一种用于检测维格列汀中间体中对映异构体的方法与流程

本发明属于医药技术领域，涉及一种用于检测维格列汀中间体中对映异构体的方法，具体涉及(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈中对映异构体的高效液相检测方法。

背景技术：

维格列汀(Vildagliptin)，化学名为(S)-1-[2-(3-羟基-1-金刚烷-1-基氨基]乙酰基]吡咯烷-2-甲腈。维格列汀通过与DPP-4结合形成DPP-4复合物而抑制该酶的活性，在提高GLP-l浓度，促使胰岛B细胞产生胰岛素的同时，降低胰高血糖素浓度，从而降低血糖，且对体重无明显影响。维格列汀的化学结构式为：

健康人体药动学研究表明，口服维格列汀吸收迅速，生物利用度约为85％。达峰时间为给药后1～2h，血浆半衰期为1.5～4.5h，蛋白结合率低(4％～17％)。其体内过程具有线性药代动力学特征，多次口服给药后未出现药物蓄积，其药动学参数不受食物影响。

经文献检索，所报道的维格列汀合成主要是以L-脯氨酰胺或L-脯氨酸为起始物料两种路线：(1)以L-脯氨酸为起始物料合成路线：该路线以L-脯氨酸为原料，经酰化、羧基转变为酰胺基，酰胺基脱水得关键中间体(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，最后和3-氨基-1-金刚烷醇反应得到维格列汀。(2)以L-脯氨酰胺为起始物料合成路线：该路线以L-脯氨酰胺为起始原料，与氯乙酰氯反应，中间体酰胺化合物脱水反应制备得关键中间体(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，该中间体与3-氨基-1-金刚烷醇反应制备得维格列汀粗品，再经精制等步骤得维格列汀。两条路线的关键中间体均为(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，该(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的化学结构式为：

在维格列汀成品质量标准中，对其对映异构体R-维格列汀进行了质量控制，标准为不超过0.5％。而其对映异构体来源于物料L-脯氨酰胺中的对映异构体D-脯氨酰胺或L-脯氨酸中的对映异构体D-脯氨酸，其进一步反应后导致维格列汀关键中间体(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的对映异构体(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的产生。为确保临床用药的安全有效，根据手性药物指导原则，有必要对维格列汀关键中间体(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈进行有效的控制。

现有文献报道中间体(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的手性有效控制方法较少，中国医药工业杂志(2012,43(12)：965-967)提到采用CHIRALPAKAD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，5μm)，流动相(正己烷-异戊醇-乙醇-氨水＝70:15:15:0.05)，柱温25℃，流速1.2ml/min，检测波长210nm，对(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈进行检测。用此方法进行试验，存在峰型对称性不好，拖尾，柱效差等问题，且没有给出详细的检测方法。对此检测方法进行微调，也无法改善上述问题。因此，为不断提高维格列汀的安全性和有效性，迫切需要建立一种操作简便、灵敏度高、重现性好的维格列汀中关键中间体(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的对映异构体的定量检测方法。

技术实现要素：

鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于检测维格列汀中间体中对映异构体的方法，具体为一种能有效检测(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的新方法，本检测方法采用高效液相色谱法，对(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈中对映异构体(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈进行有效分离并进行定量，其分离度、专属性、定量限与检测限、线性、精密度、准确度、溶液稳定性，耐用性等方面均经详细验证，且各项验证结果均符合相关法规和指导原则的要求，实际检测效果良好。

为了达到上述的目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于检测维格列汀中间体中对映异构体的方法，所述维格列汀中间体为(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，所述对映异构体为(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，所述方法包括以下步骤：

S1、配制(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈供试品溶液：

称取(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品和流动相混合配制成供试品溶液，待用；

S2、配制(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品溶液：

称取(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈和流动相混合配制成对照品溶液，待用；

S3、配制混合溶液：

称取(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈和步骤S2所配制的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品溶液加入容量瓶中，用流动相稀释，混合均匀，制成混合溶液，待用；

S4、分别吸取等量的对照品溶液、供试品溶液和混合溶液，注入高效色谱仪中进行测定，所述高效液相色谱法的测定条件包括：色谱柱为CHIRALPAK IC色谱柱，柱温为25～40℃，检测波长为210nm，流动相的流速为0.8～1.2mL/min；

所述流动相为正丁醇、乙醇和二乙胺的混合物，按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝58～62：38～42：0.05。

进一步的，所述步骤S1供试品溶液中，按照质量体积比(g/L)计，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.1～5：1。

进一步的，所述步骤S1供试品溶液中，按照质量体积比(g/L)计，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为1：1。

进一步的，所述步骤S2对照品溶液中，按照质量体积比计，(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.01～1：1。

进一步的，所述步骤S2对照品溶液中，按照质量体积比(g/L)计，(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.1：1。

进一步的，所述步骤S3对混合溶液中，按照质量体积比(g/L)计，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.1～5：1，(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.001～0.1：1。

进一步的，所述步骤S3对混合溶液中，按照质量体积比(g/L)计，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为1：1，(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.01：1。

进一步的，所述步骤S4高效液相色谱法的测定条件中，CHIRALPAK IC色谱柱的型号为：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径为5μm。

进一步的，所述步骤S4高效液相色谱法的测定条件中，柱温为30℃，流动相的流速为1mL/min。

进一步的，所述流动相中，按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝60：40：0.05。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈和(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈进行分离检测的方法，本发明采用不同于现有技术的色谱条件，从HPLC图谱中以看出它们之间有一定距离，能有效地对维格列汀关键中间体中对映异构体进行分离检测，且峰型对称，无拖尾现象。

采用杂质对照品对照的检测方法，其分离度、专属性、定量限与检测限、线性、精密度、准确度、溶液稳定性、耐用性等方面均经详细验证，且各项验证结果均符合相关法规和指导原则的要求，实际检测效果良好。

本发明实用性强，在实际检测过程中，(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的检测限可达0.14μg/mL，即可以检出(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈中高于0.01％的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，实用性强。检测过程简单、快捷。

本发明所述的高效液相色谱法，其测定条件中所包含的范围内均为有效值，即：在各参数范围内取任意值后，也能准确的检测出关键中间体中的对映异构体，且能对对映异构体进行有效分离。在实际检测过程中，便于检测人员对参数的调整和避免人为误差对检测结果产生的影响，适宜推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1的供试品溶液的HPLC图谱；

图2为本发明实施例1的对照品溶液的HPLC图谱；

图3为本发明实施例1的混合溶液的HPLC图谱。

具体实施方式

为了对维格列汀关键中间体进行质量控制，以及不断提高维格列汀药品的安全性和有效性，本发明提出了一种用于检测维格列汀中关键中间体对映异构体的方法，其中，维格列汀中关键中间体为(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，对映异构体为(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，即主要是对(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈和(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈进行分离检测。

一种用于检测维格列汀中间体中对映异构体的方法，包括以下步骤：

S1、制备(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈供试品溶液：

称取(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品和流动相混合配制成供试品溶液，待用，按照质量体积比(g/L)计，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.1～5：1，优化的比值为1：1。

S2、制备(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品溶液：

称取(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈加入容量瓶中，和流动相混合配制成对照品溶液，待用，按照质量体积比(g/L)计，(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.01～1：1；优化比值为0.1：1。

S3、混合溶液的制备：

称取(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈加入容量瓶中，精密量取步骤S2配制的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品溶液加入容量瓶中并用流动相稀释至刻度，混合，摇匀，作为混合溶液，待用。按照质量体积比(g/L)计，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.1～5：1，优化比值为1：1；按照质量体积比(g/L)计，(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈：流动相的比值为0.001～0.1：1，优化比值为0.01：1；

S4、分别吸取等量的对照品溶液、供试品溶液和混合溶液，注入高效色谱仪中进行测定，所述高效液相色谱法的测定条件包括：

检查方法：中国药典2015版二部附录高效液相色谱法；

色谱柱：CHIRALPAK IC(型号：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

柱温：25～40℃，优选为30℃；

流速：0.8～1.2mL/min，优选为1mL/min；

流动相：按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝(58～62)：(38～42)：0.05，优选为60：40：0.05。步骤S1至S3中所采用的流动相与步骤S4采用的流动相的相同。

在实际检测过程中，对于本发明采用的高效液相色谱法而言，其测定条件中在各参数范围内进行适当调整后，也能准确的检测出(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈，且能对(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈和(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈进行有效的分离检测。

以下以7个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，选取相同批号(160104批)的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品进行检测。

实施例1

选取批号为160104的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品，对其(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的含量进行检测，包括如下步骤：

S1、制备(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈供试品溶液：

称取25mg(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品加入25mL流动相，混合均匀后，配制成每1mL含维格列汀1.0mg的溶液，作为供试品溶液，待用。

S2、制备(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品溶液：

称取(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品适量，精密称定，流动相溶解并定量稀释制成每1mL中约含100μg的溶液，作为(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品溶液。

S3、混合溶液的制备：

称取(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈10mg，加入10mL容量瓶中，精密量取步骤S2的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品溶液1mL加至容量瓶中并用流动相稀释至刻度，混合，摇匀，作为混合溶液，待用。

S4、取对照溶液10μL注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％～25％，再精密量取供试品溶液、对照品溶液、混合溶液各10μL，分别注入相色谱仪，记录色谱图。图1、图2和图3分别为本实施例中的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈供试品、(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈对照品及混合溶液高效液相色谱图。其中高效液相色谱法的测定条件包括：

色谱柱：CHIRALPAK IC(型号：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

流速：1mL/min；

流动相：按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝60：40：0.05。步骤S1至S3中所采用的流动相与步骤S4采用的流动相的相同。

经检测可知，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈含量为0.02％。从图谱中可以看出，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈和(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的分离度大于1.5。

实施例2

选取批号和实施例1相同批的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品，对其(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流速的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

色谱柱：CHIRALPAK IC(型号：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

流速：0.8mL/min；

流动相：按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝60：40：0.05。

经检测可知，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈含量为0.02％。

实施例3

选取批号和实施例1相同批的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品，对其(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流速的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

色谱柱：CHIRALPAK IC(型号：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

流速：1.2mL/min；

流动相：按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝60：40：0.05。

经检测可知，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈含量为0.02％。

实施例4

选取批号和实施例1相同批的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品，对其(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中柱温的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

色谱柱：CHIRALPAK IC(型号：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

柱温：25℃；

流速：1mL/min；

流动相：按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝60：40：0.05。

经检测可知，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈含量为0.02％。

实施例5

选取批号和实施例1相同批的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品，对其(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中柱温的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

色谱柱：CHIRALPAK IC(型号：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

柱温：40℃；

流速：1mL/min；

流动相：按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝60：40：0.05。

经检测可知，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈含量为0.02％。

实施例6

选取批号和实施例1相同批的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品，对其(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流动相比例的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

色谱柱：CHIRALPAK IC(型号：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

流速：1mL/min；

流动相：按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝62：38：0.05。

经检测可知，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈含量为0.02％。

实施例7

选取批号和实施例1相同批的(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品，对其(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流动相比例的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

色谱柱：CHIRALPAK IC(型号：长250mm，内径4.6mm，纤维素表面共价键合硅胶填充剂，填充料粒径5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：210nm；

柱温：30℃；

流速：1mL/min；

流动相：按体积比计算，正丁醇：乙醇：二乙胺＝58：42：0.05。

经检测可知，(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈样品中的(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈含量为0.02％。

由实施例1至实施例7的检测结果可知，在维格列汀关键中间体(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈的检测过程中，适当对色谱条件的各参数，如流动相比例、流速、柱温等进行调整后，均能对关键中间体(2S)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈中的对映异构体(2R)-1-(2-氯乙酰基)-2-吡咯烷甲腈进行有效分离，且其检测结果均有效、准确。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。