本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其应用。
背景技术：
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人血浆中的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。人血清白蛋白在氧自由基的作用下，其氨基酸末端结构发生改变，导致其与某些外源性金属钴、铜、镍结合能力减弱的白蛋白，称为缺血修饰白蛋白(ischemia modified albumin，IMA)。近年来，许多研究发现，缺血修饰白蛋白是急性心肌缺血的一种理想的生化标志物。与传统的急性心肌缺血标志物相比，缺血修饰白蛋白(IMA)在缺血发作的短时间内血液中浓度就会升高，而此时心肌细胞的不可逆性损伤还未发生，因此，IMA更具早期诊断价值，能够辅助临床医生尽早明确心肌缺血的诊断，从而进行早期干预和治疗。
IMA的测定方法是采用白蛋白钴结合试验方法，其检测原理是依据IMA较正常白蛋白结合金属钴离子能力降低，在反应系统中加入一定量的钴离子，并通过测定游离钴离子的浓度，推算出IMA的含量。由于该检测结果存在检测结果重复性差，检测结果不稳定的缺点。为了提高检测结果的重复性性和准确性，在检测的过程中加入显色剂与游离钴反应产生颜色，用分光光度计测定其吸光度值大小，从而可以准确的测出血清中IMA的含量。
显色剂与钴离子结合的特异性和灵敏度是提高检测IMA准确性的关键因素。目前常用的显色剂有：二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、噻二唑偶氮二甲氨基苯酚、2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-3,6-二磺酸萘酚、5-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-2,4-二氨基甲苯、2-(1,3,4-三氮唑偶氮)-5-二乙氨基酚、2-(5-乙基噻二唑偶氮)-5-二甲基氨基苯酚和1-亚硝基-2-萘酚等显色剂。
专利文献CN103674938A在2012年9月10日公开了一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂、测定方法及试剂盒，该缺血修饰白蛋白组合测定试剂以二硫苏糖醇作为游离钴离子的显色剂，可以提高检测结果的清晰度。但是，二硫苏糖醇容易受外源性金属离子干扰，而且二硫苏糖醇易被空气氧化，稳定性差，难以保存，不利于该检测试剂的推广和应用。
专利文献CN103558397A在2013年11月4日公开了一种缺血修饰白蛋白检测试剂及检测方法，该检测试剂以噻二唑偶氮二甲氨基苯酚作为游离钴离子的显色剂，噻二唑偶氮二甲氨基苯酚可以有效避免Pd、Ni、Zn和Cu等金属离子的干扰。但是，该检测试剂的动力学曲线不佳，线性范围狭窄，影响了实验的重现性和稳定性。
因此，研究和发开出一种重复性好、检测精密度高和稳定性好的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒是目前亟需解决的难题。
技术实现要素：
为了克服现有技术缺血修饰白蛋白的试剂盒存在测定结果重复性差、检测精密度低和稳定性差的缺点。本发明的目的在于提供一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其应用，以解决上述的问题。
本发明提供了一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括以下组分：
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液90-140mmol/L、氯化钴50-80mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵2-6mol/L和防腐剂0.05-0.2mol/L；
所述试剂R2包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷缓冲液90-140mmol/L、α-吡啶偶氮-β-萘酚20-40mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵2-6mol/L、磷酸氢二钾0.1-0.3mol/L、稳定剂1-5mmol/L和防腐剂0.05-0.2mol/L。
进一步地，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括以下组分：
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液120mmol/L、氯化钴70mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵4mol/L和防腐剂0.08mol/L；
所述试剂R2包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷缓冲液120mmol/L、α-吡啶偶氮-β-萘酚32mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵4mol/L、磷酸氢二钾0.2mol/L、稳定剂3mmol/L和防腐剂0.08mol/L。
进一步地，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值为8.5-9.0。
进一步地，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值为7.5-8.5。
进一步地，所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比(4-6):(1-3)组成。
进一步地，所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比5:2组成。
进一步地，所述防腐剂为proclin300。
进一步地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为6:1。
另外，本发明还提供了一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒在检测缺血修饰白蛋白中的应用。
本发明提供的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒中的十六烷基三甲基氯化铵的分子式为C19H42ClN，CAS号为112-02-7；α-吡啶偶氮-β-萘酚的分子式为C15H11N3O，CAS号为85-85-8；海藻酸钠的CAS号为9005-38-3。
本发明提供的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒的检测原理是：依据缺血修饰白蛋白结合金属钴离子能力减弱的性质进行定量测定。正常对照的血清样品中白蛋白以活性形式存在，加入氯化钴溶液后，钴离子即可与白蛋白N末端结合，溶液中存在的游离钴离子浓度较低；而缺血个体的血清样品中含有较多的缺血修饰白蛋白，加入同样浓度的氯化钴溶液，由于缺血修饰白蛋白与钴离子结合能力降低，溶液中存在较高浓度的游离钴离子，利用试剂中α-吡啶偶氮-β-萘酚与游离钴离子结合产生红色的络合物，缺血修饰白蛋白含量与络合物的颜色程度呈正比，在505nm下检测吸光度，可间接对缺血修饰白蛋白进行定量测定。
本发明提供的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒以α-吡啶偶氮-β-萘酚作为游离钴离子的显色剂。经试验发现，本发明提供的十六烷基三甲基氯化铵可以有效的α-吡啶偶氮-β-萘酚对钴离子的检测敏感度，可以检测到较低浓度的钴离子，从而可以显著地提高检测试剂的准确性和精密度。
进一步地，本发明提供的由海藻酸钠与草酸钠按一定重量比组成的稳定剂可以有效的提高试剂盒检测结果的稳定性和重复性。经试验发现，海藻酸钠可以在钴离子与显色剂形成的络合物表面形成保护膜，防止钴离子与显色剂脱离，造成检测结果不稳定，可以进一步地提高试剂盒检测结果的准确性和稳定性，是一种较为理想的缺血修饰白蛋白的检测试剂。
总之，与现有技术相比，本发明提供的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒检测结果精密度高、重复性好，抗干扰能力强，而且其还具有稳定性好，价格便宜，易于保存的优点，是一种较为理想的缺血修饰白蛋白的检测试剂盒，有利于该快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒的临床应用。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
实施例1、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒
所述快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒包括体积比为6:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分组成：pH值为8.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液90mmol/L、氯化钴50mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵2mol/L和proclin3000.05mol/L。
试剂R1的制备方法为：将氯化钴、十六烷基三甲基氯化铵和proclin300加入pH值为8.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中搅拌均匀，即得。
所述试剂R2由以下组分组成：pH值为7.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液90mmol/L、α-吡啶偶氮-β-萘酚20mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵2mol/L、磷酸氢二钾0.1mol/L、稳定剂2mmol/L和proclin3000.05mol/L；所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比4:3组成。
试剂R2的制备方法为：将α-吡啶偶氮-β-萘酚、十六烷基三甲基氯化铵、磷酸氢二钾、稳定剂和proclin300加入pH值为7.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中搅拌均匀，即得，所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比4:3组成。
实施例2、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒
所述快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒包括体积比为6:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分组成：pH值为8.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液120mmol/L、氯化钴70mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵4mol/L和proclin3000.08mol/L。
试剂R1的制备方法与实施例1类似。
所述试剂R2由以下组分组成：pH值为8.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液120mmol/L、α-吡啶偶氮-β-萘酚32mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵4mol/L、磷酸氢二钾0.2mol/L、稳定剂3mmol/L和proclin3000.08mol/L；所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比5:2组成。
试剂R2的制备方法与实施例1类似。
实施例3、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒
所述快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒包括体积比为6:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分组成：pH值为9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液140mmol/L、氯化钴80mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵6mol/L和proclin3000.1mol/L。
试剂R1的制备方法与实施例1类似。
所述试剂R2由以下组分组成：pH值为8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液140mmol/L、α-吡啶偶氮-β-萘酚40mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵6mol/L、磷酸氢二钾0.3mol/L、稳定剂5mmol/L和proclin3000.1mol/L；所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比6:1组成。
试剂R2的制备方法与实施例1类似。
对比例1、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒
所述快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒包括体积比为6:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分组成：pH值为8.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液120mmol/L、氯化钴70mmol/L、吐温804mol/L和proclin3000.08mol/L。
试剂R1的制备方法与实施例1类似。
所述试剂R2由以下组分组成：pH值为8.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液120mmol/L、α-吡啶偶氮-β-萘酚32mmol/L、吐温804mol/L、磷酸氢二钾0.2mol/L、稳定剂3mmol/L和proclin3000.08mol/L；所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比5:2组成。
试剂R2的制备方法与实施例1类似。
与实施例2的区别在于，将十六烷基三甲基氯化铵替换为吐温80。
对比例2、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒
所述快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒包括体积比为6:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分组成：pH值为8.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液120mmol/L、氯化钴70mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵4mol/L和proclin3000.08mol/L。
试剂R1的制备方法与实施例1类似。
所述试剂R2由以下组分组成：pH值为8.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液120mmol/L、α-吡啶偶氮-β-萘酚32mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵4mol/L、磷酸氢二钾0.2mol/L、草酸钠3mmol/L和proclin3000.08mol/L。
试剂R2的制备方法与实施例1类似。
与实施例2的区别在于，所述稳定剂为草酸钠。
对比例3、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒
所述快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒包括体积比为6:1的试剂R1和试剂R2，
所述试剂R1由以下组分组成：pH值为8.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液120mmol/L、氯化钴70mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵4mol/L和proclin3000.08mol/L。
试剂R1的制备方法与实施例1类似。
所述试剂R2由以下组分组成：pH值为8.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液120mmol/L、α-吡啶偶氮-β-萘酚32mmol/L、十六烷基三甲基氯化铵4mol/L、磷酸氢二钾0.2mol/L、稳定剂3mmol/L和proclin3000.08mol/L；所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比1:1组成。
试剂R2的制备方法与实施例1类似。
与实施例2的区别在于，所述稳定剂由海藻酸钠和草酸钠按重量比1:1组成。
试验例一、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒的精密度试验
1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制备得到的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒；高、低浓度值的缺血修饰白蛋白标准品，购于sigma公司。
2、试验方法：
2.1、批内精密度检测：将高、低浓度值分别为81.0和62.0U/mL的缺血修饰白蛋白标准品分别分装成20份，采用实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制备得到的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒连续检测高、低浓度值的缺血修饰白蛋白标准品20次，计算批内变异系数。
2.2、批间精密度检测：将高、低浓度值分别为81.0和62.0U/mL的缺血修饰白蛋白标准品分别分装成10份，放于-20℃冰箱保存，采用实施例1、实施例2、实施例3和对比例1制备得到的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒每天检测高、低浓度值的缺血修饰白蛋白标准品1次，连续检测10天，计算批间变异系数。
3、试验结果：
试验结果如表1和表2所示。
表1 快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒的批内变异系数(n＝20)
表2 快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒的批间变异系数(n＝10)
由表1和表2可知，本发明提供的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒检测的批内和批间的变异系数小于5％，说明本发明提供的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒具有较高的精密度和重复性。
试验例二、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒的稳定性试验
1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3、对比例2和对比例3制备的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒；混合血清样品，购于北京雅安达生物技术有限公司。
2、试验方法：采用全自动生化分析仪以两点终点法进行测定，采用实施例1、实施例2、实施例3、对比例2和对比例3制备的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒连续测定混合血清样品50次，计算出吸光度的均值，标准差，再将混合血清样品分装于-18℃冷藏，将试剂盒放置于4℃冰箱，然后每天连续测定同一混合血清样品，计算其差异，以为标准判断是否失效，连续观察10天。
3、试验结果
首次测定50次的混合血清样品的吸光度均值为0.658，标准差为0.028，10天内的吸光度值为表3所示。
表3 混合血清样品的吸光度值
由表3可知，本发明实施例1-3制备的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒检测混合血清样品的吸光度值在10天没有超出吸光度均值为0.658，标准差为0.028的范围，而对比例2-3制备的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒检测混合血清样品的吸光度值在10天超出了吸光度均值为0.658，标准差为0.028的范围，说明本发明的缺血修饰白蛋白检测具有很好的稳定性。
试验例三、一种快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒的抗干扰性试验
1、试验材料：实施例2制备的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒；混合血清样品，购于北京雅安达生物技术有限公司。
2、试验方法：将混合血清样品分成6等份，然后将每等份分成10等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表4的要求，然后分别测定血清中IMA的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表4其中：相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100％。
3、试验结果：
试验结果如表4所示。
表4 快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒的抗干扰性试验数据
由表4可知，本发明实施例2制备的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒在总胆红素小于560μmol/L，维生素C含量小于0.45g/L，乳酸含量小于4.5mmol/L，血红蛋白含量小于4.5g/L，甘油三酯含量小于8mmol/L时对测试结果没有明显干扰。说明本发明提供的快速检测缺血修饰白蛋白的试剂盒具有较强的抗干扰能力。