜3，快速玻璃纤维滤膜4，混合纤维膜5，LP反应膜6，再将上支持层1按压到下支持层2上固定，得到如图1的试剂条。

每层膜的大小控制在6×6mm左右，按压固定后，确保加样孔和测试孔对应于膜中心，不得有偏差，防止样品泄露，影响检测结果。

本发明进行血液样本中ALT的检测方法如下：

1.添加样品：将液体样品或者经过处理的液体样品滴加至本发明试剂条加样孔里；

2.层析渗透反应：静置数分钟等待样品层析渗透过程完成并与底层反应膜接触，进行酶反应；

3.结果判读：本发明由于已将反应膜固定，因而通过仪器对其光学信号改变的测定，即可实现判读，从而实现：了解反应过程是否正常和被检测物ALT的定性定量检测和分析。