稳定同位素技术鉴别植物源和动物源L‑亮氨酸的方法与流程

本发明涉及氨基酸鉴别技术领域,具体来说是稳定同位素技术鉴别植物源和动物源L-亮氨酸的方法。

背景技术：

生产安全高品质的食品是确保消费者健康和成功的国内国际贸易的先决条件，并且是国家农业资源可持续发展的关键。美国食品和药物管理局(U.S. FDA)长期以来一直担心中国出口的食品(U.S. FDA, 2007)。他们认为尽管可以看到中国的产品质量的一些进步，但是仍然有一些中国公司继续向美国出口不合格食品。美国报业公会（Ang，2009）在美国食品和农业进口法规和标准(FAIRS)报告中指出：在加工产品的销售中最大的问题和最持久的就是食品和药品掺杂和假冒的问题。

L-亮氨酸是一种人类无法自然合成，必须从饮食或补充剂中获得的必需氨基酸(Leuchtenberger et al., 2005; Parr, 2011)。根据Mawatari等人的观点(2004)，L-亮氨酸是膳食补充剂中最受欢迎的成分之一。食物含有的自然形成的主要完整的蛋白质被认为是一种重要的膳食蛋白质来源，L-亮氨酸可以用作一种特殊的饮食和营养添加剂，旨在提高食品中总蛋白质的生物质量(U.S. FDA, 2009)。

L-亮氨酸作为营养补充剂、膳食补充剂、保健食品添加剂、运动营养、运动补剂、健身补剂和医药原料而被广泛应用(Mawatari et al., 2004; U.S. FDA, 2009; Renee, 2011)。它可以由植物源获得，比如谷物、黑豆、大豆、扁豆和花生，也可以由动物源获得，包括但不仅限于家禽、虾、羊肉和牛肉(Chew, 2009; Amerman, 2010; Shifko, 2010; Marchini, 2012)。

一些欺诈性制造商在这个非常重要的产品的生产过程中使用不同来源的原料，导致出现掺杂或者假冒的产品，这将会给消费者带来经济和健康上的风险。我们知道，某些产品消费者在购买后能够相对容易的确定他们是否被欺骗以至于购买了劣质产品(Klein and Leffler, 1981)。但是，就亮氨酸产品而言，消费者很难通过观察或者使用来辨别L-亮氨酸是来源于植物还是动物，但是它的来源对保证产品安全、消费者健康和成功的国内国际贸易十分重要。

所以，寻找一种能够准确鉴别L-亮氨酸是来源于植物还是动物，鉴别食品真伪，保证食品的安全是十分重要的，提高L-亮氨酸稳定同位素分析(SIA)是在测试食品真伪方面很有前景的一种有效技术，尤其是在传统的分析方法无法提供明确结果的领域(Kelly, 2001)。Hobson和Wassenaar（1999）报道，近些年来，为了调查生态研究的几个方面，越来越多地使用生物材料中自然形成的稳定同位素的测量作为研究工具。

这项技术能够应用于鉴别L-亮氨酸的来源是基于植物和动物中同位素不同(Fry, 2008)。他指出可以应用自然生成的氮稳定同位素的测量在现场条件下估计营养级。根据Kelly的理论（2010），氮-稳定同位素比例在动物生态学中的主要应用在于它和营养级的关系。据估计，从植物到食草动物或者从食草动物到食肉动物的营养级的增加，消费者中的δ15N相对其饮食将会有2.2到3.4‰的增长(Vander Zanden and Rasmussen 2001; McCutchan et al. 2003)。DeNiro和Epstein（1981）最先实验得到消费者比他们的饮食中δ15N高0-10‰，平均值为3‰。因此δ15N常被应用于食物链长度和营养位置的估计，因为其具有可预测的营养富集，即消费者和饮食中的δ15N不同(Minagawa and Wada 1984)。

另外，McClelland和Montoya（2002）也报道，一些氨基酸随着营养转移大量增加，包括L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-脯氨酸，同时，另一组氨基酸（甘氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-苯基丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸）中δ¹⁵N值随着每次营养转移基本不变。这就使δ¹⁵N同位素含量成为区分L-亮氨酸生产中所采用的原料的独特且高度可靠的工具。

因此我们应用δ¹⁵N同位素特征来区分生产L-亮氨酸所采用的原材料是植物源原材料还是动物源原材料。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供稳定同位素技术鉴别植物源和动物源L-亮氨酸的方法，通过本发明对来自植物源和动物源的蛋白质中的δ¹⁵N分析发现，动物源制备的L-亮氨酸中观测到的δ¹⁵N值更高，而植物源制备的L-亮氨酸中观测到的δ¹⁵N值较低，通过比较动物源和植物源的δ¹⁵N的大小，就能确定。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：稳定同位素技术鉴别植物源和动物源L-亮氨酸的方法，包括下述步骤：

（1）选择鉴别的材料，材料来自植物和动物组织，将选择的材料整体标记为样本A；

（2）将样本A中来源不同的材料分别制备为相应的L-亮氨酸产品；

（3）将不同来源的L-亮氨酸产品分别制作成粉末状，接着在40-50℃下烘干6-10小时，然后分别称量L-亮氨酸产品1-10mg；

（4）使用蛋白质标准测试质谱仪的线性度并定义质谱仪对不同元素成分的含量测定的仪器响应；

（5）用连续流同位素比值质谱仪测定样本A和样本B中15N的自然丰度，用δ15N样品表示样品的15N 稳定同位素丰度，δ15N样品 = {(R样品) / (R标准) - 1}*1000；其中R样品=¹⁵N样品/¹⁴N样品；R标准=¹⁵N标准/¹⁴N标准；

（6）对比分析步骤（5）中样本的δ15N。

进一步的，为了更好的实现本发明，所述步骤（1）中植物和动物组织包括大豆、玉米、鸭毛、猪毛和人头发。

进一步的，为了更好的实现本发明，所述蛋白质标准为用标准的结晶牛血清清蛋白，配制成的10mg/ml标准蛋白溶液。

进一步的，为了更好的实现本发明，所述质谱仪为连续流同位素比值质谱CF-IRMS。

本发明利用稳定同位素技术鉴别植物源和动物源L-亮氨酸的方法，对植物源和动物源的δ¹⁵N同位素组成特征进行分析，动物源制备的L-亮氨酸中观测到的δ¹⁵N值更高，而植物源制备的L-亮氨酸中观测到的δ¹⁵N值较低。根据实验结果，我们认为植物源制备的L-亮氨酸中δ¹⁵N同位素在-0.8000‰和3.0000‰之间，而动物源制备的L-亮氨酸中δ¹⁵N同位素在4.0000‰和9.0000‰之间。这说明只要对样本进行测试并将其中的δ¹⁵N值与上面的范围进行对比就能确定其来源。可广泛用于区分L-亮氨酸生产中所使用的不同源原材料。

综上，本发明的有益效果是：

通过本发明对来自植物源和动物源的蛋白质中的δ¹⁵N分析发现，动物源制备的L-亮氨酸中观测到的δ¹⁵N值更高，而植物源制备的L-亮氨酸中观测到的δ¹⁵N值较低，来自植物源的δ¹⁵N一些欺诈性制造商在这个非常重要的产品的生产过程中使用不同来源的原料，导致出现掺杂或者假冒的产品，这将会给消费者带来经济和健康上的风险。

附图说明

图1为猪毛、人头发和鸭毛作为动物源和玉米作为植物源制备的L-亮氨酸中δ¹⁵N同位素成分曲线图；

图2为猪毛、鸭毛和人头发作为动物源制备的L-亮氨酸中δ¹⁵N同位素成分比较曲线图；

图3为大豆和玉米作为植物源原材料中的δ¹⁵N同位素成分比较曲线图；

图4为玉米和猪毛制备的L-亮氨酸中的δ¹⁵N同位素成分比较曲线图；

图5为玉米和人头发样本中的δ¹⁵N同位素成分比较曲线图。

具体实施方式

实施例1：

本实施例中稳定同位素技术鉴别植物源和动物源L-亮氨酸的方法，包括下述步骤：

（1）选择鉴别的材料，选择鉴别的材料，标记成样本A，样本A包括使用玉米、大豆、猪毛、鸭毛和人头发制备的L-亮氨酸；

（3）将上述样本A中各个动植物材料分别制作成粉末状，并将所有粉末状的样本A在50℃下烘干8小时，然后分别称量不同品种的样本5mg；

（4）用标准的结晶牛血清清蛋白，配制成的10mg/ml标准蛋白溶液来测试质谱仪的线性度并定义质谱仪对不同元素成分的含量测定的仪器响应，所使用到的仪器为连续流同位素比值质谱仪CF-IRMS。

（5）用连续流同位素比值质谱仪测定样本A和样本B中¹⁵N的自然丰度，用δ¹⁵N样品表示样品的¹⁵N 稳定同位素丰度，δ¹⁵N样品 = {(R样品) / (R标准) - 1}*1000；其中R样品=¹⁵N样品/¹⁴N样品；R标准=¹⁵N标准/¹⁴N标准；

（6）对比分析步骤（5）中样本的δ¹⁵N。

实施例2：

如图1所示，本实施例按照上述实施例的鉴别方法，分析比较植物源的玉米和动物源的猪毛、人头发以及鸭毛制备的L-亮氨酸中的δ¹⁵N含量，观察得到，与动物源制备的样本相比，玉米制备的L-亮氨酸样本中δ¹⁵N含量最低，最小值为0.6800‰，最大值为0.8704‰，而动物源猪毛、人头发和鸭毛制备的产品中δ¹⁵N含量的最小值分别5.4128‰,8.2415‰ 和5.8752‰。动物源产品中的δ15N含量最小值远远超过玉米原料产品中的δ¹⁵N含量最大值。由猪毛、人头发和鸭毛制备的L-亮氨酸样本中δ¹⁵N值的均值±标准差的值分别为5.4400±0.0157‰,8.3594±0.0635‰和5.9477±0.03952‰，而由玉米制备的L-亮氨酸样本的相应值为0.7979±0.05945‰，F值为4262.8655 (P = 3.7581E-13)，意味着样本差异十分显著。

实施例3：

如图2所示，本实施例按照上述实施例的鉴别方法，分析比较猪毛、鸭毛和人头发的动物源制备的L-亮氨酸中δ¹⁵N同位素成分，仅由动物源制备的L-亮氨酸产品进行了分析以确定不同源制备的产品之间的区别，图2显示了不同样本中的δ¹⁵N的自然丰度，猪毛、鸭毛和人头发制备的L-亮氨酸样本中δ¹⁵N值的均值±标准差分别5.4400±0.0157‰,5.9477±0.03952‰和8.3594±0.0635‰。可以看出尽管这些样本中的δ15N值都很高，但动物的消费模式也对δ15N值发挥了重要作用，人头发样本中的δ¹⁵N含量很高，这说明人比其他动物消费更多富含L-亮氨酸的高蛋白质饮食。还有一点值得注意的是这些样本中获得的δ¹⁵N的均值±标准差值中的最小值> 5.0000±0.0000‰，这说明如果源占据了高的营养级，他们的δ¹⁵N的含量将会更高。这些样本的F值为1250.5352 (P = 1.3707E-8)。尽管样本差异很大，但与图1中的P值 (P = 3.7581E-13)相比，这些差异微不足道。

实施例4：

如图3所示，本实施例按照上述实施例的鉴别方法，分析比较大豆和玉米的植物源原材料中的δ15N同位素成分，从图3中可以看出这些源中最高的均值±标准差值(2.7200±0.03141‰)远低于图2中动物源制备的L-亮氨酸中的最低的均值±标准差值(5.4400±0.0157‰)。这些样本中δ¹⁵N值的变化范围为0.8704‰到2.7744‰，这个范围支持了植物具有更低的δ¹⁵N值这一观点，这些样本的F值为52.1272 (P = 0.0001612)，与由动物源制备的L-亮氨酸中的对应值相比，这个差异并不大。

实施例5：

如图4和图5所示，本实施例按照上述实施例的鉴别方法，分析比较玉米、猪毛和人头发的为植物源制备的L-亮氨酸的δ¹⁵N值和动物源制备的L-亮氨酸中的δ15N同位素成分的值，也就是植物源制备的L-亮氨酸与最低和最高的动物源制备的L-亮氨酸中的δ15N同位素成分的比较，尽管图1中已经显示了动物源和植物源制备的L-亮氨酸中的δ1⁵N值，还是通过图4和图5进一步比较了植物源制备的L-亮氨酸与δ¹⁵N值最高和最低的动物源制备的L-亮氨酸的区别，更清晰地区分植物源和动物源制备的L-亮氨酸中的δ¹⁵N值的不同。植物源制备的L-亮氨酸的δ¹⁵N值的变化范围是0.6800‰到0.8704‰，而δ¹⁵N值最小的动物源制备的L-亮氨酸中的δ¹⁵N值变化范围是5.4128‰到5.4672‰。这些样本的F值是5698.7826 (P = 1.8453E-07)，这是一个极显著的差异，这说明用这项稳定同位素技术来区分制备L-亮氨酸的不同源是可靠度很高的，植物源制备的L-亮氨酸的δ¹⁵N值的均值±标准差值为0.7979±0.05945‰，而δ¹⁵N值最高的动物源制备的L-亮氨酸的δ15N值的均值±标准差值为8.3594±0.06347‰。这些样本的F值为7560.3913 (P = 1.04877E-07)，这说明样本的δ15N值差别很大。这再一次说明了用这项技术来区分不同的来源是可靠的，因此，如果厂商想要通过假冒产品获取更大的利益或者实现其他目的，很容易就可以被检测出来。

由图1-图5进一步分析可以得到以下结论：

一、植物源和动物源制备的L-亮氨酸产品的δ¹⁵N同位素成分差别很大(F = 4262.8655; P = 3.7581E-13)，这表明两种来源中的δ¹⁵N同位素成分区别明显。动物源样本中的δ15N值更高，而植物源样本中的δ15N值较低。

二、仅用动物源中制备的L-亮氨酸产品中的δ15N值的均值±标准差值最小值为>5.0000±0.0000‰。这说明用这些源制备的产品具有很高的δ15N自然丰度。因此，如果样本中检测出较低的δ15N值（例如<3.0000‰），一定不是来自于这些来源。

三、植物源原材料中δ15N同位素成分范围为0.8704‰—2.7744‰。这个δ15N值相对较低，这说明L-亮氨酸产品中如果测试出较高的δ15N值，比如>3.5‰，这个产品一定不是来源于这些原材料。

四、比较植物源制备的L-亮氨酸与δ15N含量最低和最高的动物源制备的L-亮氨酸的δ15N同位素成分，观察样本间的区别，植物源制备的L-亮氨酸样本的δ15N值的变化范围为0.6800‰到0.8704‰，而δ15N含量最低的动物源制备的L-亮氨酸样本的δ15N值变化范围为5.4128‰到5.4672‰，这说明植物源制备的L-亮氨酸的δ15N值远低于动物源制备的L-亮氨酸。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。