一种富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法与流程

该发明涉及药物检测领域，具体为一种富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法。
背景技术：
：富马酸沃诺拉赞(TAK-438,Vonoprazanfumarate)是武田制药与大冢制药合作推出的一种新型口服的抗胃酸药物，属于钾离子(K+)竞争性酸阻滞剂(P-CAB),是一种可逆性质子泵抑制剂，其进入人体后，在胃壁细胞泌酸的最后步骤，通过抑制K+与H+-K+-ATP酶(质子泵)的结合，终止胃酸的分泌，达到抑酸效果，本品具有强劲、持久的抑制胃酸分泌作用。2014年12月26日富马酸沃诺拉赞在日本获批上市(商品名为Takecab)，用于酸相关疾病的治疗。与传统的不可逆质子泵抑制剂(如奥美拉唑、埃索美拉唑等)相比，富马酸沃诺拉赞具有以下优点：①起效迅速，第1天给药就会达到最大的抑酸效果；②口服给药，不受胃酸破坏影响，毋需做成肠溶给药形式；③对夜间酸突破现象有一定的改善做用，将会是一个极具潜力的抗胃酸药物。一个药物的治疗效果不光要看化合物本身的活性，药物杂质对其安全性和有效性也有着重要影响。药物杂质是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效、甚至对人体健康有害的物质，在药物生产过程中，杂质的主要来源包括两个方面：1、由于所用原料不纯或者原料反应过程中反应未完全，以及反应的中间产物、反应的副产物等造成药品原料中杂质的存在，被统一称为有关物质；2、由于原料生产过程中反应的溶媒、催化剂等的残留所造成的杂质。药物的杂质与药品安全性的关系是一个受多因素影响的复杂关系，通常药物中的杂质大多具有潜在的生物活性，有的甚至与药物相互作用从而影响药物的效能和安全，严重的可能产生毒性作用。药物中杂质会不同程度地影响药物的稳定和安全，因此在药物的研究、生产、贮存和临床应用等方面，必须保证药物的纯度，降低药物的杂质，才能保证药物的有效和安全。富马酸沃诺拉赞在合成过程中也会产生多个重要的有关物质(包括杂质F、杂质U2、杂质NO、杂质22、杂质12、杂质18、杂质N、杂质11、杂质9、杂质10、杂质7、杂质R、杂质IM01、杂质15、杂质14以及杂质13)，这些有关物质如果过多地引入药物成品中，将会导致严重的用药安全性问题。因此，在原料药合成阶段和制剂阶段都需要对这些有关物质进行严格控制。技术实现要素：本发明的目的在于为解决上述技术问题，本发明提供一种分离度好、检出有关物质多、检测效率高的富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其包含以下步骤：取富马酸沃诺拉赞供试品溶液进样，按照液相色谱条件进行检测，其中所用高效液相色谱条件为：色谱柱为苯基键合硅胶柱；流动相A为含三乙胺与三氟乙酸的水溶液，流动相B为含三乙胺与三氟乙酸的乙腈溶液，采用梯度方式洗脱。本发明所提供的富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其中所述梯度洗脱程序为：优选为：本发明所提供的富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，流动相A为含0.05％-0.5％三乙胺与0.05％-0.5％三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.05％-0.5％三乙胺与0.05％-0.5％三氟乙酸的乙腈溶液；优选流动相A为含0.05％-0.2％三乙胺与0.05％-0.2％三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.05％-0.2％三乙胺与0.05％-0.2％三氟乙酸的乙腈溶液；更优选流动相A为含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。本发明所提供的富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，色谱柱柱温为30-45℃；优选色谱柱柱温为35-40℃；更优选色谱柱柱温为35℃。本发明所提供的富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，流动相流速为0.5-1.5ml/min；优选流动相流速为0.8-1.2ml/min；更优选流动相流速为1.0ml/min。本发明所提供的富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，样品进样量为5-20μl；优选样品进样量为10μl。本发明所提供的富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其中所述高效液相色谱条件中，所用的检测器为光电二极管阵列检测器，检测波长为254nm。本发明所提供富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其中所述供试品溶液的制备方法为取富马酸沃诺拉赞，精密称定，加适量溶剂溶解并稀释制成每1ml约含0.1mg的溶液即得。因为样品进样体积相对于流动相体积来说大小极微，上述适量溶剂可以在完全溶解样品且适于色谱分析的溶剂中进行选择，例如水、甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水。本发明进一步提供一种富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其包含以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取适量富马酸沃诺拉赞，精密称定，加乙腈与水的混合溶剂溶解并稀释制成每1ml约含0.1mg的溶液即得；其中混合溶剂中乙腈与水的体积比为15:85；(2)色谱条件：色谱柱为苯基键合硅胶柱；流动相A为含0.05％-0.5％三乙胺与0.05％-0.5％三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.05％-0.5％三乙胺与0.05％-0.5％三氟乙酸的乙腈溶液，采用梯度方式洗脱；流动相流速为0.5-1.5ml/min，色谱柱柱温为30-45℃，样品进样量为5-20μl，采用光电二极管阵列检测器，检测波长254nm；其中，梯度洗脱程序为：(3)测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。本发明进一步提供一种富马酸沃诺拉赞有关物质的检测方法，其包含以下优选步骤：(1)供试品溶液的制备：取适量富马酸沃诺拉赞，精密称定，加乙腈与水的混合溶剂溶解并稀释制成每1ml约含0.1mg的溶液即得；其中混合溶剂中乙腈与水的体积比为15:85；(2)色谱条件：色谱柱为苯基键合硅胶柱；流动相A为含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，采用梯度方式洗脱；流动相流速为1.0ml/min，色谱柱柱温为35℃，样品进样量为10μl，采用光电二极管阵列检测器，检测波长254nm；其中，梯度洗脱程序为：(3)测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定。本申请发明人经过大量的试验探索，最终建立了可以高效分离与检测富马酸沃诺拉赞有关物质的高效液相色谱方法。附图说明图1为对比例1中的高效液相色谱图图2为对比例2中的高效液相色谱图图3为对比例3中的高效液相色谱图图4为对比例4中的高效液相色谱图图5为对比例5中的高效液相色谱图图6为对比例6中的高效液相色谱图图7为对比例7中的高效液相色谱图图8为对比例8中的高效液相色谱图图9为实施例1中的高效液相色谱图图10为实施例2中的高效液相色谱图图11为实施例3中的高效液相色谱图图12为实施例4中的高效液相色谱图图13为实施例5中的高效液相色谱图图14为实施例6中的高效液相色谱图图15为实施例7中的高效液相色谱图图16为实施例8中的高效液相色谱图图17为实施例9中的高效液相色谱图图18为实施例10中的高效液相色谱图具体实施方式供试品溶液的制备取16种杂质对照品和富马酸沃诺拉赞对照品用稀释剂溶解并分别制备成1mg/ml的标准储备液，将16种杂质对照品和富马酸沃诺拉赞对照品的标准储备液各取0.1ml混合，然后用稀释剂定容至2ml，得供试品溶液备用；其中所述稀释剂优选为甲醇、乙腈或水，或者上述溶剂的两种或两种以上的混合物。16种杂质和富马酸沃诺拉赞按出峰顺序分别为杂质F、杂质U2、杂质NO、杂质22、杂质12、杂质18、富马酸沃诺拉赞、杂质N、杂质11、杂质9、杂质10、杂质7、杂质R、杂质IM01、杂质15、杂质14以及杂质13。对比例1供试品制备中稀释剂为：甲醇色谱检测条件如下：色谱柱：WatersSunFireC18(250×4.6mm，5μm，十八烷基硅烷键合硅胶柱)柱温：25℃流动相：流动相A-0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用三乙胺调pH至5.5)流动相B-乙腈流速：1.0ml/min梯度：进样量：10μL检测器：230nm检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图1，只分离出13个色谱峰，且峰型较差、分离度小于1.5。对比例2供试品制备中稀释剂为：乙腈色谱检测条件如下：色谱柱：WatersSunFireC18(250×4.6mm，5μm，十八烷基硅烷键合硅胶柱)柱温：25℃流动相：流动相A-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾13.6g，加水900ml溶解，用磷酸调节pH至3.0，再补加水至1000ml)流动相B-乙腈流速：1.0ml/min梯度：时间(min)流动相A流动相B0901059010207030404060454060469010519010进样量：20μL检测器：230nm检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图2，只分离出16个色谱峰，且分离度小于1.5。对比例3供试品制备中稀释剂为：甲醇色谱检测条件如下：色谱柱：WatersSunFireC18(250×4.6mm，5μm，十八烷基硅烷键合硅胶柱)柱温：30℃流动相：流动相A-磷酸钠缓冲溶液(20mmol，用磷酸调pH至6.0):甲醇＝95:5流动相B-磷酸钠缓冲溶液(20mmol，用磷酸调pH至6.0):甲醇＝35:65流速：1.0ml/min梯度：进样量：20μL检测器：220nm检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图3，只分离出16个色谱峰，且峰型较差、分离度小于1.5。对比例4供试品制备中稀释剂为：甲醇色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：AgilentPursuit5PFP(5μm，4.6×150mm，五氟苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A—0.01mol/LKH2PO4(用H3PO4调节pH＝2.5)流动相B—乙腈梯度洗脱程序：流速：1ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL实验结果：杂质峰分离情况见图4，只分离出14个色谱峰，且峰型较差、分离度小于1.5。对比例5供试品制备中稀释剂为：甲醇色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：AgilentXDB-Phenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A—0.02mol/LNaH2PO4(用H3PO4调节pH＝2.5)流动相B—乙腈梯度洗脱程序：流速：1ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL实验结果：杂质峰分离情况见图5，分离出17个色谱峰，但分离度小于1.5。对比例6供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为20:80)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersSunFireC18(250×4.6mm，5μm，十八烷基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A—0.01mol/LKH2PO4(用H3PO4调节pH＝2.5)流动相B—乙腈梯度洗脱程序：流速：1ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL实验结果：杂质峰分离情况见图6，只分离出14个色谱峰，且峰型较差、分离度小于1.5。对比例7供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为20:80)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--去离子水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸，pH＝2.3)流动相B--乙腈(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸，pH＝2.3)梯度洗脱程序：流速：1ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL实验结果：杂质峰分离情况见色谱图7，分离出17个色谱峰，但分离度小于1.5。对比例8供试品制备中稀释剂为：甲醇色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--去离子水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸，pH＝2.3)流动相B—甲醇(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸，pH＝2.3)梯度洗脱程序：流速：1ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL实验结果：杂质峰分离情况见图8，分离出17个色谱峰，但峰型较差、分离度小于1.5。实施例1供试品制备中稀释剂为：甲醇色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：0.8ml/min柱温：30℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图9，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例2供试品制备中稀释剂为：乙腈色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：1.2ml/min柱温：40℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图10，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例3供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为10:90)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：1.0ml/min柱温：45℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图11，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例4供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为20:80)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：1.0ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图12，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例5供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为15:85)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：1.0ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：5μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图13，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例6供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为15:85)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：1.0ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：20μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图14，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例7供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为15:85)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.05％三乙胺与0.05％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.05％三乙胺与0.05％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：1.0ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图15，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例8供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为15:85)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.2％三乙胺与0.2％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.2％三乙胺与0.2％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：1.0ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图16，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例9供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为15:85)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.5％三乙胺与0.5％三氟乙酸)流动相B--乙腈(含0.5％三乙胺与0.5％三氟乙酸)梯度洗脱程序：流速：1.0ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图17，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。实施例10供试品制备中稀释剂为：乙腈-水(二者体积比为15:85)色谱检测条件如下：仪器：ThermoScientificDIONEXUltimate3000UHPLC色谱柱：WatersXBridgePhenyl(250×4.6mm，5μm，苯基硅烷键合硅胶柱)流动相：流动相A--水(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸，pH＝2.3)流动相B--乙腈(含0.1％三乙胺与0.1％三氟乙酸，pH＝2.3)梯度洗脱程序：流速：1ml/min柱温：35℃检测器：光电二极管阵列检测器，检测波长254nm进样量：10μL检测：取供试品溶液进样分析。实验结果：杂质峰分离情况见图18，分离出17个色谱峰，且峰型好、分离度≥1.5。当前第1页1 2 3