五取代四氢嘧啶化合物在滴定法测定表面活性剂临界胶束浓度中的应用的制作方法

本发明属于表面活性剂分析技术领域，更具体地，涉及五取代四氢嘧啶化合物在滴定法测定表面活性剂临界胶束浓度中的应用。

背景技术：

表面活性剂具有多种特性，如润湿、乳化、发泡、溶解、分散、洗涤、耐腐蚀、抗静电等，被广泛应用于多种领域，如药物化学、合成化学、材料科学、生物学等。在一定的浓度下，即临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)下，表面活性剂开始形成热力学稳定的胶束，同时，各种性质发生显著的变化。因此，CMC测定在实际应用中具有非常重要的意义，是物理化学和分析化学研究的一个热点。报道的CMC测定方法有电导法(Langmuir,1998,14,6632)、光散射法(J.Am.Chem.Soc.,2003,125,1602)、表面张力法(J.Colloid Interface Sci.,2006,301,267)、吸收光谱(Chem.Commun.,2011,47,5527)及荧光光谱法等。其中荧光光谱法具有操作简单、灵敏度高等优点，因此备受多种研究领域的关注(J.Am.Chem.Soc.,1977,99,2039；Talanta,1997,45,167；Langmuir,2005,21,6688；Anal.Biochem.,2011,408,64)。这些报道的CMC测定方法一般都需要相应的精明仪器，以及配制一系列不同浓度的表面活性剂样品，然后依据测得的物理参数与表面活性剂浓度的关系图以确定CMC值。

滴定法是一种简便、快速及应用广泛的定量分析方法，在常量分析中有较高的准确度。如果有灵敏可视的指示剂指示表面活性剂浓度的CMC滴定终点变化，则CMC的测定就可以用简单的滴定装置在几分钟内快速完成。由于滴定法只需配制一种浓度的样品，从而不仅省略了系列不同浓度表面活性剂样品的配制及作图分析测定结果，还省略了精密仪器的使用。因此，CMC滴定法具有极大的优势。但到目前为止，只有少数离子型有机染料可以用作可视的CMC滴定指示剂：以一定浓度的染料溶液做滴定剂，滴定含有相同浓度染料的表面活性剂浓溶液(大于CMC的溶液)，当表面活性剂浓度达到CMC时，染料的颜色或荧光强度明显不同于其在浓度大于CMC的表面活性剂中的颜色或荧光强度，从而实现滴定法测定CMC(J.Am.Chem.Soc.,1947,69,679–683.)。值得一提的是，文章报道的滴定法在滴定时，需要以初始被滴定液的颜色及荧光强度做对照，以判断滴定过程中染料的颜色或荧光强度在表面活性剂浓度达到CMC时的变化。另外，这些离子型有机染料的颜色或荧光强度只对离子类型与其相反的表面活性剂的胶束形成或消失敏感，即阴离子有机染料只能用作测定阳离子表面活性剂CMC的可视滴定指示剂，而阳离子有机染料只能用作测定阴离子表面活性剂CMC的可视滴定指示剂。这些不利因素极大地限制了这些离子型有机染料作为CMC滴定指示剂的实际应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了五取代四氢嘧啶化合物在滴定法测定表面活性剂临界胶束浓度中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了五取代四氢嘧啶化合物在滴定法测定表面活性剂临界胶束浓度中的应用，所述应用以具有式(I)所示结构的五取代四氢嘧啶化合物作为荧光指示剂，包括如下步骤：

S1.用溶剂将所述五取代四氢嘧啶化合物配制成荧光指示剂储备液；

S2.将待测表面活性剂配制成浓度高于其临界胶束浓度的样品溶液；

S3.配制被滴定液：将S1中荧光指示剂储备液和S2中样品溶液混合，得到无荧光的被滴定液；所述被滴定液中五取代四氢嘧啶化合物浓度为3～60μM；

S4.配制滴定液：将S1中荧光指示剂储备液和S2中样品溶液混合，然后用稀释液稀释得到滴定液；

所述滴定液中五取代四氢嘧啶化合物浓度为0.2～6μM；所述滴定液中表面活性剂浓度为被滴定液中表面活性剂浓度1/5～1/20倍；

S5.用S4的滴定液对S3的被滴定液进行滴定，在紫外灯下观察荧光强度从无荧光到强荧光的突变，突变点即为表面活性剂的临界胶束浓度；

所述五取代四氢嘧啶化合物结构式如式(Ⅰ)所示：

其中，R¹选自取代或非取代的C1～8烷基；

R²、R³、R⁴各独立选自取代或非取代的C5～6芳香基、取代或非取代的C9～18稠环芳香基、取代或非取代的C5～6芳杂环基或取代的C5～6芳杂环基。

发明人发现，具有如式(Ⅰ)所示结构的五取代四氢嘧啶化合物具有聚集诱导发光特性以及在表面活性剂胶束中完全没有荧光的特性。即该类化合物在表面活性剂的浓溶液中，会进入到胶束中而完全不发光，但在表面活性剂的稀溶液中却聚集发出很强的荧光，因此可以通过该类化合物荧光从无到很强的turn-on突变来灵敏地指示胶束的拆卸过程，从而测定CMC。我们已将该类化合物用于离子型表面活性剂的荧光测定(中国发明专利CN103411961A；RSC Chem.Comm.2013 50:1107-1109；Sensors and Actuators B:Chemical 2015,219:251-260.)。但是该方法操作较为复杂，并且需要精密仪器荧光仪测定荧光强度，因此在实际应用中，存在不便。

滴定法由于其操作较为方便，是一种常用的检测方法，但发明人发现，如果将上述化合物参照酸碱滴定的方法直接作为指示剂进行滴定时，存在响应时间过长，在滴定时不会出现荧光突变，从而无法获得准确的测量结果。而发明人发现，除了在被滴定液中加入指示剂外，在滴定液中也加入少量的指示剂，能明显著缩短响应时间，从而使化合物的荧光可以在滴定终点出现瞬间荧光点亮突变，获得准确的测量结果。

优选地，所述R¹选自C1～2烷基。

优选地，所述R²选自取代或非取代的C5～6芳香基；R³选自取代或非取代的C5～6芳香基；R⁴选自取代或非取代的C5～6芳香基。

优选地，R¹选自甲基或乙基；

R²选自苯基，甲基苯基，氟苯基，氯苯基，溴苯基，三氟甲基苯基，萘基；

R³选自苯基，溴苯基，氰苯基，三氟甲基苯基，萘基，吡啶基，噻吩基；

R⁴选自苯基，甲基苯基，氟苯基，氯苯基，溴苯基，三氟甲基苯基。

优选地，所述表面活性剂为离子型表面活性剂。所述离子型表面活性剂包括阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂。

优选地，S1中，所述溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、水中的一种或多种。

优选地，S1中将所述五取代四氢嘧啶化合物溶于溶剂配制成1～5mM的荧光指示剂储备液。

优选地，S3中，溶解指示剂的溶剂在被滴定液中的体积浓度小于1.5％。

优选地，S4中，溶解指示剂的溶剂在滴定液中的体积浓度小于1.5％。

优选地，S4中，滴定液的具体配制方法，可以参考发明人RSC Chem.Comm.2013 50:1107-1109中记载的方法，即先将荧光指示剂储备液溶解在浓的表面活性剂溶液中，然后用稀释剂稀释的方法配制含有滴定荧光指示剂与稀的表面活性剂的滴定液。

优选地，所述紫外灯的波长为300～365nm。更优选地，所述紫外灯的波长为320nm。

本发明同时提供一种五取代四氢嘧啶化合物，结构式如式(Ⅰ)所示：

其中，R¹选自甲基；

R²选自氟基、R³选自苯基、R⁴选自对氟苯基。

本发明所公开的CMC荧光滴定法，是以在胶束中无荧光但在溶液中聚集发光的五取代四氢嘧啶作灵敏可视的荧光指示剂，具有器材简单、操作简便及测定速度快等特点。

相对报道的CMC滴定指示剂，五取代四氢嘧啶CMC滴定指示剂具有以下优势：

1、滴定原理不同，具有更高的灵敏度，无需空白对照。该CMC滴定法是通过荧光指示剂在胶束中，即在浓度大于CMC的表面活性剂溶液中无荧光的特性(普通荧光化合物在胶束中荧光比在溶液中荧光更强)，以及在溶液中，即浓度小于CMC的表面活性剂溶液中聚集发光的特性(普通荧光化合物聚集时荧光减弱甚至淬灭)来指示CMC滴定终点的，是荧光从无到有，即荧光点亮turn-on的变化过程，具有很高的灵敏度及可视性，无需空白色对照。而报道的CMC滴定法是通过离子型染料在胶束中，即在浓度大于CMC的表面活性剂溶液中有较强的荧光或不同的颜色，而在溶液中，在与探针离子类型相反的离子型表面活性剂的作用下聚集，从而颜色或荧光减弱改变的性质来指示CMC滴定终点，是荧光从强到弱或颜色改变的过程，灵敏度较低，需要用初始被滴定液做空白对照判断CMC终点时指示剂颜色或荧光强度的变化。

2、指示剂适用范围更宽。本发明涉及的CMC滴定荧光指示剂是中性分子，适合测定阴离子和阳离子表面活性剂CMC的测定，而报道的CMC滴定荧光指示剂是离子型有机染料，只适合用作具有相反离子类型的离子表面活性剂的CMC测定，应用范围很窄。因此，本发明提供的CMC测定荧光指示剂比报道的CMC滴定指示剂具有更宽的应用范围。

3、无需在滴定过程中保持指示剂浓度不变。现有的CMC滴定法在观察滴定终点变化时，需要用初始被滴定液做空白对照。因此需要在滴定过程中保持指示剂的浓度维持不变，以保证滴定指示剂浓度在滴定终点时，滴定指示剂浓度在终点被滴定液与初始被滴定中相同，从而进行有效地对比滴定终点与初始被滴定空白液的颜色或荧光强度。为此，报道的CMC滴定法需要配制含相同指示剂浓度的滴定液和被滴定液。而本发明所用的聚集诱导发光有机化合物滴定指示剂灵敏度很高，在滴定终点时会发生从无光的分子到发强光的聚集态的突变。这种从暗到亮的荧光突变，灵敏可视，不受滴定过程中浓度改变的影响。因此，可以用不含滴定指示剂的稀释剂作为滴定液，并且不需要将指示剂与被测定表面活性剂一起定量配制。

4、根据本发明所述荧光指示剂的显色原理，对表面活性剂进行稀释，应该就能实现显色的效果，但发明人发现，如果用双蒸水作滴定液时，大部分五取代四氢嘧啶在阴阳离子表面活性剂的CMC滴定终点都不会发生荧光突变，这是因为这些化合物在达到滴定终点时不能快速从无荧光的分子态转变成发光的聚集态的缘故。采用本发明配制的滴定液代替双蒸水进行滴定则所有的五取代四氢嘧啶既可以在阴离子表面活性剂的CMC滴定终点可以发生灵敏可视的荧光突变，也可以在阳离子表面活性剂的CMC滴定终点发生荧光突变。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

本发明公开的用五取代四氢嘧啶化合物作为荧光滴定指示剂的CMC滴定法扩展了CMC滴定法的测定范围及实际用途；本发明所述五取代四氢嘧啶化合物CMC滴定荧光指示剂灵敏度高，无需用初始滴定液做空白对照；比已报道的CMC滴定指示剂适合更多的表面活性剂种类；本发明所述的方法为实际应用提供了一种简单、灵敏、快速精确测定CMC的方法，应用前景广泛。

附图说明

图1为实施例1中用THP-1作CMC滴定指示剂滴定阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠CMC值时滴定终点前与终点时的荧光图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

S1.将1,2,3-三苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸乙酯(diethyl1,2,3,6-tetrahydro-1,2,3-triphenylpyrimidine-4,5-dicarboxylate,THP-1)用乙醇配制成浓度为2mM的储备液。

S2.在100mL的容量瓶中，加入288mg十二烷基硫酸钠(SDS)，加双蒸水至样品溶解，采用双蒸水进行定容，使得到浓度为10mM的SDS样品液。

S3.取2mL按步骤S2制备得到的SDS样品液和15μL按步骤S1制备得到的荧光指示剂储备液于透明玻璃瓶中，加搅拌子搅拌均匀，得含荧光指示剂15μM，无荧光的表面活性剂被滴定液；

S4.取1mL按步骤S2制备得到的SDS溶液和1μL按步骤S1制备得到的探针储备液依次加入到10mL的容量瓶中，充分摇匀，用双蒸水定容至容量瓶刻度，配制含0.2μM荧光指示剂，1mM SDS的滴定液；

S5.将按步骤S4制备得到的滴定液装入酸式滴定管中，室温下，调好滴定速度，在磁力搅拌下滴定按步骤S3制备得到的被滴定液，在波长为365nm的紫外灯下观察荧光强度从无荧光到强荧光的突变(图1)，突变点即为表面活性剂浓度达到CMC值。平行滴定三次，平均值CMC值为6.45mM，相对平均误差为0.4％。测定CMC值接近用荧光仪测定的CMC值(表1)。

表1以THP-1为指示剂测定SDS的CMC^a

^a被滴定液：2mL 10mM SDS+15μM THP‐1；滴定液：1mM SDS+0.2μM THP‐1.

^bCMC计算公式：CMC＝(2*10+V滴定*1)/(2+V滴定).

^c发明人报道的以THP‐1为荧光探针，用荧光仪测定的SDS的CMC值(Chem.Commun.,2014,50,1107‐1109)。

实施例2

S1.将1,3-二苯基-2-(4-三氟甲基苯基)-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸甲酯(dimethyl2-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1,2,3,6-tetrahydro-1,3-diphenylpyrimidine-4,5-dicarbox ylate,THP-7)用乙醇配制成浓度为1mM的储备液。

S2.在100mL的容量瓶中，加入288mg十二烷基硫酸钠(SDS)，加双蒸水至样品溶解，采用双蒸水进行定容，使得到浓度为10mM的SDS样品液。

S3.取2mL体积的按步骤S2制备得到的SDS样品液和12μL按步骤S1制备得到的荧光指示剂储备液于2mL滴定瓶中，加搅拌子搅拌均匀，得含荧光指示剂6μM，无荧光的表面活性剂被滴定液；

S4.取0.5mL按步骤S2制备得到的SDS溶液和3μL按步骤S1制备得到的探针储备液依次加入到10mL的容量瓶中，充分摇匀，用双蒸水定容至容量瓶刻度，配制含0.3μM荧光指示剂，0.5mM SDS的滴定液；

S5.将按步骤S4制备得到的滴定液装入酸式滴定管中，室温下，调好滴定速度，在磁力搅拌下滴定按步骤S3制备得到的被滴定液，在波长为365nm的紫外灯下观察荧光强度从无荧光到强荧光的突变，突变点即为表面活性剂浓度达到CMC值。滴定体积为1.20mL，计算公式同实施例1，计算的CMC值为6.44mM，接近发明人文献报道的以THP-7为荧光探针，用荧光仪测定的SDS的CMC值6.79mM(Sensors and Actuators B:Chemical,2015,219,251-260)。

实施例3

S1.将1,3-二苯基-2-(4-三氟甲基苯基)-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸甲酯(dimethyl2-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1,2,3,6-tetrahydro-1,3-diphenylpyrimidine-4,5-dicarbox ylate,THP-7)用乙醇配制成浓度为1mM的储备液。

S2.在100mL的容量瓶中，加入288mg十二烷基硫酸钠(SDS)，加双蒸水至样品溶解，采用双蒸水进行定容，使得到浓度为10mM的SDS样品液。

S3.取2mL体积的按步骤S2制备得到的SDS样品液和12μL按步骤S1制备得到的荧光指示剂储备液于2mL滴定瓶中，加搅拌子搅拌均匀，得含荧光指示剂6μM，无荧光的表面活性剂被滴定液；

S4.取2mL按步骤S2制备得到的SDS溶液和3μL按步骤S1制备得到的探针储备液依次加入到10mL的容量瓶中，充分摇匀，用双蒸水定容至容量瓶刻度，配制含0.3μM荧光指示剂，2mM SDS的滴定液；

S5.将按步骤S4制备得到的滴定液装入酸式滴定管中，室温下，调好滴定速度，在磁力搅拌下滴定按步骤S3制备得到的被滴定液，在波长为365nm的紫外灯下观察荧光强度从无荧光到强荧光的突变，突变点即为表面活性剂浓度达到CMC值。滴定体积为1.35mL，计算公式同实施例1，计算的CMC值为6.78mM，接近发明人文献报道的以THP-7为荧光探针，用荧光仪测定的SDS的CMC值6.79mM(Sensors and Actuators B:Chemical,2015,219,251-260)。

实施例4～15

实施例4～15测定阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)临界胶束浓度(CMC)的方法同实施例1，仅将实施例1中的滴定指示剂THP-1换成相应的式(Ⅰ)的其它化合物TPH-2～12以及改变滴定液与被滴定液中滴定指示剂浓度。表3列出了化合物1～12的结构、滴定液与被滴定液中阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)和滴定指示剂THP的浓度、滴定法测定的临界胶束浓度(CMC)值以及用荧光仪测定的CMC值等。

表3

^aCMC计算公式：CMC＝(V被滴定*C被滴定SDS+V滴定*C滴定SDS)/(V被滴定+V滴定)＝(2*10+V滴定*1)/(2+V滴定).

^b发明人报道的以THP‐1为荧光探针，用荧光仪测定的SDS的CMC值(中国发明专利CN 103411961A，2013，Chem.Commun.,2014,50,1107‐1109,Sensors and Actuators B:Chemical,2015,219,251‐260).

实施例16

S1.将1,2,3-三苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸乙酯(diethyl 1,2,3,6-tetrahydro-1,2,3-triphenylpyrimidine-4,5-dicarboxylate,THP-1)用乙醇配制成浓度为2mM的储备液。

S2.在100mL的容量瓶中，加入72.8mg溴化十六烷基三甲铵(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，加双蒸水至样品溶解，采用双蒸水进行定容，使得到浓度为2mM的CTAB样品液；

S3.取1mL按步骤S2制备得到的CTAB样品液和15μL按步骤S1制备得到的荧光指示剂储备液于透明玻璃瓶中，加搅拌子搅拌均匀，得含荧光指示剂30μM，无荧光的表面活性剂被滴定液；

S4.取1mL按步骤S2制备得到的CTAB溶液和10μL按步骤S1制备得到的探针储备液依次加入到10mL的容量瓶中，充分摇匀，用双蒸水定容至容量瓶刻度，配制含2μM荧光指示剂，0.2mM CTAB的滴定液；

S5.将按步骤S4制备得到的滴定液装入酸式滴定管中，室温下，调好滴定速度，在磁力搅拌下滴定按步骤S3制备得到的被滴定液，在波长为365nm的紫外灯下观察荧光强度从无荧光到强荧光的突变，突变点即为表面活性剂浓度达到CMC值。平行滴定三次，得平均值CMC值0.81mM，相对平均误差为0.5％。测定CMC值接近用荧光仪测定的CMC值(表4)。

实施例17～27

实施例17～27测定阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵(CTAB)临界胶束浓度(CMC)的方法同实施例16，仅将实施例16中的滴定指示剂THP-1换成相应的式(Ⅰ)的其它化合物TPH-2～12以及改变滴定液与被滴定液中滴定指示剂浓度。表4列出了化合物1～12的结构、滴定液与被滴定液中阳离子表面活性剂十溴化十六烷基三甲铵(CTAB)和滴定指示剂THP的浓度、滴定法测定的临界胶束浓度(CMC)值以及用荧光仪测定的CMC值等。

表4

^aCMC计算公式：CMC＝(V被滴定*C被滴定SDS+V滴定*C滴定SDS)/(V被滴定+V滴定)＝(2*10+V滴定*1)/(2+V滴定).

^b发明人报道的以THP‐1为荧光探针，用荧光仪测定的SDS的CMC值(中国发明专利CN 103411961A，2013，Chem.Commun.,2014,50,1107‐1109,Sensors and Actuators B:Chemical,2015,219,251‐260)。

本发明提供了一个新的化合物

1,3-二(4-氟苯基)-2-苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸甲酯dimethyl1,3-bis(4-fluorophenyl)-1,2,3,6-tetrahydro-2-phenylpyrimidine-4,5-dicarboxylate，THP-11),¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.68(d,J＝7.3Hz,2H),7.61–7.37(m,3H),7.21–6.78(m,8H),5.92(s,1H),4.16(d,J＝18.0Hz,1H),3.63(m,J＝40.7,13.9Hz,7Hppm)。

对比例1：

对比例1测定阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵(CTAB)临界胶束浓度(CMC)的方法同实施例17(表4中THP-2)，具体实施方法为仅将实施例16中的滴定指示剂THP-1换成THP-2，以及省略配制滴定液的S4步骤直接用双蒸水作为滴定液，其它均与实施例16相同。

S1.1,2,3-三苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸甲酯(dimethyl1,2,3,6-tetrahydro-1,2,3-triphenylpyrimidine-4,5-dicarboxylate,THP-2)用乙醇配制成浓度为1mM的储备液。

S2.在100mL的容量瓶中，72.8mg溴化十六烷基三甲铵(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，加双蒸水至样品溶解，采用双蒸水进行定容，使得到浓度为2mM的CTAB样品液。

S3.取1mL按步骤S2制备得到的CTAB样品液和12μL按步骤S1制备得到的荧光指示剂储备液于透明玻璃瓶中，加搅拌子搅拌均匀，得含荧光指示剂12μM，无荧光的表面活性剂被滴定液；

S4.将双蒸水装入酸式滴定管中，室温下，调好滴定速度，在磁力搅拌下滴定按步骤S3制备得到的被滴定液，在波长为365nm的紫外灯下观察荧光强度从无荧光到强荧光的突变，突变点即为表面活性剂浓度达到CMC值。在滴定终点时荧光不会发生突变，直到滴定液过量50％，即误差大于50％时，也不会出现荧光突变。因此，用双蒸水作滴定液时，该探针无法指示剂CMC滴定终点。

用五取代四氢嘧啶作为CMC滴定荧光指示剂测定阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠SDS和阳离子表面活性剂溴化十二烷基三甲基铵CMC值的结果，与文献报道的用荧光仪测定结果基本一致，表示使用五取代四氢嘧啶作为荧光指示剂可以实现简单快速准确的滴定CMC值。

本发明提供的CMC荧光滴定指示剂是通过荧光从无到很强的turn-on突变来指示滴定终点，灵敏高，无需空白对照，比已报道的CMC滴定指示剂具有更高的灵敏度，更宽的适用范围，更简单的操作。