一种液相色谱法测定类胡萝卜素的流动相配方及其应用的制作方法

本发明属于液相色谱分离代谢小分子的方法领域，特别涉及一种液相色谱法测定类胡萝卜素的流动相配方及其应用。

背景技术：

类胡萝卜素作为小分子特殊代谢物，可有效清除自由基、有显著的抗氧化、提高人体免疫力、延缓衰老、防癌抗癌等保护人类健康具有积极重要的作用。由于人体自身不能合成该类物质，补充人工合成的此类物质对防病抗癌没有效果，所以从自然界食物中摄取成为了唯一必然的获得方式。食物中分布的类胡萝卜素主要有叶黄素、玉米黄素、α-隐黄素、β-隐黄素、α-胡萝卜素，β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、(6R)-δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素等，而高效液相色谱法具有分离效能高，分析速度快，成本低廉等优点，是应用最广最适用于食物中此类物质的分离测定方法。类胡萝卜素物质之间有些化学结构极为相似，有些为同分异构体，所以同时将这类物质在C18柱上分离比较困难，而C30柱的出现为此提供了新的分离方法。目前，使用C30柱液相色谱法多为分离单一或少数几种类胡萝卜素的测定方法，同时测定五种或以上多种的方法中，常会出现峰型不好，峰分不开，相对偏差大，响应值低等问题。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种液相色谱法测定类胡萝卜素的流动相配方。

本发明的另一目的在于提供上述液相色谱法测定类胡萝卜素的流动相配方的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种液相色谱法测定类胡萝卜素的流动相配方，包括以下体积百分比的成份：

A1相：90％～100％甲醇-水；

B1相：90％～100％叔丁基甲醚-甲醇(又名甲基叔丁基醚，简称MTBE)。

进一步的改进在于：包括以下质量或体积百分比的成份：

A相：90％A2相+10％B2相；

B相：10％A2相+90％B2相。

其中，

A2相：90％～100％甲醇-水，含有0～0.5M乙酸铵和0～0.5％(W/V)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(简称BHT)；

B2相：90％～100％叔丁基甲醚-甲醇，含有0～0.5％(W/V)BHT。

优选地，

A2相：97％甲醇-水，含有0～0.1M乙酸铵和0～0.15％(W/V)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(简称BHT)；

B2相：100％MTBE，含有0～0.2％(W/V)BHT。

更优选的，

A2相：97％甲醇-水，含有0.05M乙酸铵和0.1％(W/V)2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(简称BHT)；

B2相：100％MTBE，含有0.1％(W/V)BHT。

所述的类胡萝卜素为叶黄素(Lutein)、玉米黄素(Zeaxanthin)、α-隐黄素(α-Cryptoxanthin)、β-隐黄素(β-Cryptoxanthin)、ε-胡萝卜素(ε-carotene)、α-胡萝卜素(α-carotene)、β-胡萝卜素(β-carotene)、(6R)-δ-胡萝卜素((6R)-δ-carotene)、γ-胡萝卜素(γ-carotene)和番茄红素(Lycopene)。

所述的液相色谱法测定类胡萝卜素的流动相配方的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：配制A2相：分别量取甲醇和/或超纯水，在容器蓝盖瓶中混匀；称量乙酸铵(LC/MS级)和BHT(LC/MS级)，混合溶解；

步骤二：配制B2相：量取MTBE(HPLC级)和/或甲醇，称量BHT(LC/MS级)至MTBE中，混合溶解；

步骤三：将A2相和B2相同时进行超声处理；

步骤四：将步骤三中脱气后的A2和B2分别按照体积比9:1和1:9配制得到A相和B相，用于高效液相色谱分析测试。

具体的，包括如下步骤：

步骤一：配制A2相：使用量筒分别量取HPLC级别的甲醇和超纯水，在容器蓝盖瓶中混匀；使用万分之一天平称量乙酸铵(LC/MS级)和BHT(LC/MS级)至该容器瓶中，混合溶解；

步骤二：配制B2相：使用量筒量取MTBE(HPLC级)至容器蓝盖瓶中；使用万分之一天平称量BHT(LC/MS级)至该容器瓶中，混合溶解；

步骤三：将A2相和B2相同时放在超声波清洗机中，超声15min；

步骤四：将步骤三中脱气后的A2和B2分别按照体积比9:1和1:9配制得到A相和B相，用于高效液相色谱分析测试。

所述的液相色谱法测定类胡萝卜素的流动相配方在液相色谱中的应用。

所述的流动相配方的梯度洗脱程序：0→10min，A相90％→60％，B相10％→40％；10→20min，A相60％→50％，B相40％→50％；20→25min，A相50％→10％，B相50％→90％；25→29min，A相10％→10％，B相90％→90％；29→29.5min，A相10％→90％，B相90％→10％；29.5→40min，A相90％→90％，B相10％→10％。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明提供的一种液相色谱法测定类胡萝卜素的流动相配方，可以简单，快速(整个过程可在40min之内完成)，准确，并可以得到各组份独立，峰型好，线性关系良好，加标回收率高，相对偏差小的7～10种类胡萝卜素色谱图和测试结果。

附图说明

图1是在高效液相色谱仪测定类胡萝卜素方法中，使用A1和B1配方作为流动相的色谱图。

图2是在高效液相色谱仪测定类胡萝卜素方法中，使用A和B配方作为流动相的色谱图。

1：叶黄素(Lutein)；2：玉米黄素(Zeaxanthin)；3：α-隐黄素(α-Cryptoxanthin)；4：β-隐黄素(β-Cryptoxanthin)；5：ε-胡萝卜素(ε-carotene)；6：α-胡萝卜素(α-carotene)；7：β-胡萝卜素(β-carotene)；8：(6R)-δ-胡萝卜素((6R)-δ-carotene)；9：γ-胡萝卜素(γ-carotene)；10：番茄红素(Lycopene)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

1.试剂和仪器

1.1试剂

标准品：叶黄素(Lutein)、玉米黄素(Zeaxanthin)、α-隐黄素(α-Cryptoxanthin)、β-隐黄素(β-Cryptoxanthin)、α-胡萝卜素(α-carotene)，β-胡萝卜素(β-carotene)、γ-胡萝卜素(γ-carotene)、(6R)-δ-胡萝卜素((6R)-δ-carotene)、ε-胡萝卜素(ε-carotene)、番茄红素(Lycopene)均购自Sigma公司；甲醇，乙醇和叔丁基甲醚(MTBE)为色谱纯试剂；乙酸铵和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)均为质谱级纯试剂；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2仪器

美国DIONEX UltiMate 3000高效液相色谱工作站，配备HPG-3200RS二元梯度泵、TCC-3000RS柱温箱，WPS-3000TFC自动进样器、DAD-3000RS二极管阵列检测器和Chromelein6.8分析软件；CPA224S型万分之一天平，德国Sartorius；SB5200DTS型超声波清洗机，宁波新芝。

1.3标准溶液配制

准确称取适量的叶黄素(Lutein)、玉米黄素(Zeaxanthin)、α-隐黄素(α-Cryptoxanthin)、β-隐黄素(β-Cryptoxanthin)、α-胡萝卜素(α-carotene)、β-胡萝卜素(β-carotene)、γ-胡萝卜素(γ-carotene)、(6R)-δ-胡萝卜素((6R)-δ-carotene)、ε-胡萝卜素(ε-carotene)、番茄红素(Lycopene)固体标准品，分别用乙醇溶解，配制成单个1mg/mL的单标和80μg/mL的混合标准储备液，储存于-20℃下避光保存。分析测试前，再使用50％MTBE-甲醇逐级稀释至20、10、5、2.5、2、1、0.5μg/mL系列混合标准工作溶液。

1.4色谱条件

色谱条件为：YMC Carotenoid C30(250*4.5mm，5μm)色谱柱，流动相为A相和B相，柱温25℃，紫外检测波长450nm，流速1mL/min，进样体积10μL。梯度洗脱程序：0→10min，A相90％→60％，B相10％→40％；10→20min，A相60％→50％，B相40％→50％；20→25min，A相50％→10％，B相50％→90％；25→29min，A相10％→10％，B相90％→90％；29→29.5min，A相10％→90％，B相90％→10％；29.5→40min，A相90％→90％，B相10％→10％。

1.5测定指标

1.5.1线性关系、检出限及定量限

按照1.4色谱条件，使用A和B流动相配方(A相：90％A2相+10％B2相；B相：10％A2相+90％B2相。其中，A2相：97％甲醇-水，含有0.05M乙酸铵和0.1％(W/V)BHT；B2相：100％MTBE，含有0.1％(W/V)BHT)，测定混合标准溶液。实验设3次重复，结果取平均值。以各待测物浓度x(μg/mL)为横坐标，峰面积y为终坐标进行线性回归分析，得到线性回归方程及相关系数。同时，以10种类胡萝卜素特征色谱峰的信噪比(S/N)≥3时为该方法的检出限，S/N≥10时为该方法的定量限，结果如表1所示。结果显示本发明配方在0.5～20μg/mL范围内，10种类胡萝卜素的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数(R²)均大于0.995；检出限和定量限分别为0.01～1.6μg/mL、0.2～4.0μg/mL，说明在液相色谱方法中使用该发明配方确实可行、灵敏度高，可以满足10种类胡萝卜同时测定的要求。

使用A和B配方作为流动相的色谱图，如图2所示。从图2中可以看出，当检测波长为450nm时对标准品分析发现，10种类胡萝卜素的出峰时间为叶黄素(Lutein)＜玉米黄素(Zeaxanthin)＜α-隐黄素(α-Cryptoxanthin)＜β-隐黄素(β-Cryptoxanthin)＜ε-胡萝卜素(ε-carotene)＜α-胡萝卜素(α-carotene)＜β-胡萝卜素(β-carotene)＜(6R)-δ-胡萝卜素((6R)-δ-carotene)＜γ-胡萝卜素(γ-carotene)＜番茄红素(Lycopene)，10种不同组分的保留时间分别约为8.25，9.103，11.41，12.66，13.987，15.41，17.067，23.767，25.653和29.223min。10种样品通过高效液相色谱同时检查可在40min内完成。

表1：10种类胡萝卜素保留时间、线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

1.5.2加标回收率和精密度

取已知浓度的10种类胡萝卜素的单标样品标准液，分别按照低、中、高3个浓度(0.5、3、8μg/mL)三种浓度添加，每个处理样品浓度平行重复测定三次，计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)，结果如表2所示。结果显示，10种类胡萝卜素的平均回收率在96.29～104.47％之间，其相对偏差(RSD)为0.03～1.24％。由此可知，在高效液相色谱仪方法测定类胡萝卜素中，使用该配方作为流动相，无论是回收率还是精密度均能符合检测要求，且具有较好的重复性和较高的准确度。

表2回收率和相对标准偏差

在高效液相色谱仪测定类胡萝卜素方法中，使用A1和B1配方作为流动相的色谱图，结果如图1所示。从图1中可以看出，当检测波长为450nm时对标准品分析发现，10种类胡萝卜素组分出峰时间为叶黄素(Lutein)玉米黄素(Zeaxanthin)＜α-隐黄素(α-Cryptoxanthin)＜β-隐黄素(β-Cryptoxanthin)＜(6R)-δ-胡萝卜素((6R)-δ-carotene)＜γ-胡萝卜素(γ-carotene)＜番茄红素(Lycopene)，只可以测定出7种组分。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。