用于检测人血清中HER2含量的ELISA试剂盒、使用方法及用途与流程

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种用于检测人血清中HER2含量的ELISA试剂盒、使用方法及用途。
背景技术：
：肿瘤是严重影响公众健康的主要疾病之一，其有效治疗依赖于对肿瘤的早期筛查与及时诊断。肿瘤标志物检测对肿瘤研究和临床治疗实践有着重大作用，已被广泛应用于肿瘤早期筛查、诊断、治疗、疗效评价及预后监测等。人表皮生长因子受体2(HER2)在乳腺癌、胃癌等多种肿瘤中高表达，目前检测肿瘤组织HER2表达水平已作为一个独立指标用于肿瘤的临床诊断和治疗。传统的HER2检测主要通过创伤性的肿瘤组织活检，使用免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)等方法，但是这些方法不能检测手术治疗后患者或复发及转移性肿瘤患者体内的HER2水平。大量研究表明，HER2片段能从肿瘤细胞表面脱落进入血液，肿瘤病人血清中可溶性的HER2胞外区片段与肿瘤组织的HER2表达水平存在明显相关性。有高达50％以上的转移性乳腺癌患者血清中存在HER2水平升高现象(有研究显示大于某个阈值(如15ng/ml)即可提示肿瘤有进展)，且HER2血清水平及其变化趋势可用作肿瘤治疗效果的评价与预后评估指标。因此HER2血清水平检测在肿瘤诊断和治疗中有着重要的应用价值。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于检测人血清中HER2含量的ELISA试剂盒、使用方法及用途。本发明所提供的用于检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒，是一种基于双抗夹心法检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒，包括HER2-ECD标准抗原、抗HER2的捕获抗体(作为包被原)和抗HER2的检测抗体；所述捕获抗体为人源化HuA21抗体，所述检测抗体为经生物素标记的HerA抗体。所述人源化HuA21抗体的重链的氨基酸序列具体如序列表中序列1所示；所述人源化HuA21抗体的轻链的氨基酸序列具体如序列表中序列2所示。所述HerA抗体的重链的氨基酸序列具体如序列表中序列3所示；所述HerA抗体的轻链的氨基酸序列具体如序列表中序列4所示。所述HER2-ECD标准抗原的氨基酸序列具体如序列表中序列5所示。在本发明中，所述HER2-ECD标准抗原具体是通过将核苷酸序列如序列表中序列6所示的HER2-ECD基因在哺乳动物细胞中进行表达获得的。进一步，所述HER2-ECD基因是通过重组表达载体导入所述哺乳动物细胞的；所述重组表达载体具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述HER2-ECD基因后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-HER2-ECD)。其中，所述哺乳动物细胞具体可为CHO细胞。更加具体的，所述HER2-ECD标准抗原是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将所述pSecTag2A-HER2-ECD转入CHO细胞后，培养24小时，用选择培养基(含有0.3mg/mLZeocin)筛选抗性克隆，将抗性克隆扩大培养，离心(8000rpm离心15分钟)，取上清过滤(过0.22μM滤膜)，将所得滤液进行MabselectSure亲和纯化，获得所述HER2-ECD标准抗原。其中，将所述滤液进行MabselectSure亲和纯化具体如下：将MabselectSure胶(GE公司)用PBS平衡后，上样所述滤液，先采用A液(20mM磷酸钠，500mMNaCl，pH5.0)预洗脱5个柱体积，再采用B液(20mM醋酸钠，150mMNaCl，pH3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰，然后30KDa浓缩离心管浓缩获得所述HER2-ECD标准抗原。在本发明中，所述人源化HuA21抗体具体是通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列7所示的人源化HuA21抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列8所示的人源化HuA21抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到的。进一步，所述人源化HuA21抗体的重链的编码基因和所述人源化HuA21抗体的轻链的编码基因是分别通过重组表达载体1和重组表达载体2导入所述哺乳动物细胞的；所述重组表达载体1具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述人源化HuA21抗体的重链的编码基因(序列7)后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-HuA21-1)；所述重组表达载体2具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述人源化HuA21抗体的轻链的编码基因(序列8)后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-HuA21-2)。其中，所述哺乳动物细胞具体可为CHO细胞。更加具体的，所述人源化HuA21抗体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将等摩尔的所述pSecTag2A-HuA21-1和所述pSecTag2A-HuA21-2转入CHO细胞后，培养24小时，用选择培养基(含有0.3mg/mLZeocin)筛选抗性克隆，将抗性克隆扩大培养，取培养上清先后进行ProteinA亲和层析和S200分子筛层析，最后用30KDa超滤离心管浓缩，获得所述人源化HuA21抗体。在本发明中，所述HerA抗体具体是通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列9所示的HerA抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列10所示的HerA抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到的。进一步，所述HerA抗体的重链的编码基因和所述HerA抗体的轻链的编码基因是分别通过重组表达载体3和重组表达载体4导入所述哺乳动物细胞的；所述重组表达载体3具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述HerA抗体的重链的编码基因(序列9)后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-HerA-1)；所述重组表达载体4具体是将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为所述HerA抗体的轻链的编码基因(序列10)后得到的重组表达载体(命名为pSecTag2A-HerA-2)。其中，所述哺乳动物细胞具体可为CHO细胞。更加具体的，所述HerA抗体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将等摩尔的所述pSecTag2A-HerA-1和所述pSecTag2A-HerA-2转入CHO细胞后，培养24小时，用选择培养基(含有0.3mg/mLZeocin)筛选抗性克隆，将抗性克隆扩大培养，取培养上清先后进行ProteinA亲和层析和S200分子筛层析，最后用30KDa超滤离心管浓缩，获得所述HerA抗体。在本发明中，所述检测抗体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将所述HerA抗体与活化的生物素按照摩尔比1：30混合，室温(25℃)放置半小时，随后过分子筛柱去除未结合的生物素，得到经生物素标记的HerA抗体即为所述检测抗体。除了上述物质，所述酶联免疫试剂盒中还可含有如下中的至少一种：96孔酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、辣根过氧化物酶标记亲和素、显色液和终止液。在本发明中，所述铺板缓冲液具体为pH为7.0的磷酸盐缓冲液。所述洗涤液具体为仅含有0.05％体积百分含量Tween20的pH为7.0的磷酸盐缓冲液。所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；所述氯化钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为135mM，所述氯化钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为2.7mM，所述磷酸二氢钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度1.5mM，所述磷酸氢二钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为8mM。所述封闭液具体为仅含有10g/LBSA的所述洗涤液。所述显色液具体为四甲基联苯胺。所述终止液具体为1M硫酸。所述酶联免疫试剂盒在检测人血清中HER2含量中的应用也属于本发明的保护范围。根据需要，所述应用既可为非疾病诊断治疗的应用，也可为疾病诊断治疗的应用。所述酶联免疫试剂盒在如下(A)或(B)中的应用也属于本发明的保护范围：(A)制备用于监测肿瘤发生和/或病程进展的产品；(B)用于监测肿瘤发生和/或病程进展。其中，所述肿瘤为HER2阳性肿瘤，具体可为乳腺癌、胃癌等。另外，所述酶联免疫试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述酶联免疫试剂盒的制备方法，具体可包括如下步骤：通过将核苷酸序列如序列表中序列6所示的HER2-ECD基因在哺乳动物细胞中进行表达获得所述HER2-ECD标准抗原；通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列7所示的人源化HuA21抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列8所示的人源化HuA21抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到所述人源化HuA21抗体；通过将等摩尔的核苷酸序列如序列表中序列9所示的HerA抗体的重链的编码基因和核苷酸序列如序列表中序列10所示的HerA抗体的轻链的编码基因在哺乳动物细胞中进行表达得到所述HerA抗体。实验证明，本发明所提供的基于双抗夹心法检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒可实现对人血清中HER2含量的准确定量检测，且稳定性好。该检测方法可以作为一种无创伤性、简便、迅速的诊断和监测HER2阳性肿瘤病程发展的方法。附图说明图1为本发明ELISA夹心法试剂盒采用的HER2胞外区标准抗原SDS-PAGE电泳图(还原型)。10％胶SDS-PAGE胶。pH3.5洗脱得到的1，2，3号样品。4μl样品/泳道。分子量标准品(M)分子量大小自上而下为(kDa)：113,78,55,45,28。图2为本发明ELISA夹心法试剂盒采用的抗HER2抗体HuA21和HerA抗体的SDS-PAGE电泳图。10％胶SDS-PAGE胶。电泳左图为HuA21非还原(1)和还原(2)的样品，分子量标准品(M)分子量大小自上而下为(kDa)：120，100，80，70，60，50，30，20，15；电泳右图为HerA非还原(1)和还原(2)的样品，分子量标准品(M)分子量大小自上而下为(kDa)：116，66.2，43，31，20.1，14.4；10μg样品/泳道。图3为本发明ELISA夹心法试剂盒采用的抗HER2抗体HuA21和HerA抗体做乳腺癌免疫组织化学法染色的结果。其中，A为人源化HuA21抗体的免疫组织化学法染色的结果；B为HerA抗体的免疫组织化学法染色的结果。图4为以梯度稀释的HER2胞外区抗原标准品浓度为横坐标，本发明夹心法ELISA获得的吸光值为纵坐标，通过双对数坐标进行五参数非线性回归计算得到的标准曲线。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。CHO细胞：来自于中科院上海细胞库。含HER2胞外区(HER2-ECD)基因的表达载体pSecTag2A-HER2-ECD，其构建方法如下：以序列表中序列6所示DNA片段(HER2-ECD标准抗原的编码基因)为模板，采用引物ECD-N和ECD-DK-NotI进行PCR扩增，将所得PCR产物进行SfiI和NotI双酶切，胶回收后与经过同样双酶切的pSecTag2A载体(Invitrogen公司)骨架大片段相连，得到重组质粒。将经测序表明将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)中的SfiI和NotI内切酶识别位点间的小片段替换为“序列6+GGAGACGATGACGATAAG”所示DNA片段后得到的重组表达载体命名为pSecTag2A-HER2-ECD，该载体能够表达序列表中序列5所示HER2-ECD标准抗原，并且该载体携带有Zeocin抗性基因。其中，ECD-N(5’-3’)：AAAGCGGCCCAGCCGGCC-AGCACCCAAGTGTGCACCG(下划线部分为SfiI的识别序列，-后的序列对应于序列表中序列6)；ECD-DK-NotI(5’-3’)：TATATGCGGCCGCCTTATCGTCATCGTCTCC-GGACGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG(下划线部分为NotI的识别序列，-后的序列对应于序列表中序列6)。含人源化HuA21抗体编码基因的表达载体pSecTag2A-HuA21-1。该载体为将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)的酶切位点SfiI和NotI之间的小片段替换为序列表中序列7所示的人源化HuA21抗体的重链的编码基因后得到的重组质粒，该质粒能够表达人源化HuA21抗体的重链(序列1)，并且携带有Zeocin抗性基因。含人源化HuA21抗体编码基因的表达载体pSecTag2A-HuA21-2。该载体为将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)的酶切位点SfiI和NotI之间的小片段替换为序列表中序列8所示的人源化HuA21抗体的轻链的编码基因后得到的重组质粒，该质粒能够表达人源化HuA21抗体的轻链(序列2)，并且携带有Zeocin抗性基因。含HerA抗体编码基因的表达载体pSecTag2A-HerA-1。该载体为将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)的酶切位点SfiI和NotI之间的小片段替换为序列表中序列9所示的HerA抗体的重链的编码基因后得到的重组质粒，该质粒能够表达HerA抗体的重链(序列3)，并且携带有Zeocin抗性基因。含HerA抗体编码基因的表达载体pSecTag2A-HerA-2。该载体为将pSecTag2A载体(Invitrogen公司)的酶切位点SfiI和NotI之间的小片段替换为序列表中序列10所示的HerA抗体的轻链的编码基因后得到的重组质粒，该质粒能够表达HerA抗体的轻链(序列4)，并且携带有Zeocin抗性基因。实施例1、用于检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒的制备及使用方法一、用于检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒的制备本发明所提供的用于检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒，包括HER2-ECD标准抗原、抗HER2的捕获抗体(人源化HuA21抗体)和抗HER2的检测抗体(经生物素标记的HerA抗体)，以及酶标板、铺板缓冲液、洗涤液、封闭液、辣根过氧化物酶标记亲和素、显色液和终止液等。(一)常规器材和试剂1、96孔酶标板(Nunc公司)；2、铺板缓冲液：pH为7.0的磷酸盐缓冲液；3、洗涤液：仅含0.05％体积百分含量Tween20的pH为7.0的磷酸盐缓冲液；4、封闭液：仅含10g/LBSA的洗涤液。5、辣根过氧化物酶标记亲和素；6、显色底物：四甲基联苯胺；7、终止液：1M硫酸。其中，所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；所述氯化钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为135mM，所述氯化钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为2.7mM，所述磷酸二氢钾在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度1.5mM，所述磷酸氢二钠在所述pH为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为8mM。(二)HER2-ECD标准抗原的制备于6cm细胞培养皿中接种CHO细胞，细胞培养至90％密度时转染含HER2胞外区(HER2-ECD)基因的表达载体pSecTag2A-HER2-ECD，转染后培养24小时，胰酶消化传代至10块96孔细胞培养板，加入含有0.3mg/mLZeocin(表达载体pSecTag2A骨架上含有Zeocin抗性基因)的选择性培养基筛选抗性克隆。待细胞克隆长出后(约2周)，根据不同上清中HER2-ECD的含量选出表达量最高的克隆(具体采用美国R&D公司生产的HER2-ECD表达量ELISA检测试剂盒按照说明书进行操作)。将所得高表达的克隆逐级扩大培养，上清合并约1.8L，8000rpm离心15分钟，过0.22μM滤膜。取5mlMabselectSure胶(GE公司)用PBS平衡后将之前过0.22μM滤膜所得滤液上样，上样量为2升培养液对应所得滤液，先用A液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM磷酸钠、500mMNaCl，pH5.0)预洗脱5个柱体积，洗脱流速为1mg/ml，再用B液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：20mM醋酸钠、150mMNaCl，pH3.5)洗脱5个柱体积，洗脱流速为1mg/ml，紫外检测仪监测洗脱峰(会出现唯一的洗脱峰，即目标产物)，预先在收集管中加入100μl2MTris中和液(配制方法：取Tris12.114g，加800ml去离子水溶解，然后用1MHCl调节pH到8.0，最后补去离子水到1000ml。)(每管中加入100μl)，收集洗脱峰，共收集3管，每管约5ml。对收集的样品进行SDS-PAGE电泳，证明所收集的样品与理论分子量相同。合并3管样品，30KDa浓缩离心管浓缩至约4ml，紫外测定浓度OD280/OD260＝5.88/3.60，于是分装成4管，每管约1ml，浓度0.5mg/ml，-80℃保存。纯化后的HER2胞外区(HER2-ECD)标准抗原的SDS-PAGE电泳检测结果(还原型)如图1所示。该结果表明HER2-ECD为单体，分子量110kDa，得到了与理论分子量相同的表达产物，电泳纯度95％左右。进一步将以上所得的纯化后的HER2胞外区(HER2-ECD)标准抗原进行N端和C端序列测定，结果显示纯化所得HER2-ECD序列与序列5相符。(三)两种抗HER2抗体的制备两种抗HER2抗体分别为人源化HuA21抗体和HerA抗体。其中，人源化HuA21抗体是一种靶向HER2胞外区第I、II结构域的新型抗体，HerA抗体是蛋白质结构与已上市药物赫赛汀完全相同的另一种靶向HER2胞外区第IV结构域的重组抗体。这两种抗体具有完全不同的可变区氨基酸序列，并且识别HER2胞外区完全不同的表位。于6cm细胞培养皿中接种CHO细胞，细胞培养至90％密度时转染含人源化HuA21抗体编码基因的表达载体(等摩尔的pSecTag2A-HuA21-1和pSecTag2A-HuA21-2)或含HerA抗体编码基因的表达载体(等摩尔的pSecTag2A-HerA-1和pSecTag2A-HerA-2)。转染后培养24小时，胰酶消化传代至10块96孔细胞培养板，加入含有0.3mg/mLZeocin(表达载体pSecTag2A骨架上含有Zeocin抗性基因)的选择性培养基筛选抗性克隆。待细胞克隆长出后(约2周)，根据不同上清中人源化HuA21抗体、HerA抗体的含量选出表达量最高的克隆(具体为取上清倍比稀释后，加入HER2-ECD包被的酶标板，间接ELISA法显色后选取滴度最高的克隆)。将所得高表达的克隆逐级扩大培养，直至滚瓶培养。取滚瓶培养的上清液，第一步先用ProteinA亲和层析柱纯化。具体操作是：先用PBS平衡ProteinA柱(HiTraprProteinAFF，GE公司)，然后培养上清过柱后，5-10个体积PBS洗去杂蛋白，加盐酸甘氨酸(配方：甘氨酸7.507g，用盐酸调pH至3.0，去离子水定容至500ml)洗脱目的蛋白，合并后继续下一步。第二步是S200分子筛层析柱纯化。具体操作是：先用PBS平衡S200分子筛柱(SPSepharoseFF，GE公司)，然后加第一步纯化样品过柱，严密监测1个体积PBS洗脱后的流出液，待最大吸收峰(280nM紫外吸收器显示)出现后开始收集前3管(每管1ml样品)，合并后继续下一步。最后一步是用30KDa超滤离心管(Millipore公司)浓缩(浓缩前已经跑还原型SDS-PAGE电泳证实重链和轻链分子量无误，且纯度为95％以上，结果见图2)，浓缩后即得到纯化的人源化HuA21抗体、HerA抗体。图2中的左图为HuA21电泳结果：1号泳道为150kDa左右的三条带，从上到下依次为多聚体、抗体单体、非糖基化抗体；2号泳道为50KDa、25KDa两条带，分别为重链和轻链，大小与预期完全相符。右图为HerA电泳结果：1号泳道为150kDa左右的两条带，从上到下依次为抗体单体、非糖基化抗体；2号泳道为50KDa、25KDa两条带，分别为重链和轻链，大小与预期完全相符。进一步将以上所得的纯化后的HuA21、HerA进行N端和C端序列测定，结果显示纯化所得HuA21序列与序列1和2相符；纯化所得HerA序列与序列3和4相符。(四)检测抗体的生物素化标记将上述步骤(三)制备的抗HER2抗体HerA与活化的生物素(EZ-LinkNHS-PEG4-Biotin试剂盒，Pierce公司)按照摩尔比1：30混合，室温(20-25℃)放置半小时，随后过分子筛柱去除未结合的生物素(用的前述EZ-LinkNHS-PEG4-Biotin试剂盒自带的分子筛柱)，即得到生物素标记的HerA检测抗体。(五)两种抗HER2抗体的特异性鉴定为进一步验证上述步骤(三)获得的两种抗HER2抗体具有良好的结合特异性，对其进行了乳腺癌肿瘤标本的免疫组织化学法染色分析。采用0-3+评分系统，2+表示乳腺癌组织中HER2中等表达，3+表示乳腺癌组织中HER2高表达，癌旁组织表示未受到癌细胞侵润的正常乳腺组织，此类组织HER2水平为阴性。将上述步骤三制备的两种抗HER2抗体标记上生物素(具体步骤参照步骤四)，与3+乳腺癌组织及癌旁正常组织进行抗原抗体结合反应，反应完成后用辣根过氧化物酶标记亲和素以及DAB显色底物(ThermoFisher公司)染色，显微镜下观察、拍照。结果显示，不论是HuA21还是HerA抗体，均能对HER2高表达组织进行特异性染色，而癌旁组织则无染色，具体结果见图3。该结果证明了上述步骤(三)制备的两种抗体均有良好的抗原识别特异性。二、步骤一制备的用于检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒的使用方法1、采用HER2-ECD标准抗原制作标准曲线将步骤一制备所得的抗HER2的人源化HuA21抗体用铺板缓冲液(配方见上文)稀释到2μg/ml，每孔加100μl铺板，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，将浓度为0.5mg/ml的步骤一制备的HER2-ECD标准抗原用含10g/LBSA的血清专用样品稀释液稀释到500pg/ml，再用7个Ep管倍比稀释成梯度溶液(表1)，然后按每个浓度两个复孔，每孔100μl加入板内，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，加PBS磷酸缓冲液(铺板缓冲液)稀释至0.25μg/ml的步骤一制备的经生物素标记的HerA抗体，每孔100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加1％(10g/L)BSA(溶剂是PBS缓冲液)稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)100μl。避光显色4分钟，加1M的硫酸终止反应。用BIO-TEKELX-800酶标仪在450nm下读板。各浓度的HER2-ECD标准抗原的吸光值(OD450)如表1所示。以HER2-ECD标准抗原的浓度的对数(以10为底)为横坐标，以OD450值为纵坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线方程为Y＝0.8072*X-1.786，R2＝0.9953，如图4所示。进一步，将各浓度的HER2-ECD标准抗原的吸光值(OD450)代入上述标注曲线方程，即得各HER2-ECD标准抗原浓度下对应的表观浓度，用表观浓度比上对应的实际浓度即得回收率。经计算，各浓度的HER2-ECD标准抗原对应的表观浓度及回收率参见表1。表1不同浓度HER2-ECD标准抗原的吸光值及其换算后的表观浓度与回收率HER2-ECD标准抗原浓度(pg/ml)吸光值(OD450)表观浓度(pg/ml)回收率(％)S1500.02.172492.598S2250.01.473260.8104S3125.00.849120.797S462.50.49761.999S531.30.28532.4104S615.60.14515.398S77.80.0797.8100S80.00.0171.4-2、待测人血清样本中HER2含量的测定将步骤1中的HER2-ECD标准抗原替换为待测人血清样本，将所得的OD450值代入步骤1所得的标准曲线方程，从而获得待测人血清样本中HER2的含量。实施例2、实施例1制备的用于检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒的回收率测定本发明的发明人进一步采用添加标准抗原的正常人血清作为待测样品，测定了实施例1制备的用于检测人血清中HER2含量的酶联免疫试剂盒的回收率。供试的正常人血清共18份(见表2)，这些血清样本来自于安徽省立医院体检中心，志愿者自愿并知情。将步骤一制备所得的抗HER2的人源化HuA21抗体用铺板缓冲液(配方见上文)稀释到2μg/ml，每孔加100μl铺板，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，将浓度为0.5mg/ml的实施例1步骤一制备的HER2-ECD标准抗原用不同编号正常人血清样品稀释20倍后，再用血清专用样品稀释液(同上)稀释200倍，按每个样品两个复孔，每孔100μl加入板内，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，加PBS磷酸缓冲液(铺板缓冲液)稀释至0.25μg/ml的步骤一制备的经生物素标记的HerA抗体，每孔100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加1％(10g/L)BSA(溶剂是PBS缓冲液)稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)100μl。避光显色4分钟，加1M的硫酸终止反应。用BIO-TEKELX-800酶标仪在450nm下读板。将所得的OD450值代入实施例1所得的标准曲线方程，从而获得各样本中HER2的实测含量，用实测含量减去血清中HER2本底含量后再比上实际添加的HER2-ECD标准抗原的浓度即为回收率(也就是用加HER2之后的样品的测得值减去未加HER2的测得值，然后除以添加的HER2量得到回收率)。结果参见表2。平均回收率高达92％。该结果表明采用本发明的试剂盒在夹心法ELISA检测中可以得到让人满意的回收率。表2本发明试剂盒做血清抗原回收率测试结果血清样品名称添加抗原浓度(ng/ml)实测抗原浓度(ng/ml)回收率(％)Serum11125.0109.788Serum29125.0115.492Serum30125.0120.997Serum26125.0110.188Serum24125.0125.9101Serum14125.0118.595Serum8125.0110.789Serum4125.0110.889Serum1125.0125.9101Serum33125.0101.081Serum3125.0104.884Serum7125.0124.9100Serum12125.0115.793Serum19125.0105.584Serum32125.0121.197Serum10125.0124.4100Serum6125.0104.484Serum2125.0105.584平均回收率92实施例3、采用实施例1的试剂盒对临床肿瘤病人血清进行检测供试的血清样本共42份，这些血清样本来自于安徽省立医院肿瘤科、安徽医科大学附属第一医院肿瘤科、蚌埠医学院附属第一医院肿瘤外科，捐献者自愿并知情。这些捐献者均为乳腺癌患者，经相关医院病理科用免疫组化确认肿瘤组织HER2表达均为2+或3+水平，根据国外研究资料，这类病人有一定比例的血清HER2高表达，但中国人群到底有多少比例高表达以及高表达与预后情况的相关性，目前尚无权威数据。本试剂盒的研制有助于填补国内这方面研究的空白。将步骤一制备所得的抗HER2的人源化HuA21抗体用铺板缓冲液(配方见上文)稀释到2μg/ml，每孔加100μl铺板，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，将不同编号供试血清样品用血清专用样品稀释液(同上)稀释200倍，按每个样品两个复孔，每孔100μl加入板内，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，加PBS磷酸缓冲液(铺板缓冲液)稀释至0.25μg/ml的步骤一制备的经生物素标记的HerA抗体，每孔100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加1％(10g/L)BSA(溶剂是PBS缓冲液)稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记亲和素(ThermoFisher公司)100μl，振荡1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，每孔加四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)(ThermoFisher公司)100μl。避光显色4分钟，加1M的硫酸终止反应。用BIO-TEKELX-800酶标仪在450nm下读板。将所得的OD450值代入实施例1所得的标准曲线方程，从而获得各样本中HER2的含量。实验同时设置了西门子公司临床检测试剂盒(产品编号为00915031)作为本发明试剂盒的对照。具体操作及结果判断方法参见试剂盒说明书。结果显示：42个血清样品中，9个西门子公司临床检测试剂盒测得阳性的样品用本发明试剂盒有8个测得血清HER2水平明显偏高，趋势基本一致。另外，所有血清检测偏高的样品均为HER2阳性乳腺癌患者，说明本试剂盒准确度很高。但由于目前尚无中国人群HER2阳性乳腺癌患者血清HER2表达水平参考值，所以本试剂盒只能与健康人的血清HER2水平进行相对比较。42个血清样品比较结果见表3。加粗的样本(Serum1、3、6、25、28、33、34、41)是本发明试剂盒检测水平偏高的样品，标记为斜体的样本(Serum1、3、6、15、25、28、33、34、41)是西门子公司试剂盒检测为阳性(试剂盒说明书认为15.2ng/ml以上为阳性，此结果为西方人群的统计学结果)。虽然我们缺乏中国人群血清阳性临界值的统计学数据，但是可以看出本发明检测的血清HER2含量相对高低与西门子公司试剂盒基本一致。本发明旨在与临床批准的试剂盒比较确认有很高可靠性之后，在中国人群中做大量筛查，为研究中国人血清HER2升高与患HER2高表达肿瘤之间的关系提供一个强有力的工具。目前，本发明检测出的高水平血清HER2样品对应的确实是HER2阳性乳腺癌病人。本发明的另一个意义是它属于液体活检范畴，可做到更快、更早、更方便、高通量的普筛，对乳腺癌早期患者具有非常好的早诊和预警的作用。这一点还要通过未来大量临床样本研究才能证明。表3本发明试剂盒检测临床病人血清的结果当前第1页1 2 3