一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合及其制备方法和检测试剂盒与流程

本发明涉及体外诊断医学检验领域。具体地说，本发明涉及一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合及其制备方法和包括其的肌红蛋白检测试剂盒。

背景技术：

肌红蛋白(Myoglobin,MYO)是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，大量存在于横纹肌(骨骼肌以及心肌)细胞中的血红素蛋白。心肌或者骨骼肌受损时，肌红蛋白会因为细胞膜的破裂而被释放到血管系统，可以在血液中检测到。

在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)患者发病后1～3h血内肌红蛋白浓度迅速升高，12h时几乎所有AMI患者的肌红蛋白都升高。因此胸痛发作6～12h内肌红蛋白不升高是排除AMI良好的指标(即阴性指标)，同时也是早期检测AMI最快的指标。由于在AMI后血中肌红蛋白很快从肾脏清除，发病18～30h内可完全恢复到正常水平，所以肌红蛋白的测定有助于在AMI病程中观察患者有无再梗死或梗死再扩展病症，同时也是溶栓治疗中判断有无再灌注的较敏感而准确的指标。

目前临床上肌红蛋白的检测方法主要有胶体金法、免疫比浊法、免疫荧光法、化学发光免疫分析法等。胶体金法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大，无法持续监控患者肌红蛋白的水平；免疫比浊法的缺点在于试剂灵敏度较差，对于心肌梗死的判断不利；免疫荧光法但依然存在反应时间较长，对环境要求较高，容易受空气尘埃影响，且多为96人份/盒，使用稀土标记物等缺点也使得此免疫方法无法大规模使用。化学发光免疫分析法法是一种较为先进的免疫学方法，具有反应时间短、灵敏度高、特异性好、线性范围宽、重复性好等优点，标记物稳定性好，在保证检测速度的前提下，也能达到检测高通量。根据目前肌红蛋白临床的应用情况，市场应用前景最好且诊断最可靠的方法学为化学发光免疫分析法。

虽然目前中国市场上已有注册批准的肌红蛋白化学发光免疫分析法测定试剂盒，但多为进口试剂，成本较高，且试剂盒的制备方法和相关材料均作为保密资料，未被公开，不利于肌红蛋白检测在社区基层医院的推广。国产肌红蛋白试剂盒重复性较差，批间差异难控，且灵敏度较低，临床应用前景较差。

因此，本领域急需一种具有检测灵敏度高、特异性好、重复性高等优点的肌红蛋白检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物及其制备方法，利用所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物检测肌红蛋白的灵敏度大幅提高。

本发明还有一目的是提供包括上述肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的肌红蛋白检测试剂盒。

本发明再有一目的是提供利用本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物或肌红蛋白检测试剂盒检测肌红蛋白的方法。

本发明公开了一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物及其制备方法和包括所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的肌红蛋白检测试剂盒。本发明一种酶标记检测信号放大方法，即，碱性磷酸酶与肌红蛋白单克隆抗体交联后，标记在胶体金上，作为酶标记复合物。本发明的肌红蛋白检测试剂盒采用胶体金上包被肌红蛋白单克隆抗体酶标记物，从而增加检测的反应信号，具有检测灵敏度高、特异性强、药物干扰小、结果稳定性好等优点；从而可以大规模适用于心血管疾病临床辅助诊断。

在第一方面，本发明提供一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物由肌红蛋白单克隆抗体酶标记物和胶体金组成，其中肌红蛋白单克隆抗体酶标记物标记在胶体金上。

在优选的实施方式中，所述酶是碱性磷酸酶。

在优选的实施方式中，所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物通过以下方法制得：

1)将肌红蛋白单克隆抗体与酶交联，制得抗体酶标记物；

2)将步骤1)获得的抗体酶标记物加入胶体金溶液中，从而获得肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物。

具体地说，所述制备方法包括以下步骤：

a)肌红蛋白单克隆抗体与酶通过戊二醛法交联反应，制得抗体酶标记物；

b)在氯化金溶液中加入柠檬酸三钠，制备胶体金溶液；

c)将步骤a)反应后的抗体酶标记物加入至胶体金溶液中，混匀，加入封闭液；

d)将步骤c)处理的抗体标记物经洗涤后，保存在磁微粒保存液中。

在另一优选的实施方式中，所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记物是将肌红蛋白单克隆抗体与碱性磷酸酶通过戊二醛法进行交联。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶交联抗体时，所述戊二醛、碱性磷酸酶的浓度分别为2％～10％、2～20mg/mL，优选5％、10mg/mL。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶交联抗体时，所述碱性磷酸酶与抗体质量比例为3:1～1:3，优选质量比例为1:1。

在另一优选的实施方式中，胶体金的制备时，1％氯化金与1％柠檬酸三钠体积比例为1:1～1:4，优选质量比例为1:2。

在另一优选的实施方式中，胶体金的制备时，胶体金的pH值为8.0～11.0，优选质量比例为胶体金的pH值为8.5。

在另一优选的实施方式中，标记物再包被在胶体金时，所述肌红蛋白单克隆抗体酶结合物的预稀释浓度为0.05～0.5mg/mL，优选质量比例为预稀释浓度为0.2mg/mL。

在第二方面，本发明提供一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)将肌红蛋白单克隆抗体与酶交联，制得抗体酶标记物；

2)将步骤1)获得的抗体酶标记物加入胶体金溶液中，从而获得肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物。

在具体的实施方式中，所述方法包括：

a)肌红蛋白单克隆抗体与酶通过戊二醛法交联反应，制得抗体酶标记物；

b)在氯化金溶液中加入柠檬酸三钠，制备胶体金溶液。

c)将步骤a)反应后的抗体酶标记物加入至胶体金溶液中，混匀，加入封闭液；

d)将步骤c)处理的抗体标记物经洗涤后，保存在磁微粒保存液中。

在优选的实施方式中，步骤a)中的所述酶是碱性磷酸酶。

在另一优选的实施方式中，所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记物是将肌红蛋白单克隆抗体与碱性磷酸酶通过戊二醛法进行交联；具体操作为：将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，室温静置过夜，生理盐水透析后，加入肌红蛋白单克隆抗体，50mM pH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜，加入甘氨酸，室温反应2小时，等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃2小时，4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mM pH7.40磷酸缓冲液中，对其透析过夜，加入等体积甘油，置于-20℃保存。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶交联抗体时，所述戊二醛、碱性磷酸酶的浓度分别为2％～10％、2～20mg/mL，优选5％、10mg/mL。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶交联抗体时，所述碱性磷酸酶与抗体质量比例为3:1～1:3，优选质量比例为1:1。

在另一优选的实施方式中，胶体金的制备时，1％氯化金与1％柠檬酸三钠体积比例为1:1～1:4，优选质量比例为1:2。胶体金的制备方法的具体操作为：将1％氯化金溶液加入纯化水中，混匀，搅拌加热至沸腾。按照1％氯化金与1％柠檬酸三钠1:2的体积比例加入1％柠檬酸三钠溶液，冷却到室温，制成胶体金溶液。

在另一优选的实施方式中，胶体金的制备时，所述胶体金的pH值为8.0～11.0，优选质量比例为胶体金的pH值为8.5。

在另一优选的实施方式中，交联物再包被在胶体金时，所述肌红蛋白单克隆抗体酶结合物的预稀释浓度为0.05～0.5mg/mL，优选质量比例为预稀释浓度为0.2mg/mL。

在另一优选的实施方式中，肌红蛋白单克隆抗体酶结合物复合物的制备方法的具体操作为：用饱和K₂CO₃溶液调节胶体金溶液pH值至8.5，加入0.2mg/mL的肌红蛋白单克隆抗体酶结合物，搅拌后加入10％BSA溶液，混匀。经洗涤，离心后，加入含有0.1％PEG20000稀释缓冲液，2～8℃保存。

在第三方面，本发明提供本发明第一方面所述的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，或本发明第二方面所述的方法制备的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物在检测肌红蛋白或制备肌红蛋白检测试剂盒中的用途。

在第三方面，本发明提供一种肌红蛋白检测试剂盒，所述试剂盒装有：本发明第一方面所述的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，或本发明第二方面所述的方法制备的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物。

在另一优选的实施方式中，所述肌红蛋白检测试剂盒还装有：肌红蛋白单克隆抗体磁微粒；肌红蛋白定标品；化学发光底物；和稀释液及使用说明书。

在另一优选的实施方式中，所述化学发光底物的主要成分为1,2-二氧杂环丁烷衍生物，为酶促化学发光底物。

在另一优选的实施方式中，所述1,2-二氧杂环丁烷衍生物为AMPPD(3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷)、CDP-star。

在另一优选的实施方式中，所述的磁微粒试剂的主要成分是超顺磁性微粒，其粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

在第四方面，本发明提供制备肌红蛋白检测试剂盒的方法，所述的方法包括：将本发明第一方面所述的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，或本发明第二方面所述的方法制备的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物制成肌红蛋白检测试剂盒。

在具体的实施方式中，所述方法包括：将本发明第一方面所述的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，或本发明第二方面所述的方法制备的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物；肌红蛋白单克隆抗体磁微粒；肌红蛋白定标品；化学发光底物；和稀释液制成肌红蛋白检测试剂盒。所述试剂盒还可装有使用说明书以及合适的移液器件。

在另一优选的实施方式中，所述的肌红蛋白单克隆抗体磁微粒的制备，是将活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基的磁微粒通过共价交联的方式与肌红蛋白单克隆抗体交联，经洗涤封闭后，制得肌红蛋白单克隆抗体磁微粒，最终贮存于含有0.1～1％的BSA溶液中，2～8℃保存备用。

在另一优选的实施方式中，所述的磁微粒试剂稀释液的配方为：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl、50～300mM NaCl、0.5～2％BSA、2～15％甘油、0.05～0.1％NaN₃。

在另一优选的实施方式中，肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的稀释液的配方为：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl、50～300mM NaCl、0.5～2％BSA、5～15％甘油、3％～10％蔗糖、0.05～0.5％吐温-20、0.05～0.5％PEG20000、0.05～0.2％ProClin-300。

在另一优选的实施方式中，所述的肌红蛋白定标品的浓度分别为150～250ng/mL和1200～1800ng/mL。

在另一优选的实施方式中，所述的肌红蛋白定标品的稀释液配方为：10～100mM pH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mM NaCl，0.1～2％BSA，0.05～0.2％ProClin-300。

在另一优选的实施方式中，所述的洗涤液配方为：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl，50～300mM NaCl，0.1～1％曲拉通X-100，0.05～0.2％ProClin-300。

在第五方面，本发明提供一种检测肌红蛋白的方法，所述方法包括利用本发明第一方面所述的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，或本发明第二方面所述的方法制备的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，或本发明第三方面所述的肌红蛋白检测试剂盒检测样品中的肌红蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的制备工艺流程。

图2显示了肌红蛋白检测的反应原理图。

具体实施方式

发明人在实践中发现，胶体金方法无法准确进行定量，且批间差异较大，因此仅能用于定性，而碱性磷酸酶直接标记肌红蛋白单克隆抗体对于肌红蛋白的检测灵敏度也不能令人满意。经过广泛而深入的研究，发明人出乎意料地发现，采用碱性磷酸酶与肌红蛋白单克隆抗体交联后，将标记物再包被在胶体金上得到的酶标记复合物，可以显著提高肌红蛋白的检测灵敏度，同时确保试剂的特异性。在此基础上完成了本发明。

本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物及其制备方法

基于以上的发现，本发明提供一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物由肌红蛋白单克隆抗体酶标记物和胶体金组成，其中肌红蛋白单克隆抗体酶标记物标记在胶体金上。

鉴于本领域，例如化学发光免疫分析领域的公知常识法以及本发明的教导，本领域技术人员可以根据实际需要选择肌红蛋白单克隆抗体酶标记物中的酶。在具体的实施方式中，所述酶是碱性磷酸酶。

相应地，本发明还提供了所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)将肌红蛋白单克隆抗体与酶交联，制得抗体酶标记物；

2)将步骤1)获得的抗体酶标记物加入胶体金溶液中，从而获得肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物。

在具体的实施方式中，所述方法包括：

a)肌红蛋白单克隆抗体与酶通过戊二醛法交联反应，制得抗体酶标记物；

b)在氯化金溶液中加入柠檬酸三钠，制备胶体金溶液；

c)将步骤a)反应后的抗体酶标记物加入至胶体金溶液中，混匀，加入封闭液；

d)将步骤c)处理的抗体标记物经洗涤后，保存在磁微粒保存液中。

本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物可以用于检测肌红蛋白或制备肌红蛋白检测试剂盒，从而显著提高检测肌红蛋白时的灵敏度。

在优选的实施方式中，所述酶是碱性磷酸酶。

在另一优选的实施方式中，所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记物是将肌红蛋白单克隆抗体与碱性磷酸酶通过戊二醛法进行交联。

在具体的实施方式中，所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记物和肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的制备过程中采用以下工艺参数。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶交联抗体时，所述戊二醛、碱性磷酸酶的浓度分别为2％～10％、2～20mg/mL，优选5％、10mg/mL。

在另一优选的实施方式中，碱性磷酸酶交联抗体时，所述碱性磷酸酶与抗体质量比例为3:1～1:3，优选质量比例为1:1。

在另一优选的实施方式中，胶体金的制备时，所述1％氯化金与1％柠檬酸三钠体积比例为1:1～1:4，优选质量比例为1:2。

在另一优选的实施方式中，胶体金的制备时，所述胶体金的pH值为8.0～11.0，优选质量比例为胶体金的pH值为8.5。

在另一优选的实施方式中，交联物再包被胶体金时，所述肌红蛋白单克隆抗体酶结合物的预稀释浓度为0.05～0.5mg/mL，优选质量比例为预稀释浓度为0.2mg/mL。

同样，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以合理确定所用的磁微粒。例如，在具体的实施方式中，磁微粒的主要成分是超顺磁性微粒，粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

在具体的实施方式中，所述的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的制备，是碱性磷酸酶与肌红蛋白单克隆抗体通过戊二醛法交联后，标记物再包被在胶体金上，经洗涤，离心后，溶解在含有0.1％PEG20000稀释液中，作为酶标记复合物，2～8℃保存备用。

本发明的肌红蛋白检测试剂盒

本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物可以用于检测肌红蛋白或制备肌红蛋白检测试剂盒，从而显著提高检测肌红蛋白时的灵敏度。因此，本发明进一步提供了一种肌红蛋白检测试剂盒，所述试剂盒装有本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员可以确定所述肌红蛋白检测试剂盒中的其它组分，例如，在具体的实施方式中，本发明的肌红蛋白检测试剂盒还可装有：肌红蛋白单克隆抗体磁微粒；肌红蛋白定标品；化学发光底物；稀释液及使用说明书。

在优选的实施方式中，所述肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物中的酶是碱性磷酸酶。

相应地，本发明的肌红蛋白检测试剂盒中的所述化学发光底物的主要成分可以为1,2-二氧杂环丁烷衍生物，为酶促化学发光底物。在优选的实施方式中，所述1,2-二氧杂环丁烷衍生物为AMPPD(3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷)、CDP-star。而本发明的肌红蛋白检测试剂盒中的磁微粒试剂的主要成分可以是超顺磁性微粒，其粒径为800nm～3μm，主要的活性功能基团为羧基、氨基或苯甲磺酰基。

本发明的肌红蛋白检测试剂盒可如下所示进行制备，包括：将本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，或本发明的方法制备的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物制成肌红蛋白检测试剂盒。具体地说，本发明的肌红蛋白检测试剂盒的制备方法包括：将本发明的肌红蛋白单克隆抗体磁微粒；肌红蛋白定标品；化学发光底物；洗涤液和相应的稀释液制成肌红蛋白检测试剂盒。所述检测试剂盒中还可装有使用说明书以及用于移液的合适器件。

在具体的实施方式中，所述的磁微粒试剂稀释液的配方为：10～100mM pH7.2～7.8Tris-HCl、50～300mM NaCl、0.5～2％BSA、2～15％甘油、0.05～0.1％NaN3。

在具体的实施方式中，肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的制备方法，具体为：将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，室温静置过夜，生理盐水透析后，加入肌红蛋白单克隆抗体，50mM pH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜，加入甘氨酸，室温反应2小时，等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃2小时，4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mM pH7.40磷酸缓冲液中，对其透析过夜，加入等体积甘油，置于-20℃保存。将1％氯化金溶液加入纯化水中，混匀，搅拌加热至沸腾。按照1％氯化金与1％柠檬酸三钠1:2的体积比例加入1％柠檬酸三钠溶液，冷却到室温，制成胶体金溶液。用饱和K2CO3溶液调节胶体金溶液pH值至8.5，加入0.2mg/mL的肌红蛋白单克隆抗体酶结合物，搅拌后加入10％BSA溶液，混匀。经洗涤，离心后，加入含有0.1％PEG20000稀释缓冲液，2～8℃保存。

在具体的实施方式中，肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的稀释液的配方为：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl、50～300mM NaCl、0.5～2％BSA、5～15％甘油、3％～10％蔗糖、0.05～0.5％吐温-20、0.05～0.5％PEG20000、0.05～0.2％ProClin-300；所述的肌红蛋白定标品的浓度分别为150～250ng/mL和1200～1800ng/mL；所述的肌红蛋白定标品的稀释液配方为：10～100mM pH7.2～7.8Tris-HCl，50～300mM NaCl，0.1～2％BSA，0.05～0.2％ProClin-300；所述的洗涤液配方为：10～100mM pH 7.2～7.8Tris-HCl，50～300mM NaCl，0.1～1％曲拉通X-100，0.05～0.2％ProClin-300。

本发明的肌红蛋白的检测方法

在本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物以及包含其的肌红蛋白检测试剂盒的基础上，本发明还提供一种检测肌红蛋白的方法，所述方法利用本发明的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，或本发明的肌红蛋白检测试剂盒检测样品中的肌红蛋白。

本领域技术人员知晓，本发明的肌红蛋白检测方法可以用于诊断目的，但不限于诊断目的，例如，可用于科研目的等等。

本发明的优点

1)本发明包含的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物联用了酶交联工艺以及胶体金交联工艺，从而显著提高了反应信号，从而提高了检测灵敏度；

2)包含本发明肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的试剂盒的检测灵敏度高，最低检测限能达到0.5ng/mL；

3)本发明的试剂盒特异性强；胆红素、血红蛋白、乳糜颗粒、类风湿因子(RF)、抗核抗体(ANA)、人抗鼠抗体(HAMA)对肌红蛋白测定结果均无明显干扰；

4)本发明的试剂盒药物干扰小；对于目前市面上常见的且临床使用普遍的心血管药物，即，盐酸多巴胺、阿司匹林、阿替洛尔、盐酸氟桂利嗪、苯妥英钠、双氯芬酸钠、土霉素、硝苯地平、对乙酰氨基酚、盐酸氨溴索、茶碱、甲基多巴和地高辛，本发明的试剂盒对其均几乎无明显干扰。

5)本发明的试剂盒测定结果稳定性好；碱性磷酸酶更稳定、测定结果的重复性更好，1,2-二氧杂环丁烷衍生物具有较长的发光时间，发光信号可稳定超过20分钟以上；信号强度高，便于光电倍增管检测；抗干扰能力强，不易污染。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

材料与方法

材料

以下实施例中所用的各种试剂均是市售可得的试剂，例如化学试剂购自国药集团；碱性磷酸酶可以购自BBI公司，但不限于此。

方法

1.肌红蛋白磁微粒试剂的制备

肌红蛋白磁微粒试剂稀释液配方：

将肌红蛋白单克隆抗体磁微粒用磁微粒稀释液稀释至0.2～0.8mg/mL，室温充分混匀至少30分钟，制得肌红蛋白磁微粒试剂。

2.肌红蛋白单克隆抗体磁微粒的制备

1)取10mg活性功能基团为羧基的1.0μm磁微粒，用50mM pH6.0的MES缓冲液洗涤2次；

2)磁吸后去上清液，加入0.5mL的50mM pH 6.0的MES缓冲液混匀，再加入0.5mL 25mg/mL碳二亚胺(EDC)溶液，充分混匀，室温反应30分钟；

3)加入40μg肌红蛋白单克隆抗体，再用50mM pH 6.0的MES缓冲液定容至1mL，充分混匀，37℃反应过夜；

4)用含有50mM pH 7.8Tris-HCl，150mM NaCl，1％BSA溶液洗涤2次；

5)加入2mL含有50mM pH 7.8Tris-HCl，150mM NaCl，1％BSA溶液，充分混匀，37℃封闭过夜；

6)用含有50mM pH 7.8Tris-HCl，150mM NaCl，1％BSA溶液洗涤2次；

7)加入2mL含有50mM pH 7.8Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％BSA溶液，充分混匀；

8)2～8℃保存，制得肌红蛋白单克隆抗体磁微粒。

3.肌红蛋白酶试剂的制备

肌红蛋白酶试剂稀释液配方：

将肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物用酶稀释液稀释至1:1000～1:5000，室温充分混匀至少30分钟，制得肌红蛋白酶试剂。

4.肌红蛋白定标品的制备

肌红蛋白定标品稀释液配方：

将重组肌红蛋白抗原用定标品稀释液分别稀释至200ng/mL和1500ng/mL，室温充分混匀至少30分钟，制得肌红蛋白定标品。通过多次对校准品和定标品同时测定，建立肌红蛋白试剂盒主曲线，并对肌红蛋白定标品进行赋值，即为肌红蛋白定标品的制备。

5.洗涤液的制备

洗涤液配方：

按配方配制洗涤液，室温充分混匀至少30分钟，制得洗涤液。

6.肌红蛋白的检测方法

1)加入10μl血清或血浆样本、100μl磁微粒试剂、100μl酶试剂；

2)37℃反应15分钟；

3)磁吸后去上清液，加入300μl洗涤液；

4)重复步骤3)2次；

5)磁吸后去上清液，加入300μl化学发光底物；

6)37℃下反应10分钟；

7)光电倍增管(PMT)读取相对发光单位(RLU)，自动计算浓度值。

实施例1.肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的制备

1)将碱性磷酸酶溶于终浓度5％戊二醛溶液中，使得碱性磷酸酶的浓度为10mg/mL；

2)室温静置过夜；

3)用生理盐水(体积比大于1:200)透析至少4小时；

4)取出透析后的碱性磷酸酶，按照质量1:1的比例加入肌红蛋白单克隆抗体，充分混匀；

5)50mM pH 9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中透析过夜；

6)取出透析液，按照体积比1:1000加入1M甘氨酸溶液，混匀，终止反应2小时；

7)等体积加入饱和硫酸铵，2～8℃保存2小时；

8)4000rpm离心去上清，沉淀溶于50mM pH 7.40磷酸缓冲液中；

9)50mM pH 7.40磷酸缓冲液中透析过夜；

10)取出透析液加入等体积的甘油，制得碱性磷酸酶标记肌红蛋白单克隆抗体，置于-20℃保存。

11)将1％氯化金溶液加入纯化水中，混匀，搅拌加热至沸腾。

12)按照1％氯化金与1％柠檬酸三钠1:2的体积比例加入1％柠檬酸三钠溶液，冷却到室温，制成胶体金溶液。

13)用饱和K₂CO₃溶液调节胶体金溶液pH值至8.5，加入0.2mg/mL的肌红蛋白单克隆抗体酶结合物，搅拌后加入10％BSA溶液，混匀。经洗涤，离心后，加入含有0.1％PEG20000稀释缓冲液，2～8℃保存。

实施例2.肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物的灵敏度检测

利用实施例1所得的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，如材料与方法所述进行灵敏度检测，结果如下表所示：

注：

(1)传统肌红蛋白单克隆抗体酶标记物；

(2)利用胶体金包被的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物。

从上表可以看出，使用本发明的胶体金包被的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物，其灵敏度(S/N值)比传统肌红蛋白单克隆抗体酶标记物提高了1.92倍。此外，其检测的功能灵敏度为0.5ng/mL，显著低于传统肌红蛋白单克隆抗体酶标记物。综上所述，使用本发明的胶体金包被的肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合物可以明显提高肌红蛋白的灵敏度。

实施例3.本发明所述的试剂盒分析性能

1)最低检测限：本试剂盒的最低检测限不高于0.5ng/mL。

测定空白样本20次，计算20次测定结果均值(M)和标准差(SD)，M+2SD对应的浓度即为试剂盒的最低检测限。

2)准确度：本试剂盒的回收率在85％～115％之间。

3)重复性：本试剂盒的相对变异系数(CV)≤8％。

4)线性范围：本试剂盒的线性范围为0.5～2500ng/mL。

将接近线性范围上限的高值样本进行系列稀释，计算实测值与理论稀释度之间的线性相关系数r，结果应大于或等于0.99。

5)批间差：本试剂盒批间的相对变异系数(CV)≤15％。

6)药物干扰：

测定临床中常用的若干种心血管药物，不同浓度下的药物干扰结果见下表。

7)稳定性：本试剂盒2～8℃保存12个月，试剂盒分析性能仍稳定。

实施例4.本发明所述的试剂盒与现有进口试剂盒的临床比对结果

共检测323例临床样本，同时对本发明所述的试剂盒与现有的进口肌红蛋白检测试剂盒(Beckman公司)进行检测，通过Medcalc统计软件进行相关性及一致性分析。

1)相关性分析

以现有进口试剂A的临床测定结果为X轴，本发明所述的试剂盒的临床测定结果为Y轴，绘制散点图，进行相关性分析，其相关性方程为：y＝0.9879x-8.7484(P<0.001)；相关性系数：r＝0.9940，两者的测定结果相关性良好。

2)一致性分析

采用Bland-Altman统计学方法对两组测定结果进行分析，以每个样本的测定结果的比值作为纵坐标，两者的测定结果的均值作为横坐标作图。计算所有比值的平均值(A)及标准差(SD)，并根据公式A±1.96SD得到95％的一致性界限范围。本次临床试验中A＝0.95，SD＝0.24，因此95％的一致性界限范围为：0.47-1.42。上述结果显示，95.05％(307/323)的测定结果在上述范围内，两者测定结果在统计学上有着一致性。

3)总结：

现有的Beckman公司的肌红蛋白检测试剂盒是目前临床上用于肌红蛋白测定市场份额最高的产品之一，其试剂盒的临床性能已被临床广泛接受。本发明所述的试剂盒在临床试验比对中，与进口试剂的结果相关性及一致性高度吻合，能满足目前市场上对肌红蛋白测定的需求，且生产成本远低于该试剂盒。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。