一种头发检测辅酶Q10含量的简便方法与流程

本发明属于分析检测技术领域，具体为一种头发检测辅酶q10含量的简便方法。

背景技术：

辅酶q10是一种重要的脂溶性物质，存在于以人类为主的高级动、植物线粒体的内膜中，在呼吸链中起着传递氢体作用。它对许多酶具有激活作用，并能增加机体的免疫力。coq10同时也是机体内一种重要的抗氧化物质，具有天然的抗自由基氧化，防止细胞膜脂质过氧化反应、保持膜流动性的功能。但是，辅酶q10随着疾病或年龄的增加，会不断地减少，因此，检测体内辅酶q10的含量，对于观察及判断疾病的轻重以及衰老状态具有重要意义。头发作为身体的一部分，含有细胞，可进行新陈代谢，头发的生长需要营养，头发的好坏就与头发中细胞的新陈代谢的强弱相关。头发作为衡量人体元素的水平应用已相当普遍，证实了发中元素的含量与营养摄入和环境接触是相关的，并用头发作为观察微量元素在体内代谢和个体与环境接触的活检材料。而辅酶q10也是一种衡量人体健康水平的元素之一。测定coq10的方法已有文献报道，其中主要采取分光光度法。这些方法的灵敏度和特异性都不够理想。一般难于应用于生物样品特别是头发中微量coq10的测定。近年高效液相色谱分析方法(hplc)已开始应用于血浆生物样品中coq10含量测定，与血浆样品中coq10含量相比，头发中coq10含量更低，目前还没有报道，，国内尚未见相关研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于建立一种简单实用的以头发为检测标本的辅酶q10检测方法，克服现有检测方法的提取方法繁杂，有机溶剂应用较多，方法不够灵敏，不够稳定等困难，研制并开发出一种提取溶剂简单、操作方便，同时准确性高、分析速度快的头发辅酶q10的分析方法。

本发明建立了以无水乙醇作为头发的提取溶剂并应用高效液相色谱检测方法检测头发中辅酶q10含量的简便方法，其特征在于：

(1)无水乙醇提取头发中的辅酶q10：称取头发，置于圆底烧瓶中，加入头发重量的8～15倍量的无水乙醇，在80℃水浴加热60min提取辅酶q10，提取液再通过80℃旋转蒸回收提取溶剂，沉淀物再用的无水乙醇溶解，经0.22μm滤膜过滤，即得；

(2)头发中的辅酶q10色谱分析：取(1)获得的无水乙醇提取液，按下述色谱分析条件分析：色谱柱eclipseplusc18(4.6*250nm，5μm)，流动相：甲醇∶乙醇(v∶v)＝20∶80，流速：1ml/min，检测波长：275nm，柱温：30℃，进样体积：20μl。

本发明通过以无水乙醇为提取剂提取出头发中的辅酶q10，建立了高效液相色谱分析方法对头发辅酶q10进行检测，采用色谱柱和甲醇-无水乙醇(体积比20∶80)流动相即可对头发中的辅酶q10进行快速分离分析。方法样品制备处理简单，分析高效，结果准确，稳定性好，是一种简便实用的头发的辅酶q10的检测方法。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。实施例仅用于本发明而不限于本发明的范围。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

无水乙醇(分析纯，天津大茂厂家)；无水乙醇，甲醇(色谱纯，天津科密欧厂家)；辅酶q10原料药(广东润和生物科技有限公司)，头发(采集于广东医科大学理发店学生群的头发)；高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1hplc检测辅酶q10的色谱条件

色谱柱eclipseplusc18(4.6*250nm，5μm)，流动相：甲醇∶乙醇(v∶v)＝20∶80，流速：1ml/min，检测波长：275nm，柱温：30℃，进样体积：20μl。

1.2.2头发提取液及对照品溶液的制备

①供试品的制备

a.头发的来源：采集于广东医科大学理发店18-23岁在校学生的头发。

b.供试品溶液：精密称取4.5g头发，置于100ml的圆底烧瓶中，加入50ml的提取溶剂，80℃水浴加热60min，实验完后，将样品溶液在80℃旋转蒸，挥干提取溶剂，再用2ml的无水乙醇溶解，经0.22μm滤膜过滤，待测。

②对照品溶液：精密称取辅酶q10对照品25mg，置于25ml的容量瓶中，加入无水乙醇定容至25ml，超声波震荡溶解5min，冷却后即得对照品储备液，经0.22μm滤膜过滤，待测^[6]。

1.2.3辅酶q10标准品的标准曲线

精密称取辅酶q10对照品25mg，置于25ml的容量瓶中，加入无水乙醇定容至25ml，超声波震荡溶解5min，冷却后即得对照品储备液，稀释成一系列浓度的标品，以辅酶q10浓度x对峰面积y进行线性回归^[5-7]。

1.2.4含量测定及方法学考察

1.2.4.1稳定性实验

①对照品稳定性：精密称取辅酶q10对照品25mg，置于25ml的容量瓶中，加入无水乙醇定容至25ml，超声波震荡溶解5min，冷却后摇匀即得对照品储备液，稀释成一系列浓度的对照品溶液，取浓度为6.25μl/ml的对照品溶液，在避光条件下(室温)分别于0、2、4、6、8、10、12h分别进样20μl，测定辅酶q10主峰面积值，计算辅酶q10峰面积的rsd％。

②供试品稳定性：精密称取4.5g头发，置于100ml的圆底烧瓶中，加入50ml的无水乙醇，80℃水浴加热60min，实验完后，样品溶液在80℃旋转蒸，挥干石油醚，再用2ml的无水乙醇溶解，得供试品溶液。对同一供试品溶液，在避光条件下(室温)分别于0、2、4、6、8、10、12h分别进样20μl，测定辅酶q10主峰面积值，计算辅酶q10峰面积的rsd％。

1.2.4.2精密度实验

①对照品精密度：精密称取辅酶q10对照品25mg，置于25ml的容量瓶中，加入无水乙醇定容至25ml，超声波震荡溶解5min，冷却后摇匀即得对照品储备液，按一定的倍数稀释，精密吸取浓度为6.25μl/ml的对照品溶液20μl，连续进样6次，以标准品溶液的主峰面积考察进样精密度。

②供试品精密度：精密称取4.5g头发，置于100ml的圆底烧瓶中，加入50ml的无水乙醇，80℃水浴加热60min，实验完后，将样品溶液在80℃旋蒸，挥干无水乙醇，再用2ml的无水乙醇溶解，得供试品溶液，经0.22μm滤膜过滤，精密吸取溶液20μl，连续进样6次，求得辅酶q10的峰面积的rsd％。

1.2.4.3重复性实验

取同一批次的，样品溶液3份，同法制备供试品溶液，在“1.2.1”色谱条件下测定峰面积。1.2.4.4加样回收率实验

精密称取辅酶q10对照品25mg，置于25ml的容量瓶中，加入无水乙醇定容至25ml，超声波震荡溶解5min，冷却后摇匀即得对照品储备液。取四份头发4.5g分别置于四个100ml的圆底烧瓶中，分别加入50ml的无水乙醇到圆底烧瓶，再依次精密量取为重复性实验的平均辅酶q10浓度的80％，100％和120％上述对照品和一个不加标，在85℃下水浴回流60min，冷却后，于80℃下旋蒸，挥干溶液，再用2ml的无水乙醇溶解，经过0.22μm滤膜滤过，取续滤液，待测。

1.2.4.5干扰性实验

精密吸取无水乙醇(分析纯)按色谱条件进样20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

2结果与分析

2.1辅酶q10标准品的标准曲线

精密称取辅酶q10对照品12.5mg，置于25ml的容量瓶中，用无水乙醇定容至25ml，先稀释5倍，再依次按2倍的稀释，制成一系列浓度标准溶液(12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml、0.78125μg/ml)，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法——峰面积计算。以辅酶q10浓度x对峰面积y进行线性回归。标准曲线见图1，回归方程为：即辅酶q10浓度x与峰面积y在浓度为0.78125μg/ml～12.5μg/ml的范围内线性关系良好。辅酶q10的标准曲线见附图1。

2.2系统适用性实验

取标准品溶液、供试品溶液按色谱分析方法分别进样。辅酶q10标准品色谱图结果如图2，头发样品的hplc色谱图见图3，图4显示头发与辅酶q10标准品的峰面积重合，从这几张hplc色谱图可见，辅酶q10峰形良好，理论塔板数为8676，辅酶q10与相邻峰的分离度为大于1.5，对称因子在0.95～1.05，表明所建方法具有良好的专属性。

2.3干扰性实验

取对照品、供试品溶剂(无水乙醇)按色谱条件进样20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图5。结果表明，本色谱条件下溶剂无干扰。

2.4稳定性实验

①取对照品溶液(6.25μg/ml)，在避光条件下(室温)分别于0、2、4、6、8、10、12h分别进样20μl，测定辅酶q10主峰面积值，各杂质峰峰面积基本无变化，计算辅酶q10峰面积的rsd％。结果见表1。

表1对照品稳定性实验结果

②对同一供试品溶液，在避光条件下(室温)分别于0、2、4、6、8、10、12h分别进样20μl，测定辅酶q10主峰面积值，各杂质峰峰面积基本无变化，计算辅酶q10峰面积的rsd％。结果见表2。

表2供试品稳定性实验结果

2.5精密度实验

①对照品精密度精密吸取对照品溶液(6.25μg/ml)20μl，连续进样6次，以标准品溶液的主峰面积考察进样精密度。结果见表3。

表3对照品精密度实验结果

②供试品精密度精密吸取供试品溶液20μl，连续进样6次，求得辅酶q10的峰面积的rsd值为0.88％，结果见表4。实验结果表明，仪器精密度良好。

表4供试品精密度实验结果

2.6重复性实验

取同一批次的样品溶液3份，同法制备供试品溶液，在“1.2.1”色谱条件下测定峰面积，结果见表5。

表5重复性实验结果

2.7加样回收率实验

精密吸取低、中、高三种浓度(分别为重复性实验的平均辅酶q10浓度的80％，100％和120％)的辅酶q10对照品溶液，分别加入已知含量的3份样品中，按供试品溶液的最优制备方法制备后，在上述的色谱条件下分析，计算回收率。结果见表6。辅酶q10的平均回收率为92.96％。

表6头发中辅酶q10的加样回收测定结果

3结论

本研究通过对头发的提取液中的辅酶q10建立了高效液相色谱分析方法，采用色谱柱和甲醇-无水乙醇(体积比20∶80)流动相即可对头发中的辅酶q10进行快速分离分析。方法样品制备处理简单，分析高效，结果准确，可用于头发的辅酶q10的检测。

附图说明

图1为辅酶q10标准品的标准曲线的hplc色谱图；

图2为辅酶q10标准品的hplc色谱图；

图3为头发样品的hplc色谱图；

图4为头发与辅酶q10标准品的峰面积重合的hplc色谱图；

图5为无水乙醇干扰的hplc色谱图。