一种检测血浆活性成分方法及应用该方法的血浆卡与流程

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及血浆活性成分的检测方法及设备。

背景技术：

常规采血法需要在样本采集中先使用注射器穿刺静脉，抽取数毫升至数十毫升的外周血于采血管，运送至检测实验室，离心去除血细胞，再采用各种方法进行检测。血样采集创伤明显，采血量较大，运输时限对活性成分的稳定性影响较大，需要采血管、离心机等额外设备，难以在医疗卫生系统等专门采血机构以外的地方实施样本采集。此外，釆血后未经离心分离血细胞的全血在室温状态下，其活性成分不稳定。以同型半胱氨酸为例，血中的红细胞在体外仍可以大量合成同型半胱氨酸，故含有红细胞的血样在室温放置后其同型半胱氨酸检测值会高于实际数值。而实践中，由于血样采集、血样运输、离心处理、标本检测等环节可能由不同部门负责，因此，难以保证及时离心处理。

干血斑(Dried blood spot，DBS)将全血收集在滤纸卡片上，所需血样少，在血样采集、运输、保存上相对常规采血法具有一定的优势，在新生儿筛查、法医学物证收集等领域应用广泛。但是DBS需专门的打孔器，难以做到定量收集，此外，其同样存在不能及时离心处理的问题，血量容易受红细胞压积影响，无法去除血细胞，全血中红细胞溶血对检测活性成分可能产生潜在干扰，只能用于定性或者对定量要求不高的检测用途。

有鉴于此，如何设计一种检测血浆活性成分方法及应用该方法的血浆卡，以消除现有技术中的上述缺陷和不足，是业内相关技术人员亟待解决的一项课题。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的技术问题，本发明提供了一种快速、精确、微量、灵敏的检测血浆活性成分方法及应用该方法的血浆卡。

为了实现上述发明目的，本发明公开了一种检测血浆活性成分方法，所述检测血浆活性成分方法包括以下步骤：步骤1采集血液，并通过血浆制备设备实时分离血细胞和血浆；步骤2收集并固化实时分离后的血浆；步骤3对固化后的血浆进行活性成分的检测。

更进一步地，步骤2中，血浆的收集为定量收集。

更进一步地，步骤1中，将血液滴于血浆制备设备的血细胞过滤层，血细胞过滤层将血细胞从血液中过滤分离。

更进一步地，步骤2中，撕去血细胞过滤层，血浆制备设备的血浆吸附层吸附并固化血浆。

更进一步地，所述活性成分为以下任意一种：血浆蛋白、多肽、游离DNA、小分子代谢物、无机离子、药物、毒物。

更进一步地，步骤3中，活性成分的检测方法为以下任意一种：化学法、物理法、色谱法、质谱法、生化法、生物法、免疫法、基因测序法。

为了实现上述发明目的，本发明还公开了一种血浆卡，所述血浆卡包括一血细胞过滤层、一血浆吸附层、一第一卡片、一第二卡片，所述血细胞过滤层固定于所述第一卡片上，用于过滤血液中的血细胞，所述血浆吸附层固定于所述第二卡片上，用于吸附分离血细胞后的血浆，所述血细胞过滤层位于所述血浆吸附层上。

更进一步地，所述第一卡片具有一釆血窗口，所述血细胞过滤层固定于所述釆血窗口处。

更进一步地，所述血细胞过滤层为聚丙烯类材料，具有微孔结构，所述微孔结构的孔径小于1微米。

更进一步地，所述血浆吸附层为纤维素类材料。

与现有技术相比较，本发明所提供的技术方案具有以下优点：第一、简便快速，一方面，釆血不受环境、时间、器械的限制，患者可以随时随地的自行采集，并于常温下将其送至检测中心，极大提高采样的便利性和患者依从性，另一方面，1-2滴的微量血即可制备血浆，便于室温下血浆卡的储存和运输，可简便快速地应用于生物分析和临床检验领域；第二、定量采集，血浆吸附层体积大小固定，精确采集定量的血浆样品，为后续精确测量提供了物质基础；第三、实时分离血细胞和血浆，使血浆中活性成分被固化并保持稳定，减少活性成分的增加或分解，确保活性成分检测数据的准确性；第四、无需离心，自动分离，通过血细胞分离层实现釆血的同时进行实时、自动血细胞分离。

附图说明

关于本发明的优点与精神可以通过以下的发明详述及所附图式得到进一步的了解。

图1是本发明所提供的检测血浆活性成分方法流程图；

图2是本发明所提供的血浆卡的结构示意图；

图3是图2中血浆卡的部分结构示意图；

图4、图5是本发明所提供的血浆卡的血细胞分离层的电子显微镜图；

图6是全血样品和血浆卡样品在室温下同型半胱氨酸动态变化曲线图；

图7是液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)LC-MS/MS检测血浆卡样品中同型半胱氨酸色谱图；

图8是液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测传统血浆样品中同型半胱氨酸色谱图；

图9是本发明所提供的血浆卡获取的血浆与传统血浆分离方法获取的血浆中同型半胱氨酸浓度之间的线性关系图。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的具体实施例。然而，应当将本发明理解成并不局限于以下描述的这种实施方式，并且本发明的技术理念可以与其他公知技术或功能与那些公知技术相同的其他技术组合实施。

在以下具体实施例的说明中，为了清楚展示本发明的结构及工作方式，将借助诸多方向性词语进行描述，但是应当将“前”、“后”、“左”、“右”、“外”、“内”、“向外”、“向内”、“轴向”、“径向”等词语理解为方便用语，而不应当理解为限定性词语。

本发明的目的在于提供一种检测血浆活性成分方法及应用该方法的血浆卡，能够使血浆中的活性成分被固化并保持稳定，减少活性成分的增加或降解，特别是阻止了血中同型半胱氨酸在离体血样中的继续合成导致其浓度不断升高，同时，该检测血浆活性成分方法及应用该方法的血浆卡，以实现快速、精确、微量、灵敏的检测目的。

下面结合附图1-9详细说明本发明的具体实施例。

图1是本发明所提供的检测血浆活性成分方法的流程图。如图所示，本发明所提供的检测血浆活性成分方法包括如下步骤：

步骤1采集血液，并通过血浆制备设备实时分离血细胞和血浆；

将血液滴于血浆制备设备的血细胞过滤层，血细胞过滤层将血细胞从血液中过滤分离。

步骤2收集并固化实时分离后的血浆；

血浆的收集为定量收集。撕去血细胞过滤层，血浆制备设备的血浆吸附层吸附并固化血浆。

步骤3对固化后的血浆进行活性成分的检测。

所述活性成分为以下任意一种：血浆蛋白、多肽、游离DNA、小分子代谢物、无机离子、药物、毒物。活性成分的检测方法为以下任意一种：化学法、物理法、色谱法、质谱法、生化法、生物法、免疫法、基因测序法。

图2是本发明所提供的血浆卡的结构示意图，图3是图2中血浆卡的部分结构示意图。如图所示，本发明提供的血浆卡包括上卡片1、下卡片2、血细胞分离层4、血浆吸附层5，其中，血细胞分离层4用于分离血细胞和血浆，其固定于上卡片1的采血窗口3处，血浆吸附层5用于吸附经血细胞分离层4分离出血细胞后的血浆，其固定于下卡片2，同时，上卡片1和下卡片2之间相互粘连。

图4、图5是本发明所提供的血浆卡的血细胞分离层的电子显微镜图。如图所示，该血细胞分离层4为微孔聚丙烯类材料，孔径小于1微米，其采用体积排阻的技术原理实现自动过滤分离血样中的血细胞和血浆，使血细胞无法穿透血细胞分离层4而保留在血细胞分离层4上面；该血浆吸附层5为纤维素类材料，其采用固定体积大小的方式实现定量吸附分离后的血浆，用于生物分析和临床检验。该血浆卡完成采样后，所采集样品中的活性成分，尤其是同型半胱氨酸，在室温下保持稳定，使活性成分迅速固化干燥。该活性成分包括但不限于，血浆中蛋白、多肽、游离DNA、小分子代谢物、无机离子、药物和毒物。

使用时，患者通过使用手指穿刺的采血器采集指尖血，滴1-2滴指尖血至釆血窗口3处的血细胞分离层4，使之浸润血细胞分离层4和血浆吸附层5，放置3分钟后，撕去上卡片1以及固定于上卡片1的血细胞分离层4，晾干15分钟，在下卡片2上填写样品信息(如患者姓名、出生日期、釆血日期等信息)，将血浆卡放入铝箔包装袋，室温下保存或运输。

本发明对所提供的血细胞分离层4和血浆吸附层5的形状不作具体限定，本领域的普通技术人员可以根据需要对血细胞分离层4和血浆吸附层5的具体形状做出改变。

图6是全血样品和血浆卡样品在室温下同型半胱氨酸动态变化曲线图，其以同型半胱氨酸为例，说明血细胞和血浆分离后，血浆中的活性成分更稳定。

分别从3名受试者肘静脉采集全血3份，同时采集相同的3名受试者手指穿刺采集到的末梢手指血，滴于微量血浆卡上。以样本采集时间作为基线，检测在室温下(25±1℃)分别放置2、6、12、24、48小时后的同型半胱氨酸增加的百分比值。

随放置时间推移，全血中(血1、血2、血3)同型半胱氨酸水平不断升高，和基线值相比，2、6、12、24、48小时后同型半胱氨酸增加的百分比均值分别为4.3％、11.9％、32.2％、49.7％、108.0％；微量血浆卡(卡1、卡2、卡3)中在相应时间同型半胱氨酸增加的百分比均值分别为0.6％、-6.6％、-2.2％、13.4％、1.3％。全血中(血1、血2、血3)由于红细胞在体外仍不断合成致同型半胱氨酸不断升高，48小时平均升高108％；微量血浆卡(卡1、卡2、卡3)中同型半胱氨酸48小时保持稳定，平均仅升高1.3％。

本发明所提供的血浆卡，一方面，血液采集的同时进行实时分离，有效地防止了血浆中的活性成分受到血细胞的影响，另一方面，分离后的血浆，迅速凝固，其中所含有的酶失效，有效地防止了酶对活性成分稳定性的影响，因此，其活性成分具有更高的稳定性。微量血浆采血是保证同型半胱氨酸稳定的有效方法，其采集的样本可明显稳定标本中同型半胱氨酸水平，为分析检测提供稳定、准确、便捷的检验结果。

此外，分别从3名受试者肘静脉采集全血10mL，用滴管分别滴于微量血浆制备设备血浆卡上，每个受试者样品制作100份，放置3分钟后，撕去上层血细胞分离层，血浆吸附于下层的血浆吸附层上，晾干15分钟，标记好样品信息，将微量血浆卡放入原始铝箔包装袋，密封，室温下放置。分别在0天、1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、20天、30天取样，测定蛋白及多肽类(生化及免疫法)、核酸类(基因扩增+基因测序法)、小分子代谢物(液相色谱-质谱法)、药物及毒物(液相色谱-质谱法)、无机离子(电感耦合等离子体-质谱法)，和0天比较，检测结果偏差超过±15％认为不稳定。微量血浆制备设备所采集的干血浆在室温下各种分析物的稳定性结果见表1。

表1干血浆在室温下各种分析物的稳定性

图7是液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测血浆卡样品中同型半胱氨酸色谱图。将手指穿刺微量血浆卡采集的血浆卡取下，按同型半胱氨酸样品处理程序添加内标、还原剂、沉淀剂，处理后的样品供LC-MS/MS进样检测。LC-MS/MS检测条件：API 4000LC-MS/MS仪(AB Sciex)，ESI源，正离子扫描；MRM扫描分析，Q1/Q3离子通道分别选择为m/z：136→90amu(同型半胱氨酸)和140→94amu(内标)。LC-30高效液相色谱仪(Shimadzu)，C18色谱柱(2×100mm)，流动相0.02％甲酸甲醇溶液-0.02％甲酸水溶液(10:90)，流速0.35mL/min，进样5μL。LC-MS/MS检测到微量血浆卡中同型半胱氨酸色谱见图7，同型半胱氨酸的色谱保留时间为1.93分钟，检测信号强度2150cps。图8是液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测传统血浆样品中同型半胱氨酸色谱图，与传统血浆样品比较，二者的色谱行为一致，未见异常干扰峰。说明微量血浆卡同样可以实现血浆的收集，用于同型半胱氨酸的检测。

图9是本发明所提供的血浆卡获取的血浆与传统血浆分离方法获取的血浆中同型半胱氨酸浓度之间的线性关系图。如图所示，取26个临床全血样品，分别用微量血浆卡将全血滴于样本收集区，自动收集微量血浆，以及传统血浆分离方法离心收取血浆，LC-MS/MS方法同时检测两种类型的血浆样本中同型半胱氨酸浓度，并分析二者相关性。以传统方法收集的血浆中同型半胱氨酸浓度为x轴(μmol/L)，微量血浆卡采集血浆同型半胱氨酸浓度为y轴(μmol/L)，绘制线性方程，线性关系为y＝0.67x+0.8。微量血浆卡采集血浆和传统静脉穿刺采血法的相关性(r)为0.988。

本领域的普通技术人员应当知悉，对活性成分的检测，其检测方法可以是色谱法，亦可以是化学法、物理法、质谱法、生化法、生物法、免疫法、基因测序法，本发明对此不作具体限定。

此外，本发明所提供的血浆卡，其血浆吸附层采集的DNA浓度和纯度如下：从微量血浆制备设备血浆卡中取下收集血浆的血浆吸附层，放置于离心管中，向装有血浆吸附层的离心管中加入500μL裂解液，56℃孵育1h，提取血浆吸附层中游离DNA。将经过孵育处理的液体加入DNA分离试剂盒试剂条的孔位中，将放置提取试剂条的载架放入Lab-Aid 820核酸提取仪提取操作室中，选择干血斑标本提取程序，仪器自动完成提取。使用Nanodrop 2000分光光度计进行吸光值检测，计算DNA浓度和纯度。然后使用高通量基因测序法检测游离DNA，进行地中海贫血基因检测，按照说明书进行操作。血浆中游离DNA的浓度为15.2μg/μL，DNA纯度为1.68。

本发明所提供的血浆卡，其血浆吸附层采集的血浆体积如下：取6个临床全血样品，分别用本发明所提供的血浆卡采血，称量采集前后单个血浆吸附层的质量，计算采集的血浆质量。再将全血离心后分别测定每个临床全血样品的不同血浆体积(1μL、2μL、5μL、10μL、50μL)的血浆质量，以血浆体积为x轴(μL)，血浆质量为y轴(g)，进行线性回归分析，回归方程为y＝0.0011x+0.0002，r＝0.9999(n＝6)，从而计算每个血浆吸附层采集的血浆体积(表2)。单片血浆吸附层采集的血浆体积为(2.75±0.15)μL，CV＝5.35％，说明血浆卡收集的血浆样品量相对恒定。

表2血浆卡采集的血浆体积

本发明所提供的血浆卡，其血浆吸附层中同型半胱氨酸浓度如下：取2个临床全血样品，每个样品分别用6个微量血浆卡采血，LC-MS/MS分别检测同型半胱氨酸结果。同一样品的不同采集卡之间CV≤3.7％(n＝6)(表3)，说明血浆卡检测同型半胱氨酸重复性好。

表3不同血浆卡检测同型半胱氨酸浓度(μmol/L)

本发明所提供的血浆卡，各重金属元素的回收率具体如下：滴一滴血于微量血浆卡的样品采集区，放置3分钟后，撕去上层血细胞分离层，晾干15分钟，取下血浆吸附层置于96孔板中，加10μL100％硝酸室温下孵育2小时，再加190μL水室温下孵育1小时，加200μL内标(含100ppb镓元素水溶液)，直接进样，电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测样品中的重金属元素铅、砷、镉、汞，以及镁、硫、锰、铁、锌、钠、钾、硒等元素。以美国标准技术研究所(NIST)的参考物质为参照样品，铅、砷、镉、汞(总)的回收率分别为102.1％、101.5％、101.8％、102.9％，其他元素的回收率在98.7％-103.5％之间。

本发明所提供的血浆卡，可用于通过检测血浆中的氨基酸，进行新生儿筛查或者先天性遗传代谢疾病筛查，具体如下：取血浆卡的血浆吸附层置于96U型孔板中，每孔加入含氨基酸内标工作液100μL(氨基酸内标原液：萃取工作液按照1：110现配)；用黏性塑料封套覆盖微孔板，确保密封良好后上恒温孵育振荡器，40℃孵育震荡45min，震荡频率650rpm；每孔吸取75μL萃取液转入V型截底96孔板中，使用铝箔封套覆盖微孔板；上串联质谱仪进行样本氨基酸浓度检测。可检测血浆中甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、酪氨酸等多种氨基酸，用于新生儿筛查或者先天性遗传代谢疾病筛查。

与现有技术相比较，本发明所提供的检测血浆活性成分方法及应用该方法的血浆卡具有以下优点：第一、简便快速，一方面，釆血不受环境、时间、器械的限制，患者可以随时随地的自行采集，并于常温下将其送至检测中心，极大提高采样的便利性和患者依从性，另一方面，1-2滴的微量血即可制备血浆，便于室温下血浆卡的储存和运输，可简便快速地应用于生物分析和临床检验领域；第二、定量采集，血浆吸附层体积大小固定，精确采集定量的血浆样品，为后续精确测量提供了物质基础；第三、实时分离血细胞和血浆，使血浆中活性成分被固化并保持稳定，减少活性成分的增加或分解，确保活性成分检测数据的准确性；第四、无需离心，自动分离，通过血细胞分离层实现釆血的同时进行实时、自动血细胞分离。

需要说明的是，本发明所提供的血浆卡是用以具体说明血浆制备设备，血浆卡仅为众多血浆制备设备中的一种，并且，该血浆卡所具有的技术效果，血浆制备设备同样具有。比如，一种血浆制备设备同样具有分离血细胞的血细胞分离层和吸附血浆的血浆吸附层，以此制备血浆样品。此外，通过血细胞分离层实现血细胞和血浆的实时分离仅为本发明所提供的实现血细胞和血浆实时分离的方式之一，本发明所提供的该血浆制备设备并不限于其只能通过血细胞分离层实现血细胞和血浆的实时分离。

如无特别说明，本文中出现的类似于“第一”、“第二”的限定语并非是指对时间顺序、数量、或者重要性的限定，而仅仅是为了将本技术方案中的一个技术特征与另一个技术特征相区分。同样地，本文中出现的类似于“一”的限定语并非是指对数量的限定，而是描述在前文中未曾出现的技术特征。同样地，本文中在数词前出现的类似于“大约”、“近似地”的修饰语通常包含本数，并且其具体的含义应当结合上下文意理解。同样地，除非是有特定的数量量词修饰的名词，否则在本文中应当视作即包含单数形式又包含复数形式，在该技术方案中即可以包括单数个该技术特征，也可以包括复数个该技术特征。

本说明书中所述的只是本发明的较佳具体实施例，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明的限制。凡本领域技术人员依本发明的构思通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在本发明的范围之内。